Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 28-28 (más artículos en esta revista)

Novela Un péptido β inmunógenos placa modular la inflamación y la patología en un modelo murino de la enfermedad de Alzheimer

BioMed Central
Junio Zhou (junz@uci.edu) [1], Maria I Fonseca (mifonsec@uci.edu) [1], Rakez Kayed (rkayed@uci.edu) [1], Irma Hernández (livhernandi@gmail.com) [ 1], D Scott Webster (swebster@clarientinc.com) [2], Ozkan Yazan (oyazan@uci.edu) [1], David H Cribbs (cribbs@uci.edu) [3], Charles Glabe G (cglabe @ Uci.edu) [1], Andrea J Tenner (atenner@uci.edu) [1]
[1] Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, CA 92697, USA
[2] Clarient, Inc., San Juan Capistrano, CA 92675, USA
[3] Department of Neurology, University of California, Irvine, College of Medicine, Irvine, CA 92697, USA
[4] Institute for Brain Aging and Dementia, University of California, Irvine, CA 92697, USA
[5] Center for Immunology, University of California, Irvine, CA 92697, USA

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

La enfermedad de Alzheimer, una demencia del anciano, se caracteriza por la acumulación de depósitos de proteína amiloide en el cerebro. Inmunización para prevenir esta acumulación se ha propuesto como una posibilidad terapéutica, aunque adversas reacciones inflamatorias en ensayos con seres humanos indican la necesidad de nuevas estrategias de vacunación.

Método

Aquí la vacunación con péptido amiloide novela inmunógenos se evaluó en un modelo de ratón transgénico que muestra relacionada con la edad, la acumulación de placas fibrilar.

Resultados

La inmunización con cualquier conformación del péptido amiloide inició a los 12 meses de edad (momento en el que fibrilar amiloide ha comenzado a acumularse) mostraron disminución significativa en el total de depósitos de amiloide y fibrilar y en la reactividad glial en relación con el control de animales transgénicos. En cambio, no hubo disminución significativa en la deposición amiloide o activación glial en ratones en el que se inició la vacunación a los 16 meses de edad, a pesar de la presencia de niveles similares anti-A β anticuerpos en animales jóvenes y mayores vacunados con un inmunógeno. Curiosamente, la inmunización con una oligomeric conformación de A β era igualmente tan eficaz como otros péptidos amiloides a reducir la acumulación de placa. Sin embargo, los anticuerpos generados por la vacunación con la conformación de un oligomeric β tienen más limitado epítopo reactividad que los generados por fA β, y la respuesta microglial fue significativamente menos robusto.

Conclusión

Estos resultados sugieren que una más específica, como inmunógeno oligomeric A β pueden diseñarse de que logre el objetivo de que se agoten amiloide tiempo que se reduce el potencial perjudicial reacciones inflamatorias. Además, los datos indican que la inmunización activa de ratones con mayores Tg2576 cualquier conformación amiloide no es tan eficaz en la reducción de la acumulación de amiloide y las formas conexas de la patología como la inmunización de los ratones más jóvenes, y que los niveles séricos de anticuerpos anti-amiloide no son cuantitativamente los niveles relacionados con la reducción de amiloide - Patología asociada.

Antecedentes

Enfermedad de Alzheimer (EA) es una relacionada con la edad común de la demencia o pérdida de capacidades cognitivas. Pérdida neuronal, neurofibrillar placas seniles y ovillos, los depósitos de proteínas anormales que incluyen productos de la proteína precursora amiloide (β péptidos amiloide (A β)) son características patológicas de la enfermedad. Si bien el mecanismo de esta neurodegeneración queda por definir, sustancial de pruebas que implican un papel importante para el péptido β A (40-42 aminoácidos), se ha informado (revisado en [1, 2]]. Como resultado, un enfoque terapéutico general que se está investigando es la reducción de la acumulación de péptido amiloide en el cerebro. Varios informes han demostrado que, cuando los ratones que contiene el transgén humanos mutantes para la proteína precursora amiloide (APP) fueron inmunizados con fibrilar Un péptido β antes de la acumulación de depósitos de amiloide, una deposición de β observó en las edades más tarde se vio muy disminuido [3 - 6]. Sin embargo, cuando se aplica a los seres humanos, la "inmunización" con un β dado lugar a la elaboración de una adversa reacción inflamatoria en una fracción de los pacientes [7 - 9], que condujo a una reevaluación de la estrategia de AD en los seres humanos, en particular en que Etapa de la enfermedad en grandes depósitos de amiloide fibrilar han comenzado a acumularse [10]. Es esta etapa de la enfermedad que a menudo se correlaciona con la aparición de deficiencias cognitivas que es un punto en el que se define el potencial de terapia puede ser iniciado.

Varios estudios en modelos de ratones han demostrado que la inmunización pasiva, en estos casos intracraneal o periféricas de la inyección anti-A β anticuerpos, dieron lugar a un ritmo relativamente rápido de la liquidación de cantidades significativas de A β inmunoreactividad, ambos depósitos extracelulares, así como la acumulación intraneuronal A β [11 - 15] . Además, la disminución de la acumulación de amiloide, ya sea pasivo o activo de inmunización están acompañados de la mejora de la función cognitiva en los modelos murinos [16, 17] y revisado en trabajos anteriores [18]]. Sin embargo, no todos los anticuerpos anti-amiloide proporcionar el mismo grado de protección [19], y se han producido al menos dos informes en los que los animales robustos con la placa de carga no respondió a un inmunógeno [3, 20]. Por lo tanto, como con otras respuestas inmunológicas, la naturaleza de la inmunógeno, el adyuvante utilizado para la inmunización, la edad y la genética de los animales inmunizados todos contribuir a la definición de la respuesta inmune que se desarrolla posteriormente y estas diferencias conducen a diversos grados de protección y de limpieza De las lesiones.

