Particle and Fibre Toxicology, 2005; 2: 11-11 (más artículos en esta revista)

Nanopartículas de carbono negro tipo II inducir a las células epiteliales chemotaxins liberación de los macrófagos alveolares

BioMed Central
Peter G Barlow (peter.barlow @ ed.ac.uk) [1], Anna Clouter-Baker (v.stone @ napier.ac.uk) [2], Ken Donaldson (ken.donaldson @ ed.ac.uk) [3], Janis MacCallum (j.maccallum @ napier.ac.uk) [2], Vicki Stone (v.stone @ napier.ac.uk) [2]
[1] MRC / Universidad de Edimburgo Centro de Investigación Inflamación, Queen's Medical Research Institute, 47 Little Francia Crescent, Edinburgh EH16 4TJ, UK
[2] Grupo de Investigación en Biomedicina, Universidad Napier, 10 Colinton Road, Edinburgh EH10 5DT, UK
[3] ELEGI / Colt Laboratories, MRC / Universidad de Edimburgo Centro de Investigación Inflamación, Queen's Medical Research Institute, 47 Little Francia Crescent, Edinburgh EH16 4TJ, UK

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Resumen
Antecedentes

Macrófagos alveolares son una de las claves de células en el tratamiento de las partículas depositadas en los pulmones y en la determinación de la respuesta posterior a que la exposición a partículas. Las nanopartículas son considerados una amenaza potencial para los pulmones y el mecanismo de respuesta a las nanopartículas pulmonar es actualmente objeto de un intenso escrutinio. El tipo de células del epitelio alveolar II ha sido demostrado que la liberación chemoattractants que pueden contratar los macrófagos alveolares a los lugares de deposición de partículas. El objetivo de este estudio era evaluar las respuestas del tipo II de una línea de células epiteliales (L-2) a la vez fina y nanopartículas de exposición en términos de la secreción de quimiotaxis sustancias capaces de inducir la migración de macrófagos.

Resultados

La exposición de las células de tipo II para las nanopartículas de carbono negro de ellos hubo una importante liberación de los macrófagos chemoattractant en comparación con el control negativo y para otros polvos probado (multa de carbono negro y TiO 2 y nanopartículas TiO 2), medida por la migración de macrófagos hacia el tipo II de células medio condicionado. SDS-PAGE análisis de las partículas de medio condicionado de células de tipo II tratados reveló que un mayor número de bandas de proteínas presentes en el medio condicionado obtenido de las células de tipo II tratados con nanopartículas de carbono negro en comparación con otros polvos probado. Tamaño de fraccionamiento de la chemotaxin ricos sobrenadante determinó que la chemoattractants liberados de las células epiteliales son entre 5 y 30 kDa de tamaño.

Conclusión

La naturaleza altamente tóxicos y reactivos química de la superficie de carbono negro nanopartículas muy probablemente ha inducido la línea celular del tipo II a favor de la liberación de mediadores inflamatorios que potencialmente pueden inducir la migración de macrófagos. Esto podría ayudar en el rápido reclutamiento de células inflamatorias a los sitios de deposición de partículas y la posterior eliminación de las partículas por el ataque de las células fagocíticas, tales como los macrófagos y neutrófilos. Los estudios futuros en este ámbito puede centrarse en la identidad exacta de la sustancia (s), publicado por el tipo II de las células en respuesta a la exposición de partículas.

Antecedentes

La exposición a la combustión de derivados nanoparticulate componente de la materia particulada (PM) ha sido implicado en los efectos adversos de la toxicología [1 - 3] y la epidemiología [4 - 9] estudios. Las nanopartículas tienen por lo menos una dimensión de menos de 100 nm, similar a las partículas ultrafinas, que tienen un diámetro de menos de 100 nm. Nanopartículas se han comunicado para mostrar un aumento de la toxicidad en comparación con una multa equivalente en masa de las partículas del mismo material cuando se inhala en el pulmón de rata [10]. Esto se ha atribuido al estrés oxidativo que emanan de la mayor superficie de las nanopartículas [11 - 13] y su potencial para interactuar con otros componentes de la PM, como metales de transición [12].

Los macrófagos son la principal defensa contra la inhalación de partículas en el espacio aéreo de superficies. Después de la deposición de partículas, macrófagos phagocytose partículas y el transporte fuera de los pulmones a través de la escalera mecánica mucociliar (MCE). Es como hipótesis que el tipo II de las células epiteliales en el espacio alveolar desempeñar un importante papel en la modulación de procesos inflamatorios en el pulmón. Los estudios han demostrado que el tipo de células del epitelio alveolar II puede liberar citoquinas inflamatorias, como rantes [14], los monocitos chemoattractant proteína-1 (MCP-1) [14], interleuklin-8 (IL-8) [16], factor de necrosis tumoral alfa (TNF α) [15] y el complemento de proteínas C5a [17], que pueden contratar los leucocitos a los sitios de la inflamación, actuando como chemoattractants [16, 17].

Driscoll et al. [18] demostraron que α-cuarzo puede inducir un aumento del MIP-2 mRNA en las células tipo II, lo que podría contribuir a la acumulación de neutrófilos en cuarzo visto expuestos los pulmones. Driscoll et al. [15], también ha demostrado que el TNF α, producido por macrófagos expuestos a partículas, pueden inducir a las células tipo II liberación quimiocinas como MIP-2. Jiménez et al. [19], mostró el mismo efecto en los macrófagos expuestos a la PM 10. Barrett et al. [20] informó de que la producción de MIP-2 y MCP-1 por un murino tipo II línea celular de sílice siguiente exposición fue mediada por el TNF α, que, junto con la exposición de sílice, también podría inducir la producción de ROS por el tipo II Células. Becher et al., [21] también demostraron que la liberación de las células tipo II, IL-6, TNF α y MIP-2 difiere en función del tipo de piedra de partículas que las células fueron expuestas a.