Los informes recientes han definido un oligomeric la conformación de una estructura que altera β LTP actividad [21, 22] e induce neurotoxicidad in vitro, que puede ser revertida mediante la adición de anticuerpos anti-oligomeric [23, 24]. Desde un β oligómeros se propone la conformación de un intermediario antes de fibril formación y se ha propuesto que los anticuerpos prevenir o revertir amiloide asambleas pueden ser terapéuticos [25 - 27], probamos la inmunización con una novela inmunógeno oligomeric presentación de la conformación de un β [23 ]. Además, la A β oligómeros puede ser más transitorios (y presente en concentraciones más bajas en un momento dado) que en otras conformaciones, y, por tanto, la inmunización con la forma de oligomeric el péptido amiloide puede proporcionar beneficio con un mínimo de la inducción de la cascada inflamatoria. Los datos obtenidos demuestran que la inmunización con una oligomeric conformación del péptido es tan eficaz como la vacunación, ya sea con fibrilar amiloide o un múltiplo antígeno inmunógeno péptido amiloide en términos de la limpieza de amiloide, y que la reactividad microglial es significativamente menor con oligómeros como el inmunógeno que otros amiloide Conformaciones.

Los experimentos descritos aquí también fueron diseñados para evaluar el efecto de la vacunación de los animales en una edad avanzada o fase de la patología de mitigación del amiloide asociada neuropatología en un ratón mutante overexpressing humanos proteína precursora amiloide, y determinar si las diferencias en la deposición se podría complementar Detectado en placas resistentes a la remoción. Nuestros resultados, además de la identificación de un nuevo candidato inmunógeno, demuestran que, si bien el nivel de anticuerpos en suero medidos son similares o ligeramente diferentes en los animales inmunizados con un inmunógeno a diferentes edades, la disminución de la acumulación de ambos fibrilar y difusa placas amiloides Se produce sólo cuando los ratones son inmunizados en las primeras etapas de la enfermedad (12-16 meses de edad). El nivel de activación C3 fragmentos asociados con placas también se redujo en los animales inmunizados con cualquier amiloide inmunógeno, correlacionando con la reducción de la carga de la placa fibrilar. Por último, un nuevo y automatizado, asistida por ordenador método de cuantificación de inmunoreactividad se describe y se muestra correlación con convencionales de análisis de imágenes.

Métodos
Péptido amiloide fibril y preparación oligomérica

Un liofilizado β1-42 péptidos se resuspendió en 50% acetonitrilo en el agua y volver a liofilizados. Oligómeros solubles fueron preparados por disolución de 1,0 mg de péptido en 400 μ L hexafluoroisopropanol (HFIP) por 10-20 min a temperatura ambiente. 100 μ l de la solución resultante de semilla se añadió a 900 μ l MilliQ H 2 O en un tubo Eppendorf siliconized. Después de 10-20 min de incubación a temperatura ambiente, las muestras fueron centrifugadas durante 15 min. A 14000 × G y la fracción sobrenadante (pH 2.8-3.5) se transfirió a un nuevo tubo siliconized y sometidos a una suave corriente de N 2 durante 5-10 minutos para evaporar el HFIP. Las muestras se agita a 500 RPM usando un micro con revestimiento de teflón para remover la barra de 24-48 horas a 22 ° C. Oligómeros fueron validados por microscopía de fuerza atómica (AFM), microscopía electrónica (EM) y el tamaño de cromatografía de exclusión (SEC), tal como se describe [23]. Fibrillas están formadas por la misma solución, agitando durante 7 días. Fibrillas sedimented y fueron lavados en PBS, y resuspendido en 2 mg / ml. Β amiloide fibrilar (fA β) péptidos se almacenaron a -70 ° C hasta el momento de la inmunización. Para el antígeno oligomérica (oligo), A β oligomérica molecular imitar fue preparado por conjugar β40 A través de un carboxilo terminal thioester a 5 nm de oro coloidal que se describió anteriormente [23], y almacenadas a 4 ° C hasta su utilización. Un péptido de antígenos múltiples (MAP), que contiene un núcleo matriz, de 4 de ramificación lysines contigua con el péptido amiloide beta 1-33 (ie.MAPA β 1-33) a la vez los nativos de células B y T epítopos de A β fue sintetizado (Invitrogen Inc , Carlsbad, CA) para aumentar la respuesta a una β. Péptidos se resuspendió en PBS estéril a los 2 mg / ml, vortex y almacenados a -70 ° C.

Animales y esquema de vacunación

Tg (HuAPP695.K670N-M671L) 2576 K. Hsiao de ratones [28] y no transgénicos littermates o B6/SJL ratones de tipo salvaje fueron utilizados como controles. FA β oligomérica imitan o se emulsionar 1:1 (v / v) con adyuvante completo de Freund (CFA) para la primera inmunización, mientras MAPA β 1-33 péptidos se emulsionar 1:1 (v / v) con adyuvante completo de Freund que contiene 4 mg / Ml Mycobacterium tuberculosis (Difco, Voight Mundial, en Kansas City, Mo) [29]. Con posterioridad vacunas con cada inmunógeno en adyuvante incompleto de Freund (IFA) se realizaron después de 2 semanas, y mensualmente a partir de entonces de 3 inyecciones adicionales. Dos semanas después de la última vacunación, los animales fueron perfundidos sangrado y como se describe a continuación. En todas las vacunas a 100 ug péptido fue inyectado por vía subcutánea ratón. Además, en el momento inicial de la inmunización con β MAPA 1-33 500 ng de la toxina pertussis (PTX) (Sigma, St Louis, MO) en 200 ul PBS se inyectó IP, seguida de una segunda inyección de 24 horas [29] . Inmunización para los controles de tipo salvaje y ratones transgénicos incluyen inyecciones de adyuvante con PBS solamente (no péptido antígeno). Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo en virtud de los protocolos aprobados por la Universidad de California Irvine Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión.

Colección de tejidos e inmunohistoquímica

Los ratones fueron profundamente anestesiados con una sobredosis de pentobarbital (150 mg / kg, IP), de sangre recolectadas por punción cardiaca, y entonces los animales perfundidos con transcardially fría de búfer fosfato salino (PBS). Después de la disección, el tejido cerebral se fijó la noche a la mañana con paraformaldehído al 4% en PBS, pH 7,4 a 4 ° C. Posteriormente, se fija el tejido almacenado en PBS/0.02% de azida sódica (NaN 3) a 4 ° C hasta su uso. Fijo tejido cerebral se seccionó (40 um) con una vibratome, coronal y secciones fueron recogidas en PBS (que contiene 0,02% de azida sódica), y almacenadas a 4 ° C antes de la tinción.

Inmunohistoquímica (IHC) se realizó en la libre flotación del cerebro secciones. Para teñir de un β placas, las secciones se sumergieron en un 50% de ácido fórmico durante 5 min. Peroxidasa endógena en el tejido fue bloqueada por el tratamiento con 3% de H 2 O 2 en PBS, a 10 minutos a temperatura ambiente. Inespecíficos antecedentes tinción fue bloqueado by1 horas de incubación en el 2% de BSA con 0,3% Triton X-100 (TX) a temperatura ambiente. Las secciones fueron incubadas con anticuerpos primarios (Tabla 1] la noche a 4 ° C, lavadas 3 veces con PBS con 0,1% y TX incubadas con anticuerpos con biotina secundaria seguida por ABC kit de reactivos (Vector, Burlingame, CA) durante 1 hora en cada habitación Temperatura. Finalmente, después de lavar tres veces, las secciones se incubaron durante aproximadamente 2 ~ 5 min con diamino-bencidina (DAB), (Vector). Las secciones fueron montadas en láminas, deshidratados en una serie de etanol clasificado, limpiado con xileno, y luego coverslipped con DePeX (Especialidades Biomédicas, CA). Por coloración fluorescente, biotina secundario fue detectado por incubación con Estreptovidina-CY3 (Vector) durante 1 h en RT. Un fibrilar β fue visualizado por incubando en las secciones 1% thioflavine durante 30 minutos seguido de un lavado de 1 minuto en el 50% de etanol, 5 min en agua destilada desionizada, y 5 minutos en PBS. Secciones incubadas en paralelo sin primaria de anticuerpos IgG o control no desarrollaron manchas.

Análisis de la imagen

Inmunomarcación se observó bajo un Zeiss Axiovert-200 microscopio invertido (Carl Zeiss, Thornwood NY) y las imágenes adquiridas con un Zeiss Axiocam digitales de alta resolución en color cámara (1300 × 1030 píxeles), utilizando el software Axiovision 3,1. Las imágenes digitales fueron analizados mediante el programa de análisis KS300 (Zeiss). Porcentaje de immunostained zona (zona inmunoticción / Área de la imagen total × 100) se determinó para todos los marcadores estudiados por un promedio% Campo Espacio de varias imágenes por sección en la que se cubren la mayoría o la totalidad de la región de estudio. Ensayos se repitieron por lo menos Dos veces, con n = 4-7 animales por grupo por edad por marcador como se señala en el texto y leyendas. Cuantitativa se hicieron comparaciones sobre las secciones procesados en el mismo tiempo. Única ANOVA análisis estadístico se utilizó para evaluar la significación de las diferencias en la zona de la placa, C3 gliales y la activación de productos de reacción entre los grupos de animales.

Un segundo método de cuantificación para el sistema de análisis de imagen SIAC (Clarient, Inc, San Juan Capistrano, CA) se utilizó para analizar la inmunoreactividad 6E10. Las imágenes fueron adquiridas automáticamente. Cortical hipocampo y las regiones apropiadas para el análisis fueron seleccionados y anotó automáticamente utilizando un algoritmo que identifica a los objetos basados en parámetros configurados por el usuario. Objeto identificación se empareja con un algoritmo de segmentación de las cuencas hidrográficas a fin de facilitar la separación de tocar y la superposición de los depósitos. De esta manera grandes depósitos contiguos que forman bandas de A β se separaron en distintos objetos. Porque un β depósitos en estos animales puede variar en tamaño y forma, la identificación de un β-positivo objetos utilizó un filtro de amplio tamaño (12-3000 eficaz micras de diámetro) y no emplear filtros rigurosos morfométricas. Los datos recogidos para cada región de interés (ROI) fueron el área de tejido anotó (de la zona de retorno de la inversión), el número de A β-positivo objetos identificados y de la superficie total de la A-β positivo objetos. Estos parámetros permiten calcular dos medidas diferentes de amiloide carga: la A-β positivos Objeto Densidad, que es simplemente el número de objetos por 2 mm de tejido anotó y se utiliza como una aproximación del número de placa-como estructuras por mm 2, Y en segundo lugar, la relación (en porcentaje) de la superficie total de la A-β positivo objetos a la zona de tejido anotó. Cabe señalar que, desde el numerador de esta segunda relación contiene sólo la zona delimitada dentro de los límites de los objetos identificados y no incorpora pequeñas partículas de A β-inmunoreactividad que están excluidos por el tamaño del filtro (es decir, <12 micras de diámetro efectivo ), Esta medida es distinta de la relación del área descrita en el apartado anterior y, por tanto, se denota como la A-β positivos Objeto Area Ratio.

Las comparaciones entre los grupos experimentales se basa en los valores individuales por animal para un β-positivos y una densidad de objetos β-positivos Objeto Area Ratio. Estos se calcularon mediante la determinación de la suma de los números de A β-positivo objetos (o la suma de las áreas de la A β positivo objetos) para la totalidad de la sección y dividiendo por la suma de las áreas de todos los ROIs. Este análisis se realizó cegados a los resultados de la cuantificación antes convencionales, tal como se describe más arriba.

ELISA análisis de los anticuerpos anti A β

ELISA ensayos se realizaron a lo descrito previamente [23]. En pocas palabras, el 50 de ng/100 ul monomérico, oligomeric fibrilar o una β40 fue chapada en ELISA pozos y bloqueadas con BSA. Las muestras de suero fueron inicialmente diluida 250 veces y luego diluido en serie de dos veces a un punto final de 1:64000. La secundaria para la detección de anticuerpos utilizados fueron conjugados con peroxidasa AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H + L) (Jackson ImmunoResearch)-peroxidasa y conjugado anti-ratón IgM (Zymed / Invitrogen, Carlsbad, CA). Para muestra de la absorbancia superó 3 veces la absorbancia de fondo, el título fue determinado a partir del punto medio de la curva de dilución (IC50). Para las muestras que no exceda de este criterio, el título se supone que deberá ser inferior a la inicial de la dilución de 1:250.