O'Brien et al. [14] mostraron que los macrófagos emigraron hacia medio condicionado obtenido de las células de tipo II tratados con IL-1 α. Quimiocinas en el medio condicionado como rantes, MCP-1 y la colonia de granulocitos Monocyte Estimular Factor (GM-CSF) fueron los agentes responsables de la quimiotaxis. Estimulación de las células tipo II con la bradicinina también ha demostrado inducir la producción de proteínas que son quimiotaxis de neutrófilos y monocitos [22]. Paine III et al. [23], observó el aumento de la producción de MCP-1 por las células tipo II estimulado con IL-1 y TNF α. Anteriormente hemos demostrado que las nanopartículas de carbono negro puede activar suero para producir los factores que inducen la migración de macrófagos [24].

Este manuscrito describe un estudio en el que dos líneas celulares se utilizan como un modelo para examinar los efectos de la multa y de las dos formas de nanopartículas de carbono y dióxido de titanio negro en el potencial de las células tipo II de generar sustancias que inducen la migración de macrófagos. Tenemos como hipótesis que la exposición de una línea celular del tipo II a la multa y las nanopartículas resultados en la liberación de proteínas de la quimiotaxis de tipo II las células. Además hypothesise que, en el pulmón de mamíferos, estas proteínas pueden desempeñar un papel importante en la contratación de los macrófagos hacia los sitios de deposición de partículas y de la inflamación.

Resultados
Lactato deshidrogenasa (LDH) liberación de L-2 células después del tratamiento con multa y negro nanopartículas de carbono y dióxido de titanio

Las figuras 1 (a] y 1 (b] muestran que la LDH liberación de la L-2 células aumento dosis dependiente en una forma de trato a todas las partículas con tipos más altos hasta la liberación inducida por nanopartículas TiO 2 y negro de humo se llegó a una concentración de partículas De 1 mg / ml. Máxima liberación de LDH después del tratamiento con multa TiO 2 y negro de humo producido en una concentración de partículas de 2 mg / ml. El 1 mg / ml tratamientos de nanopartículas de carbono negro y TiO 2 indujo un aumento significativo de la LDH liberación de las células L-2 en comparación con el control negativo (p <0,05). Nanopartículas de carbono negro también dio lugar a un aumento significativo de la liberación de LDH (p <0,05) en una concentración de partículas de 2 mg / ml. Las dosis altas de ambos tipos de partículas finas, también se observaron aumentos similares para inducir la liberación de LDH, pero esto no fue estadísticamente significativa. Sin embargo, la máxima LDH liberación inducida por partículas de los tratamientos se observó a ser inferior a la observada tras la lisis celular con Triton X-100 (control positivo), posiblemente debido a las altas concentraciones de partículas de interferir en el ensayo. El control negativo en estos experimentos (células sin tratamiento) mostraron mínima LDH liberación. Dosis bajas de partículas (31-500 μ g) no parece mostrar ningún tamaño, la composición o la superficie relacionadas con diferencias en la respuesta.

Concentración y tiempo curso estudios con zymosan activado suero (ZAS) y macrófagos J774.2

Figura 2 (a] muestra los efectos de diferentes concentraciones de ZAS en la migración de macrófagos después de un período de incubación de 6 horas. El gráfico muestra que la absorbancia aumenta a medida que la concentración de ZAS aumenta del 2 al 20% indica que tiene un mayor número de macrófagos o emigran a través de los filtros de policarbonato. Un aumento significativo de la migración de macrófagos se observaron tanto en el 10% y el 20% de diluciones ZAS. Esto se comparó con el control negativo de suero fetal bovino (SFB) incubadas con solución salina estéril, que no mostró aumentos significativos en la migración de macrófagos.

Figura 2 (b] muestra un tiempo de estudio de la migración de macrófagos hacia el 10% ZAS. Los resultados indican que la ZAS inducido aumentos significativos (p <0,001) en la migración de macrófagos, tanto en las 3 horas y 6 horas de tiempo de puntos. El nivel más alto de la migración de macrófagos fue encontrado a las 6 horas de punto en el que la migración resultó ser 8 veces mayor que la del control negativo. El control negativo (FBS incubadas con solución salina estéril) no presenta ninguna posibilidad de la migración de macrófagos y esto puede servir como un indicador de que la migración de macrófagos al azar, chemokinesis, fue mínimo.

La migración de macrófagos estimulados por medio condicionado de la L-2 Las células expuestas a TNF α

L-2 células fueron expuestas a TNF α, a fin de inducir la secreción de quimiotaxis moléculas (Figura 3]. Sobrenadantes de las células tratadas con TNF α en una concentración de 1 ng / ml, la migración de macrófagos inducida significativa (p <0,05) en comparación con el control negativo (medio condicionado obtenido de células no tratadas). La migración de macrófagos también se observó tanto en la parte inferior y superior del TNF α concentraciones aunque esto no fue significativo. El otro control negativo, TNF α solos, en concentraciones comparables a los utilizados para los tratamientos de células, la migración de macrófagos inducida por modestos.