Resultados
Inmunización inició a los 12 meses de edad con cualquier conformación β Un total disminuyó tanto fibrilar y un β inmunoticción Tg2576 en ratones

En AD significativo deterioro cognitivo se correlaciona en general con la aparición de "maduras" las placas amiloide [26, 30]. Estas placas contienen péptido amiloide fibrilar y, como tal, puede ser detectada por thioflavine, un reactivo que las manchas en las proteínas beta hoja conformación [31]. Por lo tanto, la acumulación de placas en las thioflavine manchadas animales vacunados en el grupo etario de 12-16 meses fue evaluado en el hipocampo y las regiones corticales de control de los animales o de los animales vacunados de 12-16 meses de edad con fA β, oligo A β, β MAPA 1-33 adyuvante o solos . Representante fotomicrografías presentadas en la Figura 1A, y de análisis de imágenes usando KS300 programa de análisis (Zeiss), de secciones de múltiples animales demostraron que la media thioflavine% positivo en la zona oligo A β y β fA inmunizados grupos (sacrificaron a los 16 meses de edad) se redujo en 56 y 40%, respectivamente, en relación con el control de los adyuvantes. Del mismo modo, cuando MAPA β 1-33 se utilizó como inmunógeno, fibrilar acumulación de placa se redujo en 53% en relación con adyuvante de control (Figura 2]. No hubo diferencia significativa entre los controles no tratados y los animales tratados sólo con adyuvante (Figura 1A y 1B] o adyuvante más toxina pertussis en thioflavine positivo placas (Figura 2A y 2B] o cualquiera de los marcadores de la prueba a continuación.

Para evaluar el total de depósitos de amiloide en ratones transgénicos APP después de que el régimen de 4 meses de la inmunización, los humanos β Un anticuerpo monoclonal específico, 6E10, fue utilizado como se describe en Material y Métodos. La Figura 3 muestra fotomicrografías representante de la región del hipocampo y corteza de control o de los animales vacunados. Análisis de imágenes de las secciones de múltiples animales demostraron que la media% manchadas zona de campo (es decir, un β depósitos) en un oligo y β β fA inmunizados grupos se redujo en más de un 44% en relación con el Comité de Libertad Sindical / IFA controles (Figura 3]. La inmunización con β MAPA 1-33 disminuido total de la deposición amiloide (6E10 tinción) en un 52% y un 44% en relación con el control y la falta de tratamiento adyuvante, respectivamente (datos no presentados, n = 6 animales por grupo, p <0,03).

Para validar aún más la cuantificación de estos resultados inmunohistoquímicos, secciones también fueron analizados utilizando un sistema automatizado de la imagen digital (SIAC, CLARiENT). Una imagen digital se adquirió para la totalidad de cada una de las secciones a una resolución de un píxel por micras. Todos los tejidos corticales y del hipocampo fueron luego analizadas por objeto la identificación y la característica de los algoritmos de extracción. Desde el análisis de más de 50 secciones a la vez la corteza y el hipocampo demostrado que la inmunoreactividad fue mayor en la corteza que en el hipocampo, sólo las secciones que contiene la corteza y el hipocampo se utilizaron en esas comparaciones de tratamientos. Ambos oligomeric fibrilar y un β conformaciones, así como el MAPA β 1-33 inmunógeno, dio lugar a importantes cambios en la deposición de un β, con 2 - y la reducción de 3 veces en los dos número de placa (A β-positivos Objeto Densidad) y la zona de la placa (A β - Objeto positivos Zona Ratio) en relación con el adyuvante respectivos controles (p <0,05 por dos colas t-test). En particular, la medida de la reducción de la novela medida de la densidad de objetos por un β, oligo o el MAPA β 1-33 inmunizados los grupos es esencialmente idéntico en comparación con los controles adyuvante, (es decir, reducciones en el número de placa fueron 2,73, 2,76 y 2,63 - Veces, respectivamente, p <0,01, una cola t-test). La importante disminución de la placa en la zona de A β, oligo o el MAPA β 1-33 inmunizados grupos obtenidos por este método fueron 1,96, 2,39 y 2,72 veces. Estos resultados cuantitativos correlaciona bien con los convencionales de análisis de imágenes de los mismos especímenes (r = 0,84, p <0,0001 para un β positivos Objeto Densidad vs convencionales Area Ratio, y r = 0,75, p <0,0001 para un β positivos Objeto Area Ratio vs Zona convencionales Ratio), la presentación de más de validación a la conclusión de que la inmunización con tres diferentes formas de la péptido amiloide resultado en una disminución similar en la acumulación de la placa amiloide en este modelo murino cuando inmunizados durante un período de rápido deposición amiloide.

GFAP reactividad disminuye en Tg2576 inmunizados en 12-16 meses, con un oligo o fA β β

Características de las placas amiloide fibrilar en ambos AD cerebro humano y en modelos de ratón de la acumulación de amiloide es sólida asociación de astrocitos activados, que pueden ser contemplados por los astrocyte marcador de células GFAP. GFAP tinción de B6/SJL el control de los animales fue insignificante en relación con la política de asociación activa animales transgénicos, si no reciben tratamiento, sólo inmunizados con adyuvante o cualquier Un β inmunógeno (datos no presentados). Sin embargo, aunque prominentes asociados GFAP tinción de la placa se observó en ambos sin tratamiento adyuvante y sólo cerebro de ratones transgénicos, GFAP% de la media esfera zona después de los 4 meses de inmunización se describe en el plan de M & M con un oligo o fA β β fue de 42 y 41%, respectivamente, de CFA Control, es decir, una disminución de 58% y 59% (Figura 4A y 4B]. Esto es coherente con la correlación cuantitativa entre madura, la acumulación de placa amiloide fibrilar y astrogliosis. Es decir, la cantidad de placa fibrilar deposición se correlaciona con astrogliosis.

La inmunización con una oligomeric β en 12-16 meses resultó en menos microglial inmunoreactividad relativo a la inmunización con β fA