La migración de macrófagos estimulados por medio condicionado de la L-2 Las células expuestas a la multa y nanopartículas de carbono negro y TiO 2

En comparación con el control negativo (medio condicionado obtenido de células no tratadas), nanopartículas de carbono negro tratamiento de la L-2 células generado un medio condicionado, que indujeron a un aumento significativo (p <0,01) en la migración de macrófagos (Figura 4]. En comparación, el medio condicionado de células de L-2 tratados con multa TiO 2, CB y nanopartículas TiO 2 no inducir incrementos significativos en la migración de macrófagos. Asimismo, cabe señalar que ambos multa y nanopartículas de carbono negro tratamiento de la L-2 células inducir un aumento significativo de la migración de macrófagos en comparación con otro control negativo; medio incubaron con las partículas por sí sola (p <0,01 y p <0,001 de multa Nanopartículas de carbono y negro respectivamente).

Electroforesis SDS-PAGE de medio condicionado de células de L-2 tratados con un sub-dosis tóxica de nanopartículas de carbono negro

A la no reducción de SDS-PAGE gel se utiliza para separar los componentes de la proteína medio condicionado procedente de la L-2 células tratadas durante 24 horas, ya sea con multa o nanopartículas de carbono negro (125 μ g / ml). También se incubaron las células con medio libre de suero durante 24 horas y este medio condicionado se ha ejecutado junto con los otros dos tratamientos como un control negativo. Como puede verse en el gel (Figura 5 bis], sólo el correspondiente a las bandas de proteína muy elevados pesos moleculares son identificables en todos los tratamientos utilizados.

Figuras 5b muestra medio condicionado obtenido de los tratamientos de partículas similares aplicadas en el marco de la reducción de las condiciones. Como puede verse en el gel, un aumento en el número y la densidad de las bandas de proteínas se observan en el carril que contiene el medio condicionado obtenido de las células que han sido tratados con nanopartículas de carbono negro. Bandas se observó claramente en torno a los 14 kDa de peso y la densidad de esta banda es el aumento en el carril que contiene el medio condicionado de la nanopartícula células tratadas. El control negativo en ambos geles, medio condicionado obtenido de las células no tratadas, mostró un mínimo de proteínas de bandas sólo en la reducción de las condiciones.

Quimiotácticos actividad de las fracciones de tamaño medio condicionado procedente de la L-2 células tratadas con un sub-dosis tóxica de nanopartículas de carbono negro

El medio condicionado generada por nanopartículas de carbono negro tratamiento (125 μ g / ml), de L-2-tamaño de las células fue fraccionado por centrifugación a través de filtros de tamaño selectivo. Se encontró que la fracción de tamaño de 5-10 kDa y 10-30 kDa inducida por tanto un aumento significativo de la migración de macrófagos (p <0,01) en comparación con el control negativo (medio condicionado obtenido de células no tratadas). Las otras dos fracciones de 0-5 y> 30 kDa no indujo un aumento significativo de la migración de macrófagos (figura 6].

Discusión

Combustión derivados de las nanopartículas han estado implicados en los efectos nocivos de la contaminación del aire ambiente de partículas (revisado en [1]] Además, los efectos toxicológicos de las nanopartículas ha ido creciendo debido a la aparición de una disciplina relativamente nueva tecnológica; nanotoxicology. Los estudios han demostrado que las nanopartículas pueden ser más tóxico que el equivalente en masa de las partículas finas dosis compuesto por el mismo material [10, 11, 25, 26] El aumento de la toxicidad de las nanopartículas puede atribuirse a varios factores que dependen de las nanopartículas que se examina, Pero de baja toxicidad, baja solubilidad partículas tales como los utilizados en el presente estudio. La mayor superficie de las partículas resultantes y el estrés oxidativo parece ser la dominante propiedad [1, 27]. En este estudio, los efectos de partículas en los tratamientos de tipo II las células y su potencial para inducir la migración de macrófagos se investiga.

Cuando el tratamiento de L-2 células con las partículas utilizadas en este estudio, la concentración de LDH detectados en el medio condicionado en un aumento de la dosis dependiente. LDH liberación máxima se detectó en dosis de 1-2 mg / ml de todas las partículas de prueba. Estas dosis altas nunca podría conseguirse en los pulmones plausible bajo condiciones de exposición, pero han sido utilizados en el estudio de la exhaustividad. Las nanopartículas demostró una tendencia no significativa de mayor toxicidad para las células en comparación con las partículas finas. Esto fue indicado por un aumento significativo en las concentraciones de LDH después del tratamiento con los dos tipos de nanopartículas. Aunque estos resultados pueden proporcionar una representación exacta de la medición de partículas de la citotoxicidad por las concentraciones de LDH, es posible que la LDH pueden haber sido absorbidos en la superficie de las partículas después de la liberación de las células. Desai y Richards [28] y Jones et al., [29] de ambos observó cómo los diferentes tipos de moléculas biológicas podría ser adsorbido en la superficie de los polvos inorgánicos y minerales. Brown et al., [30] también mostró una amplia unión de la albúmina de suero bovina (BSA) a la superficie de las nanopartículas de carbono negro. Esto puede ocurrir cuando la medición de las concentraciones de LDH, sobre todo si se tiene en cuenta la gran superficie de las nanopartículas y las posibilidades de adsorción de proteínas.

Zymosan activado suero se ha utilizado como un agente estimulante para inducir quimiotaxis de macrófagos en numerosos estudios con partículas [31 - 33]. Zymosan A es un polisacárido extraído de las paredes de células de levadura cuando se añade a suero, se activa el sistema de complemento de la generación de grandes cantidades de los macrófagos chemoattractant C5a En este estudio, los macrófagos J774 emigraron hacia ZAS en forma dosis-dependiente de manera significativa con el aumento de la migración de macrófagos que se ZAS observado en concentraciones de 10% y 20% (p <0,001). Por lo tanto, se decidió, sobre la base de una revisión de la bibliografía pertinente y de estos resultados, que el 10% ZAS sería una concentración adecuada para uso como control positivo, en el futuro, los estudios que utilizan la cámara de quimiotaxis.