Microglia desempeñar un papel importante en la regulación de la homeostasis en el cerebro y tienen la posibilidad de controlar activamente phagocytose, de secretar citocinas, y de presentar el antígeno a las células T en función de su entorno estimulante [32]. Sin embargo, algunas de estas mismas funciones neuroprotector puede convertirse en perjudicial si dysregulated [33]. Dada la observación común de que microglia reactiva son característicamente asociados con fibrilar amiloide que contiene placas en ambos AD humanos y modelos animales, que evaluó el efecto de la vacunación sobre la reactividad microglial medido por CD45 y MAC-1 antígenos de superficie. Las fotomicrografías de las áreas corticales del cerebro muestran una pronunciada disminución de la MAC-1 en los animales inmunizados con un oligo o fA β β en comparación con o sin tratamiento adyuvante tratados ratones transgénicos (Figura 5A]. % De la media de la zona MAC-1 en la tinción de un oligo y β β fA grupos inmunizados es del 40 y 76%, respectivamente, de control CFA (Figura 5B]. Los resultados fueron similares cuando se evaluaron inmunorreactivas CD45 con media esfera zona% en la tinción de un oligo fA β β y los grupos de 35 y 60%, respectivamente, del Comité de Libertad Sindical de control (Figura 5C y datos no presentados). Sólo adyuvante (CFA), los animales y los animales no tratados fueron indistinguibles. Curiosamente, mientras que existe una clara tendencia a la disminución de la activación microglial en el fA β animales vacunados, una diferencia estadísticamente significativa no se estableció en el grupo estudiado en relación con el Comité de Libertad Sindical de control, quizás debido en parte a la variabilidad de los animales. Sin embargo, la diferencia en la reactividad microglial en los animales inmunizados con la conformación de un oligomeric β fue estadísticamente significativa, ya sea en relación con los controles no tratados o adyuvante controles (p <0,01, MAC-1, p <0,001, CD45). De hecho, CD45 y MAC-1 reactividad en el Oligo A β animales vacunados es significativamente menor que en los animales inmunizados fA β (p <0,02 yp <0,05, para MAC-1 y CD45, respectivamente). Estos resultados podrían reflejar una menor variabilidad en la activación de la microglia en respuesta a la inmunización con un oligo β que con fA β y podría estar relacionada con los mecanismos resultantes de la disminución de la acumulación de amiloide en los animales inmunizados en cada caso. Curiosamente, la inmunización con β 1-33 MAPA también mostraron significativamente menos CD45 (50% de los adyuvantes control, p <0.036) (Figura 2] y MAC-1 (38% de los adyuvantes control, p <0,012, experimento 1, 4 -- 7 animales por grupo, datos no presentados).

La inmunización con cualquier amiloide inmunógeno en 16-20 meses muestra ningún efecto sobre la placa patología

La idéntico esquema de inmunización se realizó con Tg2576 de más edad y de tipo salvaje (B6/SJL) animales. La inmunización se inició a los 16 meses de edad, un momento en el que hay total y robusto depósitos de amiloide fibrilar (véase los controles no tratados en las Figuras 1, 2, 3, 4, 5] en los ratones transgénicos, y continuó a través de 20 meses de edad. Los animales fueron entonces desangrado, sacrificado y evaluaron para cada uno de los marcadores se ha descrito anteriormente. No se observaron diferencias en thioflavine tinción, 6E10, GFAP, MAC-1, o CD45 se observaron entre los grupos de tratamiento, independientemente del inmunógeno (Figura 6 y los datos no se muestran para MAC-1 y el MAPA β 1-33 animales vacunados).

La inmunización con una oligomeric β conformaciones medibles de anticuerpos inducidos por la reactividad a oligómeros pero no soluble o amiloide fibrilar

Los niveles de anticuerpos anti-amiloide inducida en todos los animales inmunizados difieren en cierta medida entre el inmunógeno y la edad de los animales en el momento de la inmunización, aunque todos los animales responden a la inmunización. Una observación más notable es que la inmunización de los transgénicos y ratones de tipo salvaje con la conformación de un oligomeric β resultado mensurable de anticuerpos a la forma de un oligomeric β (Tabla 2], con trazas de no reactividad a fibrilar A β soluble o un β según la evaluación de conformación ELISA específico. La inmunización con β fA o un β 1-33 como MAP péptido generado importantes niveles de IgG anti-β como oligomeric A detectados por ELISA (Tabla 2], sino también de anticuerpos inducidos a fA β y β soluble A (datos no presentados). Los animales transgénicos inmunizados con oligo o fA β β Una a una edad más temprana (12-16 m) fue ligeramente más alto que los títulos de anticuerpos en los inmunizados más adelante (16-20 m), aunque el nivel de anticuerpos en los animales inmunizados con β MAPA 1-33 no fue En relación con la edad de vacunación. Nontransgenic ratones vacunados tenían más respuestas a todos los inmunógenos relativo a los ratones transgénicos, y esas respuestas no varían según la edad de vacunación. Sin embargo, el nivel de anti-oligomeric o cualquier anticuerpo IgG anti β Un anticuerpo no se hizo sentir correlación con cualquiera de los marcadores patológicos en el grupo de edad cuando ya sea individual animales transgénicos fueron comparados (datos no presentados). Además, como era de esperar después de 4 meses de la inmunización, no apreciable IgM anti oligomeric A β o anti fibrilar A β se detectó (usando un ELISA específico para la detección de IgM). Sólo los muy bajos niveles de IgM anti soluble A β se observó en los sueros de animales inmunizados con un β fibrilar.

Para determinar si los anticuerpos generados con cada inmunógeno fueron capaces de obligar a las placas amiloides en ratones transgénicos APP, diluciones de los sueros de cada grupo de animales inmunizados en 12-16 meses y los animales inmunizados con fA β a 16-20 meses fueron estudiadas para detectar la capacidad De obligar a los depósitos de amiloide en el cerebro de un unimmunized secciones 16 meses APP ratón. De conformidad con los datos encima de ELISA, los anticuerpos de animales inmunizados oligo no mancha placas, mientras que los anticuerpos de animales inmunizados en 12-16 meses y 16-20 meses con fA β y sueros de animales MAPA β 1-33 todas manchadas placas corticales (datos no presentados ).

Mouse IgG se detecta colocalized con placas en Tg 2576 inmunizados a los 12 meses con fA β

Como una indicación de si alguna de anticuerpos inducidos a β-amiloide tuvieron acceso al cerebro, secciones de cerebro de los animales vacunados se realizarán las pruebas de la inmunoreactividad para IgG de ratón utilizando dos enfoques: tinción directa con biotina anti IgG de ratón (Figura 7A] e indirectos inmunohistoquímica utilizando Conejo anti IgG de ratón como principal anticuerpo y, posteriormente, con el sondeo de conejo anti inmunoglobulina (datos no presentados). Ambos enfoques tinción dio resultados comparables. Depósitos de IgG fueron detectados en la corteza / secciones de hipocampo de los animales inmunizados con fA β a los 12 meses (Figura 7A] y estos depósitos de mIgG colocalized con un β positivo placas (Figura 7B]. Todos los animales inmunizados con fA β en 12-16 meses, que fueron probadas (n = 6) presentaron esos depósitos. De los animales inmunizados con la prueba oligo A β (n = 7) sólo había un ligero reactividad IgG (Figura 7A] dentro de la corteza, mientras que no se detectaron manchas en cualquiera de los adyuvantes controles (Figura 7A, n = 5). Curiosamente, ninguno de los animales vacunados a los 16 meses mostró ningún IgG depositado en el cerebro (no se muestran los datos, los controles CFA = 3, oligo A β n = 5, fA β n = 5). Todos los animales inmunizados con SCFA (n = 4) o MAPA β 1-33 (n = 4), en 12-16 meses que se probaron fueron negativos para la placa asociada ratón IgG. Secciones de cada animal se probaron 2-4 veces. De este modo, sólo los animales inmunizados con fA β a 12-16 meses mostró ninguna placa-como el depósito de IgG en el tejido cerebral, a pesar de que el título de anti fibrillas y anti-soluble A β, fueron generalmente más altas en el MAPA β 1-33 animales inmunizados.