Macrófagos quimiotaxis Otros estudios han permitido sistemáticamente al menos 3 horas de incubación de tiempo para que los macrófagos para completar el cambio y la forma de migración [31 - 34]. Si bien 3 horas de incubación apareció para permitir un nivel significativo de la migración de macrófagos a tener lugar, nuestros resultados indican que el 6 horas daría más oportunidad para que los macrófagos de emigrar a través del filtro. Esta decisión se tomó en consideración el hecho de que en el futuro los estudios de la migración sería la prueba de un medio condicionado muy diluidas y, por lo tanto, respuestas de los macrófagos puede ser más lento que los que se observan con Zymosan activado suero.

Antes de la realización de tratamientos de partículas en las células L-2, un experimento preliminar se llevó a cabo para determinar si la estimulación de una de citoquinas pro-inflamatorias, como el TNF α podría inducir a las células del tipo II para liberar macrófagos chemoattractants. Un aumento significativo de la migración de macrófagos se observó cuando el L-2 células fueron tratadas con TNF α en una concentración de 1 ng / ml durante 6 horas. Una respuesta similar macrófagos no se observó en las células, es decir, libre sobrenadantes TNF α equivalente en concentraciones que se han incubaron durante 6 horas en la celda sin los pozos. Aunque el aumento de las migraciones se observó en las concentraciones de TNF α de 0,1 y 10 ng / ml, esto no fue estadísticamente significativo. El 10 ng / ml de TNF α concentración en que cabe esperar que inducir un aumento dosis-dependiente en la migración, pero es posible que el TNF α concentración podría acercarse a niveles tóxicos, y que esto puede tener en realidad inhiben la migración. Los resultados de este experimento indican que la L-2 células son capaces de liberar los macrófagos chemoattractants siguientes estímulos pro-inflamatorios. El hecho de que semejante aumento de la migración de macrófagos no se observaron con el TNF α por sí solo indica que el TNF α residual en el medio no pudo explicar la quimiotaxis y la respuesta que chemoattractants liberados por la L-2 en las células de medio condicionado fueron los responsables. Estos resultados se correlacionan bien con las publicadas por Standiford et al. [35], Paine III et al., [23] y de O'Brien et al. [14], quien informó de que el TNF α es capaz de inducir la secreción de chemoattractants de Tipo II de las células epiteliales. Los estudios también han demostrado que la IL-9 también induce la liberación de chemoattractants de células epiteliales bronquiales [36]. Sin embargo, hemos elegido como el TNF α estimulante ya que se ha demostrado que el estar presentes en el fluido de partículas BAL los animales tratados, en muchos estudios in vivo [21, 37, 38], así como de ser liberado por las células in vitro después de tratamiento de partículas [19 , 39].

Los resultados obtenidos de los experimentos indica que LDH 125 ug / ml de partículas actuarían como un buen sub-dosis tóxica para proseguir la investigación. L-2 en células que fueron tratados con dosis de cuatro tipos diferentes de las partículas durante 24 horas y el medio condicionado que se generó fue la prueba del potencial para inducir la migración de macrófagos. Las nanopartículas de carbono negro tratamiento de la L-2 células generado un medio condicionado, que indujeron a un aumento significativo de la migración de macrófagos en comparación con el control negativo, mientras que ninguna de las otras partículas de los tratamientos tuvo un efecto significativo en la migración de macrófagos. Esto indicaría que las nanopartículas de carbono negro, así como los que causan el aumento de la citotoxicidad a altas dosis, son capaces de estimular la liberación de los macrófagos chemoattractants cuando son expuestos a la L-2 en las células sub-dosis tóxicas. Cell-libre tratamientos fueron también objeto de determinar si las sustancias solubles en cualquier presente en la superficie de las partículas tenía el potencial de inducir directamente la migración de macrófagos, pero no se estimuló la migración. Este tuvo en cuenta los estudios realizados por Milanowski et al. [34] mostraron que los macrófagos hacia la quimiotaxis de bacterias y hongos con productos extraídos de las muestras de polvo orgánico. De hecho, la migración hacia los medios de comunicación tratados con partículas se observó a ser ligeramente inferior (aunque no significativamente menor) que la de control. Esto puede sugerir que las partículas pueden obligar o inactivar factores en los medios de comunicación que estimulan la migración de células que liberan o de que los factores que inhiben la migración.

Dos nanopartículas se utilizan en estos estudios, TiO 2 y negro de humo, pero sólo el negro de humo mostró ningún efecto en la estimulación de la liberación de chemotaxins. Esto está de acuerdo con resultados anteriores que multa TiO 2 es menos inflammogenic de un grupo de cuatro tipos de nanopartículas, incluyendo nanopartículas de carbono negro, y había menos actividad de los radicales libres de superficie, medida en un plásmido de ADN escindido de ensayo [40]. Aunque ambos están clasificados como de baja toxicidad baja solubilidad partículas, nanopartículas de carbono negro tiene una superficie mucho mayor que nanopartículas TiO 2 y esto puede ser un factor importante en la generación de radicales libres in vivo [41].

A raíz de los experimentos utilizando cuatro diferentes tipos de partículas, se decidió que los experimentos deberían centrarse aún más a los efectos de las nanopartículas de carbono negro sobre la L-2 células y el esclarecimiento de los productos que fueron liberados de las células tipo II, como consecuencia de las partículas Exposición. SDS-PAGE de geles medio condicionado procedente de la L-2 células tratadas con 125 μ g de cualquiera de multa o nanopartículas de carbono negro eran ejecutados en la no reducción y la reducción de las condiciones. En la no reducción de las condiciones, las bandas no son visibles por debajo de los 45 kDa de peso molecular. Sin embargo, con la incorporación de la reducción de la agente de la TDT, un número mayor de bandas de la proteína se observó en las nanopartículas de carbono negro medio condicionado en comparación con la media obtenida de la multa negro de humo y las células no tratadas. Esto indica que un mayor número y concentración de proteínas fueron liberados de las células tipo II en el medio condicionado como resultado de las nanopartículas de carbono negro exposición. Una o más de estas proteínas puede explicar el aumento de la actividad en la quimiotaxis de macrófagos medio condicionado procedente de tales células. El aumento de las bandas estaban presentes en el rango de peso molecular de aproximadamente 14 - 35 kDa. Un experimento posterior, donde el medio condicionado fue centrifugada peso molecular a través de los filtros y, a continuación, realizarán las pruebas de quimiotaxis actividad indicó que la sustancia (s) de la migración de macrófagos inducida que se encuentra en el 5 - 30 kDa rango de peso. Esto se basa en la observación de que la 5-10 y 10-30 kDa kDa fracciones del medio condicionado inducido un aumento significativo de la migración de macrófagos en comparación con el control negativo. Una serie de quimiotaxis proteínas como MCP-1, MIP-1, MIP-2 y rantes se sabe que se encuentra dentro de estos rangos de tamaño [42].

Hay puntos importantes a tomar nota de la hora de las comparaciones entre los estudios in vitro y de la dosimetría de la exposición a partículas ambientales en las personas. Obviamente, la exposición a un determinado partículas puede variar en función de la ocupación de una persona, lugar, método de transporte, etc comportamiento Utilizando un grupo de mineros como modelo, sin embargo, Kuempel et al. [43] estima que un minero del carbón se inhalan> ; 350 g de polvo de carbón durante toda su vida, y que alrededor de 40 g de la presente serán depositados en la región alveolar de los pulmones. Esta cifra no es aplicable a la mayoría de la gente, pero llama la atención sobre el potencial de exposición a partículas que se puede producir en una determinada ocupación o lugar de trabajo. Se trata de una exposición crónica frente a la exposición aguda utilizado en nuestro estudio, pero no obstante es importante. Alteración de la limpieza y de la exposición prolongada a partículas de las células epiteliales son factores clave cuando se trata de identificar las razones detrás del aumento de la toxicidad inducida por nanopartículas. Aunque algunas de las dosis utilizadas en este estudio puede no ser fisiológicamente relevantes, que pueden proporcionar una idea de cómo las células tipo II puede reaccionar en respuesta a la aguda y, en función de la eficacia de limpieza, sub-exposición crónica a las partículas.

El fenómeno de la sobrecarga de pulmón de rata en respuesta a la alta exposición a baja toxicidad baja solubilidad partículas incluye, entre otras importantes secuelas patológicas, la falta de limpieza, con la consiguiente retención de las partículas [44]. En las condiciones de sobrecarga es mucho mayor contacto entre las partículas y el epitelio, debido a la alta tasa de deposición de partículas, superior a la de la capacidad de los macrófagos phagocytose a ellos [45]. Está impulsado por la sobrecarga de superficie [46] y así las conclusiones descritas a proporcionar un mecanismo que puede ayudar a explicar la retención de partículas cargadas macrófagos en la periferia del pulmón durante la sobrecarga. Mediante este mecanismo, la amplia interacción entre partículas y superficies de las células epiteliales característicos de la sobrecarga podría causar la liberación de chemotaxins que 'atraer' las partículas cargadas macrófagos alveolares a la región. Este gradiente que competir directamente con la quimiotaxis gradiente normal que se basaría tal macrófagos de las vías respiratorias para el aclaramiento muco-ciliar. Renwick et al. [26] demostró que el mismo tipo de nanopartículas utilizadas en este estudio, inducida por un aumento en el potencial de los macrófagos a migrar hacia una positiva chemoattractant, ZAS. En este manscript hemos demostrado que estas partículas también poseen la capacidad de inducir a las células epiteliales de tipo II para liberar niveles elevados de macrófagos chemoattractants. El chemoattractants puede estimular dos acontecimientos: el primero es la migración de macrófagos hacia las células epiteliales expuestas a partículas, como en el caso de la exposición a la célula epitelial nanopartículas de carbono negro. Este evento se reclutan las células y promover la inflamación, pero pueden disminuir potencialmente posterior limpieza de la señal si no remiten. En el segundo, la quimiotaxis gradiente puede estimular la eliminación de las células fagocíticas de los pulmones a través de la escalera mecánica mucociliar, la promoción de la limpieza de partículas. Los datos muestran aquí demuestra que nanopartículas de carbono negro fue el más potente en la obtención de la prueba chemotaxin liberación. Esto puede sugerir que esas nanopartículas podría invertir la quimiotaxis gradiente normal y de limpieza para evitar la sobrecarga en una menor masa de la carga de las partículas más grandes y esto es, de hecho, ampliamente apoyada por los datos (revisado en [47]]. Estas son interpretaciones de los efectos de partículas y requieren de más trabajo para determinar con precisión las vías que rigen la remoción de partículas.