Complemento C3 proteína se correlaciona con la placa patología

Complemento de activación de los productos asociados con placas que se han detectado en los modelos murinos de la EA [34, 35]. Desde los complejos antígeno-anticuerpo se sabe que activar complemento, se complementará la hipótesis de que la activación de placas asociadas con anticuerpos (es decir, los vacunados con fA β a 12-16 meses) puede iniciar la cascada del complemento con lo que aumenta la cantidad de C3 obligado a las placas (Y, por lo tanto, posiblemente, se contribuye a una mayor reactividad microglial). Novela anticuerpos monoclonales se han convertido recientemente en disposición que reconoce específicamente la activación de productos C3 (C3b, iC3b y C3c) [36]. Estos anticuerpos (2 / 16 y 2 / 11) se utiliza para comparar C3 activación de productos en secciones de cerebro de ratones inmunizados con oligo A β y β fA solos o con adyuvante. C3b/iC3b inmunoreactividad se detectó en todas las secciones del cerebro de ratones Tg2576 (Figura 8A]. Curiosamente, los resultados de los análisis de las imágenes demostró que el nivel de C3 activado correlacionado con fibrilar A β placa de carga (Figura 8B]. Es decir, no aparente aumento en la deposición de C3 se detectó en los animales inmunizados con fA β y han demostrado que los anticuerpos asociados a la placas. Más bien, la cantidad de C3 reactividad refleja la reducción de la cantidad de placas en la actualidad los animales inmunizados en relación con el adyuvante de control de animales, y es casi idéntica a la observada en similar secciones cerebrales de los animales inmunizados con oligo A β. C3 manchas en los animales inmunizados en 16-20 meses correlacionado con thioflavine tinción con ningún aumento o la disminución de la deposición C3 detectables en ninguno de los animales (datos no presentados).

Discusión

Los datos presentados en este caso es la primera investigación de los efectos de la inmunización activa con el péptido beta amiloide en un determinado oligomeric conformación de un ratón modelo murino de la enfermedad de Alzheimer. La inmunización con este péptido de la forma como fue eficaz en la reducción de la deposición amiloide en animales como Tg2576 bien fibrilar A β o un múltiplo de un péptido β antígeno cuando se inició la vacunación a los 12 meses. Curiosamente, era significativamente menor (p <0,05) microglia activada en los animales inmunizados con la forma de un oligomeric β que en los vacunados con fA β. Además, la respuesta de anticuerpos inducidos por la vacunación con una oligomeric β tenido un alcance mucho más restringido epítopo respuesta, la generación de anticuerpos a oligomeric A β, pero no a soluble o fibrilar A β, de manera similar a la observada en la vacunación de los conejos con la conformación de un oligomeric β [23 ]. Los otros dos inmunógenos probado, fA β β MAPA y 1-33, los anticuerpos inducidos a oligomeric, fibrilar y soluble A β. Así pues, se podría especular que el menor activación de microglia es el resultado de la inducción de esta restringido y que esta función puede llevar a un menor potencial de las respuestas autoinmunes y respuestas inflamatorias. Más trazado de la base para la activación microglial aparentemente menor es, sin embargo, necesaria para verificar esta hipótesis. Puesto que no mancha estas secciones de las células T, no se sabe si el Oligo A β inmunógeno T suscitó una fuerte respuesta inmune mediada por células más allá de la inducción de anticuerpos anti-oligomeric. Si bien esto es una preocupación ya que una fracción de los pacientes en el ensayo de inmunización humanos amiloide (AN1792) desarrollaron meningoencefalitis [7 - 9, 37], cualquier reducción de los posibles efectos adversos de la inmunización es deseable.

En cambio, no se observó disminución significativa en cualquier patológica marcador mide en ratones vacunados con cualquier péptido forma cuando se inició la vacunación a los 16 meses, un tiempo en el que hay altos niveles de placas acumulado. La falta de eficacia en la reducción de la placa patología asociada por la inmunización de estos ratones de más edad, similar a la de Das, et al [3], no se debió a la disminución de anti-A β títulos de anticuerpos en los ratones como los niveles de reactividad se Ya sea equivalente, o sólo ligeramente inferiores a las de los ratones inmunizados a una edad más temprana (12 meses) que sugiere alteraciones relacionadas con la edad y las diferencias en el tráfico de amiloide en el cerebro (ver más abajo) o de anticuerpos en el SNC a través de BBB (o al anticuerpo - Independiente de los mecanismos de limpieza). Si bien se ha planteado la hipótesis de que las placas son mayores refractaria a la degradación y la limpieza, intracraneal inyecciones de anticuerpos anti A β en la antigua PAA / ratones Tg (16-20 meses de edad) se han notificado a largo clara placas establecido [38]. Curiosamente, Dodart y colegas informaron de que la inmunización pasiva periféricas, de 24 meses de edad, los ratones PDAPP no tuvo ningún efecto sobre la deposición amiloide en contraste similar a la inmunización de los ratones más jóvenes. Sin embargo, en estos muy antiguos ratones PDAPP mejora significativa del comportamiento de las tareas se ha demostrado [39]. Si bien aquí los resultados demuestran claramente la falta de efecto en la limpieza de los depósitos amiloides en ratones inmunizados a una edad más avanzada, queda por ver si la mejora en el aprendizaje puede ser detectada en los muy ancianos Tg2576 activamente ratones inmunizados con conformaciones específicas de A β (en particular La conformación oligomeric), y si los efectos de los β Una inmunización son igualmente influenciado por la edad y / o deposición de la placa en el momento de la inmunización.