Conclusión

La regulación y el fomento de la contratación de leucocitos en el pulmón es un factor importante en la regulación de la inflamación y existen varios mecanismos de regulación. La respuesta de los macrófagos a paracrina señales parece ser un impulsor importante de la inflamación y macrófagos responder a las señales de quimiotaxis de neutrófilos [31], las células tipo II [14] y de otros macrófagos [48]. Otros estudios se han centrado en la inhibición de la quimiotaxis de macrófagos inducida por moléculas como el factor inhibitorio de migración de macrófagos (MIF), descrito por Hermanowski-Vosatka et al., [49] que impide el movimiento de macrófagos. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, varios estudios han demostrado que las células de tipo II pueden secretar una amplia gama de mediadores pro-inflamatorios capaces de inducir la migración de macrófagos a los sitios de inflamación. Es probable que, debido a la gran superficie de las nanopartículas de carbono negro, y de su posterior capacidad de inducir estrés oxidativo [11], es la señalización de la expresión de genes de la chemotaxins por las células tipo II. Esto puede indicar una respuesta adaptativa de pulmón de células epiteliales en contacto con las partículas que se depositan en la rápida ayuda de reclutamiento de células inflamatorias a los sitios de deposición de partículas, y la posterior eliminación de las partículas por el ataque de las células fagocíticas, tales como los macrófagos y neutrófilos.

Evidente futuros estudios en este ámbito podría perseguir la identidad de la sustancia (s), publicado por el tipo II de las células en respuesta a la exposición de partículas. Este estudio indica que los factores que inducen la migración de macrófagos están en el rango de peso molecular entre 5 y 30 kDa. Sin embargo, debido a la gran variedad de sustancias liberadas por las células tipo II, es probable que ni uno solo de sustancia es responsable de inducir a los macrófagos en la contratación y, como tal, además de experimentos en este ámbito pueden implicar a descifrar las complejas mezclas de moléculas liberadas quimiotaxis Por las células tipo II, para conocer sus objetivos específicos celulares. Sinérgico o potentiative interacciones entre las moléculas de quimiotaxis También hay que tener en cuenta. Otras investigaciones pueden tratar de examinar los efectos de otras formas de las partículas, así como diversos componentes de partículas en la contaminación del aire.

Materiales y métodos
Productos químicos y reactivos

L-Glutamina (200 mM), penicilina-estreptomicina (1000 μ g / ml) y suero fetal bovino (SFB) fueron obtenidos de Invitrogen, Reino Unido. RPMI 1640 (sin L-glutamina), Zymosan A y albúmina de suero bovina (BSA) se obtuvieron de Sigma productos químicos Company, Dorset, Reino Unido. El Rapi Diff 2 (Romanowsky) mancha conjunto se obtuvo de un Raymond Cordero, de Londres. Todos los demás productos químicos y reactivos fueron adquiridos de Sigma productos químicos Company, Dorset, Reino Unido, salvo indicación en contrario.

Cultura de la L-2 del tipo II la línea de células epiteliales

La rata de células alveolares tipo II, la línea L-2 se obtuvo de la Colección de Animal Cell Cultures (Salisbury, Inglaterra). Las células fueron cultivadas en 25 cm 2 en frascos de cultivo de tejidos RPMI 1640 suplementado con 1% L-glutamina, un 1% penicilina / estreptomicina y 10% de SFB inactivado por calor. Culturas fueron incubadas humidificado en una incubadora a 37 ° C / 5% CO 2. Células se realizaron con el 0,3% azul de tripan exclusión (1:1 dilución con células) y una mejor haemocytometer Neubauer. Las células fueron retirados del frasco mediante la adición de 1 × tripsina / EDTA en la solución de sal equilibrado Hanks (HBSS) y incubando durante 5 minutos, después se centrifuga a 900 g durante 2 minutos y resuspendido en RPMI 1640 complementado con 10% de SFB.

Cultura de la línea celular de macrófagos J774.2

El adherente murino monocitos-macrófagos J774.2 línea celular se obtuvo de la Colección de Animal Cell Cultures (Salisbury, Inglaterra). Las células fueron cultivadas en 25 cm 2 en frascos de cultivo de tejidos RPMI 1640 suplementado con 1% L-glutamina, un 1% penicilina / estreptomicina y 10% de SFB inactivado por calor. Cultura frascos fueron almacenadas en un humidificado incubadora a 37 ° Cy 5% de CO 2. Y la viabilidad celular se evaluó a través de un mejor haemocytometer Neubauer y azul de tripan exclusión. Todas las células que se rechazaron por no-adherente en la cultura frascos fueron desechados por lavado antes de su uso.

Partículas

Las partículas se utilizan en estos experimentos fueron multa de carbono negro (H. Haeffner & Co Ltd, Chepstow, Reino Unido), multa dióxido de titanio (Tioxide Ltd) y nanopartículas de carbono y dióxido de titanio negro (Degussa, Reino Unido). La composición de partículas es idéntica para ambos tipos de negro de humo y ambos tipos de TiO 2, respectivamente. Sin embargo, la variable diámetro y superficie de las partículas son descritas en la Tabla 1.

Cell tratamientos

Las células fueron sembradas en 40000 células por 96 y así en una placa y se incubaron durante 24 horas en RPMI 1640 complementado con 10% de SFB. Diluciones seriadas (62,5 - 2000 μ g / ml de la masa de dosis) de cada tipo de partícula se prepararon en el suero libre de RPMI y sonicated en sonicatore un baño de agua durante 5 minutos antes de su uso. Después de 24 horas, el medio fue removido de las células y se sustituye con las concentraciones de partículas antes de la incubación de otras 24 horas. Después de los tratamientos de partículas, la media fue retirado de las células y se centrifuga durante 30 minutos a 15000 g para eliminar las partículas. Los sobrenadantes fueron retirados y almacenados en tubos separados a -80 ° C para su uso en el ensayo de LDH.

LDH ensayo

Control positivo de las muestras de ensayo LDH fueron preparados por lisis de células con 50 μ l de 0,1% Tritón X-100 disuelto en buffer fosfato salino (PBS). Las soluciones que luego se centrifuga a 11000 g durante tres minutos y 10 μ l del sobrenadante se utilizó como control positivo para indicar total liberable LDH. Un control negativo se obtuvo incubando las células con medio libre de suero. Para crear una curva estándar, se elaboraron las normas de piruvato (usando H 2 O destilada y 1 mg / ml disuelto en NADH 0,75 mM piruvato sódico), que van en concentraciones equivalentes a 0 - 2000 unidades / ml de LDH. Las normas fueron transferidos (60 μ l) por triplicado, a una placa de 96 pocillos. En el resto de todos los pozos de la placa, 50 μ l de NADH se añadió. Las muestras fueron incubadas a 37 ° C / 5% CO 2 durante 5 minutos.

La prueba y muestras de control (10 μ l) se han añadido a los pozos en la placa que contiene el NADH solución. La placa se incuba a 37 ° C, 5% CO 2 durante 30 minutos. Después de la incubación, de 50 μ l de 2, 4-dinitrophenylhydrazine (0,2 mg / ml disuelto en HCl 1 M) fue añadido a la totalidad de los pozos de la placa y se dejó por 20 minutos a temperatura ambiente. Hidróxido de sodio (50 μ l de 4 M de concentración) se añadió a cada pocillo y la placa se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. La placa fue sacudido por 5 segundos y la absorbancia de todos los pozos se midió a 540 nm con un lector de microplacas Dynex MRX.

Macrófagos quimiotaxis de ensayo

La quimiotaxis aparatos utilizados en estos estudios fue una re-utilizable de 96 pozos Neuroprobe quimiotaxis de cámara (Receptor Technologies, UK). Cada una de las muestras (30 μ l) fue cargado, por triplicado, en la parte inferior de la cámara de los pozos. Un filtro de policarbonato Neuroprobe (tamaño de poro 5 μ M) se insertó entre las capas. J774.2 macrófagos (2 × 10 5) en 200 μ l de suero libre de RPMI 1640 se añadieron a la parte superior de cada bien. La cámara se incuba a 37 ° C en 5% CO 2 durante 6 horas y el filtro fue removido y lavados tres veces con PBS en la parte superior para eliminar los macrófagos no emigraron. El filtro fue manchada con un Romanowsky (Diff-Quick) mancha. La densidad óptica de cada uno así en el filtro se leyó a 540 nm en un lector de placas Dynex multiwell. El aumento de absorbancia se correlaciona con el aumento del número de macrófagos en movimiento a través del filtro.

Zymosan activado suero (ZAS)

ZAS es un conocido activador de C5a en la sangre y, como tal, ha sido utilizado en numerosos estudios como un control positivo en los ensayos de quimiotaxis. Un balance de solución salina en Zymosan A (10 mg / ml), se preparó y sonicated durante 5 minutos. El balance Zymosan solución (100 μ l) se añadió a 900 μ l de FBS. Para preparar una solución de control, 100 μ l de solución salina estéril se añadió a 900 μ l de suero. Ambas soluciones fueron incubadas en un baño de agua agitando a 37 ° C por 2 horas y luego a los 56 ° C durante 30 minutos. Las soluciones fueron centrifugadas durante 5 minutos a 2000 g entonces alicuotar y almacenados a -80 ° C hasta su uso. Para uso en la quimiotaxis de ensayo, ambas soluciones se diluye a la concentración adecuada, utilizando suero libre de RPMI 1640.

Para determinar el tiempo óptimo de incubación y de las concentraciones de ZAS para su uso en la quimiotaxis de ensayo, una solución de ZAS (1 mg / ml) y un control negativo se prepararon tal como se detalla anteriormente. Para la concentración respuesta de los experimentos, ambas soluciones se diluye al 2%, 5%, 10% y 20% con medio RPMI 1640. Las soluciones fueron analizadas utilizando la quimiotaxis de protocolo, tal como se describe más arriba. Por el momento, los experimentos curso, el 10% ZAS solución fue preparado y ensayado en la quimiotaxis de cámara como se detalla más arriba. Las células fueron incubadas en la cámara durante 45 minutos, 90 minutos, 3 horas o 6 horas antes de que el filtro se ha retirado y manchadas.

La exposición de L-2 a las células TNF α

L-2 células fueron sembradas en una placa de 96 pocillos en un celular de 40000 células por pocillo y se incuba durante la noche. Rat TNF α (Biosource, Reino Unido) se ha preparado en tres diferentes concentraciones, 0,1, 1 (control positivo) y 10 ng / ml utilizando PBS estéril que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina. El medio de la L-2 células fue retirado y reemplazado con 200 μ l de TNF α en la concentración requerida. TNF α Asimismo, se añadió a una concentración equivalente a los pozos que no contenía ninguna L-2 células con el fin de proporcionar una celda sin comparación. Controles negativos fueron preparados por la adición de suero libre de RPMI tanto a la L-2 y células de la celda libre de los pozos. La placa se incubó humidificado en una incubadora a 37 ° Cy 5% de CO 2 durante 6 horas. Después de la incubación, los sobrenadantes fueron retirados y la prueba del potencial para inducir la migración de macrófagos quimiotaxis utilizando el protocolo de ensayo, tal como se describe anteriormente.