En este estudio se utilizó un segundo método novedoso para la cuantificación de la detección inmunohistoquímica, en concreto los depósitos de amiloide. Aunque el análisis de las imágenes puede aportar la precisión y la objetividad a IHC, ciertos inconvenientes históricamente han limitado su uso. No sólo son los procesos de adquisición de imágenes y la gestión de datos intensivas en mano de obra, pero la mecánica de análisis en sí mismo puede introducir cierta subjetividad. Automatizada de los sistemas de digitalización de imágenes, como la que aquí a prueba, se han desarrollado para hacer frente a tales inconvenientes. Los resultados de los análisis de la carga de amiloide la utilización de esta plataforma automatizada estrechamente correlacionados con los obtenidos con una aceptado más tradicionales de análisis de imágenes. Por lo tanto, este método se muestra para poder evaluar con exactitud la carga de amiloide en modelos de ratones transgénicos de AD. Además, el uso de objetos de base de datos proporciona análisis no pueda obtenerse mediante simple cálculo de zona% positivo. Por ejemplo, la inmunización con β MAPA 1-33 resultado similar en 2,63-y 2,72 veces en la reducción de un β-Objeto Densidad positivos (es decir, número de placa) y A-β positivos Objeto Area Ratio (es decir, zona de la placa), respectivamente. En cambio, un β fibrilar inmunización afectados estos parámetros un tanto diferente, resultando en una reducción de 2,73 veces en A β-positivos, sino un objeto de densidad inferior (aunque aún importante) 1.96 veces en una reducción de β-positivos Objeto Area Ratio. Esto plantea la fascinante posibilidad de que los diferentes paradigmas de la inmunización podría efectuar cambios en la carga de amiloide preferentemente a través de la alteración en la placa, ya sea en número o tamaño de la placa, aunque otro estudio será necesario rigor a prueba esta afirmación.

Curiosamente, la placa asociada a la IgG se detectó sólo en el cerebro de los animales inmunizados con una β fibrilar de 12 a 16 meses de edad. Si bien esto es consistente con la falta de anti-amiloide fibrilar de anticuerpos en el Oligo β Un esquema de inmunización, todos los sueros de animales inmunizados con β MAPA 1-33 que figuran los niveles de anti-β A fibrilar similar a la β fA animales inmunizados, pero no se detectó IgG en Placas amiloides incluso en el conjunto más joven (de vacunación iniciada a los 12 m de edad) de los animales (n = 6), en la que la reducción de las placas y patología asociada es comparable a fA β animales inmunizados. Estos datos sugieren que puede haber diferencias en el acceso de los anticuerpos a través de tejido cerebral barrera hematoencefálica o IgG de los sistemas de transporte en los ratones inmunizados con fA β (tal vez debido a la especificidad de anticuerpos epítopo [40]]. Múltiples inyecciones de la toxina pertussis se ha informado al resultado de la infiltración de células inmunes en el cerebro [29]. Sin embargo, mientras que PT se dio a los ratones MAPA β 1-33 en el momento de la inyección inicial y 24 horas más tarde, estos animales no mostraron inmunoglobulina asociada con el resto de placas y niveles similares de reducción de las placas en una época se consideraba de manera específica con la Un oligo y β β fA inmunógenos. Sin embargo, no mancha estas secciones de las células T y, por tanto, no puede confirmar ni refutar la observación de los publicados anteriormente vascular asociada células T por Furlan y colegas [29].

Por último, la cantidad de fragmentos de activación C3 depositado en las placas en todos los animales se correlaciona en gran medida con la cantidad de thioflavine manchas detectadas en cada animal. Si bien esto era de esperar fibrilar amiloide ya que se ha demostrado que activan complemento [41 - 43], es algo sorprendente que no existe un evidente aumento de los asociados con placas de IgG (fA β inmunizados, 12-16 meses), ya que los complejos inmunes ( A β aquí / A anti β) ávidamente obligar C1q y activar complemento. Sin embargo, otras investigaciones serán necesarias para determinar directamente el grado de activación de complemento en el tratamiento de animales de cada grupo. De hecho el aumento de la activación de complemento se predice para mejorar la eliminación de las placas de revestimiento de complemento (C3 activación a través de fragmentos, C3b y iC3b) y, por lo tanto, si esas placas restantes son menos opsonized o mostrar alguna otra característica distintiva que queda por determinar.

El mecanismo por el cual los planes de inmunización disminución neuropatología y prevenir o revertir el comportamiento de los déficits todavía no se ha definido. Una disminución en la deposición amiloide como resultado de la inmunización activa se vio en overexpressing APP animales transgénicos que se FcR gamma cadena deficiente [44], lo que sugiere que la ingestión FcR mediada por células fagocíticas no es un requisito. Sin embargo, como ya se ha dicho, la activación de complemento fragmentos (en particular, C3b y iC3b) también son capaces de mediar en la ingestión de partículas y, por lo tanto, complementar los receptores y / o en otros receptores fagocíticas puede proporcionar un mecanismo para mejorar la ingesta en ausencia de FcR. Bacskai et al. Demostró la limpieza de las placas por la inmunización pasiva de Fab fragmentos de anticuerpos contra amiloide [13], que carecen de la porción Fc de la molécula de anticuerpos y, por lo tanto, no pueden ni participar ni activar los receptores Fc complementar, de este modo la prestación de apoyo para múltiples mecanismos alternativos de limpieza. Adicional posibles mecanismos por los cuales tanto la inmunización pasiva y activa puede ser ventajoso que se han propuesto. El "periférico sumidero" modelo sugiere amiloide que se elimina en la periferia después de ser transportados desde el cerebro a través de la vasculatura en la sangre [12, 45]. Si terapéuticamente relevantes de las concentraciones de anticuerpos anti A β no atraviesa la barrera hematoencefálica (BBB), y luego un mecanismo para el transporte de un β fuera del cerebro a través de la BBB se requiere [46]. El principio molécula que parece ser que participan en el transporte de A β fuera del cerebro a través de la BBB es la lipoproteínas de baja densidad de receptores de la proteína-1 (LRP-1) [47 - 49], aunque otras moléculas como ApoE y α2 - Macroglobulina podrán participar en este proceso. Los anticuerpos específicos de PRL-1 inhibió sustancialmente la liquidación de A β 40 desde el cerebro apoyo a la función de PRL-1 como un transportista de un péptido β fuera del cerebro [47]. Además, los ratones transgénicos APP cruzó a los receptores de proteína asociada a los ratones knockout (PAR-/ -) ratones, que son deficientes en función PRL-1, elaborar un aumento extracelular de la deposición y la neurodegeneración β [50]. Curiosamente, el PRL-1 en la expresión BBB parece disminuir de manera significativa con el envejecimiento normal y en el AD. Si esto sucede en ratones y en el envejecimiento contribuye a la falta de limpieza de presentarse aquí debería ser puesta a prueba.