La exposición de L-2 células de las partículas

Una placa de 96 pocillos se sembró con L-2 células (40000 células por pocillo) y se incubaron humidificado noche a la mañana en una incubadora a 37 ° Cy 5% de CO 2. Las suspensiones de la multa y negro nanopartículas de carbono y dióxido de titanio se prepararon en el suero libre de RPMI a una concentración de 125 μ g / ml. Las suspensiones se sonicated durante 10 minutos antes de su uso. A 1 ng / ml de TNF α solución se preparó también en el 0,1% de BSA en PBS para ser utilizado como control positivo. El suero libre de suspensiones de partículas y TNF α se añadieron a los pozos en la placa de 96 pocillos con células de L-2. Un duplicado de células libres de placa de 96 pocillos También se preparó utilizando idénticas soluciones de TNF-α y el suero libre de partículas en suspensión. Las dos placas de 96 pozos fueron incubadas humidificado en una incubadora a 37 ° Cy 5% de CO 2. Después de 24 horas de incubación, las dos placas se retiraron y los sobrenadantes se extrajeron y se almacenan en tubos eppendorf. Los tubos eppendorf se centrifuga a 15000 g durante 15 minutos, y los sobrenadantes transferido a tubos nuevos. Las muestras fueron almacenadas a -80 ° C antes de su análisis.

Preparación de L-2 medio condicionado

Tripsina / EDTA en HBSS (1 ×) se añadió a un matraz de la L-2 en células de aproximadamente el 80% de confluencia y se incubaron durante 5 minutos a 37 ° C / 5% CO 2. Suero libre de medio de cultivo RPMI (10 ml) se añadió a las células y las células fueron centrifugadas a 900 g durante 2 minutos. El sobrenadante se decanta y las células normales se resuspendió en medio de cultivo. Células fueron evaluadas y ajustadas a 1 millón de células por ml. Las células fueron sembradas en una placa de 6 y en 1 millón de células por pocillo y se incuba durante la noche.

Para preparar las partículas de suspensión, multa y nanopartículas de carbono negro, suspendida en suero libre de RPMI a una concentración de 1 mg / ml y sonicated durante 10 minutos antes de diluir a 125 μ g / ml. El suero libre de suspensiones de partículas (200 μ l) se sumaron a la 6-así placa y se incubaron durante 24 horas. También se incubaron las células con RPMI libre de suero durante 24 horas. Después de la incubación, el medio condicionado se ha retirado y se centrifuga a 15000 g durante 15 minutos y se combinaron los sobrenadantes y almacenados a -80 ° C hasta su uso.

SDS-PAGE electroforesis en gel de L-2 medio condicionado

Un 15% de la separación de gel fue preparado por la mezcla de 23% destilada H 2 O, 50% de acrilamida mezcla, el 25% Tris HCl (1,5 M, pH 8,8), el 1% dodecil sulfato de sodio (SDS, 10%) y 1% persulfato amónico ( APS, el 10%). TEMED se añadió a una concentración de 0,04% inmediatamente antes de pipeteado el gel en el aparato de fundición. Un apilamiento de gel fue preparado mediante la mezcla de 68% de H 2 O, 17% de acrilamida mezcla, 12,5% Tris HCl (0,5 M, pH 6,8), 1% SDS (10%) y 1% de APS (10%). TEMED se añadió a una concentración de 0,1% inmediatamente antes de añadir el gel a la separación de gel en el aparato de fundición. Inmediatamente después de la adición de apilamiento de gel para el casting aparato, 1 μ l de azul de bromofenol se añadió a la de gel de apilamiento.

Para preparar las muestras, de 20 μ l de L-2 medio condicionado fue pipeta en un eppendorf. Para no reducir el gel (Figura 5 bis], 30 μ l de buffer de muestras se añadió al medio condicionado. Para reducir el gel (Figura 5b], 27 μ l de buffer de muestras y de 3 μ l de dithiothreitol (TDT) se agregó a cada una de las muestras. Ambos conjuntos de muestras fueron incubadas en un bloque de calefacción 1; minutos de incubación de la no reducción de las muestras y 2 minutos para la reducción de las muestras. Después de la calefacción, las muestras fueron inmediatamente almacenados en hielo.

Una vez emitidos, los geles se transfirieron a un tanque de electroforesis y sumergido en 1 × buffer. Las muestras (20 μ l), así como marcadores de colores peso molecular se han añadido a los geles y la electroforesis se ha ejecutado a 40 mA durante 45 minutos. Ambos geles se tiñeron con la tinción de azul de Coomassie destained noche a la mañana y por microwaving (3 × 1 minuto) en agua destilada fresca.

Centrifugación diferencial de L-2 medio condicionado

Medio condicionado, obtenidos a partir de L-2 células tratadas con nanopartículas de carbono negro de acuerdo con el protocolo anterior, fue separado de acuerdo a peso molecular mediante centrifugación Vivaspin 2 filtros funcionan de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes. A 30 kDa filtro fue utilizado en primer lugar, seguido de un filtro de 10 kDa y, por último, el 5 kDa filtro. Sobrenadantes fueron almacenadas a -80 ° C hasta el momento de la prueba del potencial para inducir la migración de macrófagos quimiotaxis utilizando el protocolo descrito anteriormente. El control negativo en este experimento fue medio condicionado obtenido de las células que no habían sido tratados con ningún partículas

Análisis estadístico

Los resultados se expresan como la media ± SEM. Todas las cifras son el resultado de tres experimentos con tres observaciones en cada salvo indicación en contrario. El análisis estadístico se realizó mediante un ANOVA de una vía con la comparación múltiple de Tukey.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

PB ayuda en la concepción del estudio, redactado el manuscrito y se lleva a cabo todos los ensayos. ACB participado en la concepción y diseño del estudio. KD participado en el diseño del estudio y contribución científica al manuscrito. JM participó en la evaluación crítica y científica contribución al manuscrito. VS supervisó el estudio y participó en el análisis de datos y redacción del manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por la Universidad Napier