Otro posible mecanismo propuesto es que los anticuerpos inhiben fibrillization de amiloide y / o promover depolymerization de fibrillas (revisado en [51]]. Otros sugieren anticuerpos debe ser reactiva con la A β intermedios que presten su efecto protector funcional. Wisniewski y colegas informaron de que la inducción de una predominante IgM anti β Una respuesta también dio lugar a mejoras en el comportamiento animal Tg2576 que no corresponden necesariamente a un β carga en el cerebro, aunque sí los títulos de IgM alta correlación con baja carga amiloide [52]. Inmunización activa de las ratas con conformaciones mixtas de A β péptidos impedido a la inhibición de la LTP actividad acondicionado cuando los medios de comunicación que contiene un β oligómeros intracerebroventricularly fueron inyectados, y esta prevención de la inhibición de la LTP correlacionado con anticuerpos reconocimiento de la A β oligómeros [24]. Anti-oligomeric inducida por anticuerpos terapéuticos aquí podría promover la limpieza y la eliminación de amiloide a través de cualquiera de estos mecanismos, y mediante la limitación de la respuesta inmune, pueden limitar perjudicial activación y / o promoción de la inflamación.

Una hipótesis coherente con las observaciones en humanos AD y modelos de ratones transgénicos de la EA es que hay al menos dos, que se superponen, las etapas que contribuyen a la disfunción neuronal en la EA. Los primeros acontecimientos que afectaron a la acumulación intracelular de los péptidos A β [53] y / o generación de péptidos β oligomeric A [21, 23] o complejos que contengan un oligomeric β [54] daría lugar a alteraciones neuronales y muerte celular. Factores que surjan durante el envejecimiento, tales como el estrés oxidativo, disfunción mitocondrial, lisosomal deficiencias en la función o regulación de los factores neurotróficos que conducen a la transformación resultados que son perjudiciales para la célula puede contribuir a, o mejorar, susceptibilidad al estrés inducido por un β [55 - 57] . El aumento extracelular fibrilar A β depósitos de estos procesos y / o sobrecarga de la capacidad de fagocitosis de la región local proporcionar un nido para complementar la activación [41, 42]. La generación de la activación del complemento proinflamatorias productos iniciaría una segunda fase inflamatoria de los acontecimientos que aceleran el daño neuronal local, la pérdida y la disminución de la función cognitiva [34]. Lesión neuronal en ambas etapas se podrían evitar o disminuir por una disminución en el péptido amiloide en el cerebro, un objetivo directo de la inmunoterapia. Proporcionar mayor especificidad de la respuesta inmune sin embargo, también puede disminuir la probabilidad de activar perjudicial respuestas inflamatorias, y, por lo tanto es una ventaja potencial de la conformación oligomeric amiloide como el inmunógeno.

Conclusión

En resumen, la inmunización con cualquier péptido amiloide inmunógeno dado lugar a una reducción significativa (45-55%) de la placa y la disminución de la patología inflamatoria de células microglial reactividad (40-65%) sólo cuando inmunizados antes de la deposición masiva de las grandes placas maduras. Estas disminuciones en la patología no se correlaciona necesariamente con el nivel de anti Un β1-42 de IgG en suero o asociados con la placa-IgG. Este primer análisis de la deposición y acumulación de complemento C3 activación dentro de un juicio de inmunización muestra asociación de C3b/iC3b con placas que se correlaciona con la cantidad de placas thioflavine presente más que cualquier asociación con la respuesta de anticuerpos inducidos. Por último, la inmunización con oligomeric A β1-42 inducida por una mayor disminución de la "reacción" microglia relativo a la inmunización con β fibrilar Un determinado por microglial superficie expresión de CD45 y MAC-1 antígenos. La menor respuesta microglial resultantes de la inmunización con β oligomeric Una sugiere que el objetivo de que se agoten las placas que se puede lograr mientras que la inducción de neuroinflammation menos, y, por consiguiente, facilitar la aplicación de la inmunoterapia para el tratamiento y / o prevención de la EA en los seres humanos.

Abreviaturas

AD, la enfermedad de Alzheimer; BBB, barrera hematoencefálica; CFA, Freund completo del coadyuvante; fA β, péptido amiloide fibrilar 1-42; IFA, adyuvante incompleto de Freund; oligo A β, β A 1-42 conjugado con oro coloidal; PT, la toxina pertussis.

Conflicto de intereses

Charles Glabe y Rakez Kayed son consultores para Kinexis, Inc y Scott Webster es un empleado en Clarient, Inc Los autores declaran que no tienen otros intereses en competencia.

Contribuciones de los autores

JZ realizado todos los tratamientos de los animales, la perfusión, inmunohistoquímica, análisis de imagen, análisis de datos y presentación, y guiado o de tejidos realizados preparación y recogida de suero. MF realizó inmunohistoquímica, análisis de imagen, análisis de datos y presentación, estudios de genética molecular y preparación manuscrito; RK inmunógenos preparado y realizado inmunoensayos, SW realizó análisis de imagen, análisis de datos y preparación manuscrito; IH realizó inmunohistoquímica, análisis de imagen, análisis de datos y presentación y asistida Y con la perfusión del cuidado de los animales; OY realizó inmunohistoquímica y análisis de imágenes; DC ayudó con el diseño del estudio y la preparación manuscrito; CG contribuido al diseño del estudio y el análisis de datos, preparación y manuscrito. AJT desarrollado el diseño del estudio, el estudio guiado ejecución, dirigida análisis de los datos, la interpretación y la presentación, y redactado y editado el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Apoyado por el NIH AG 00538, NS35144 (AJT), AG20241 (DHC), y la Fundación Larry Hillblom L. (CGG). Los autores se agradecen a los Dres. John Lambris (Universidad de Pennsylvania, Filadelfia, PA, y Anna Erdei (Eotvos University, Budapest, Hungría) para el mouse monoclonal anti C3 anticuerpo 2 / 16 y 2 / 11, y Jennifer Chen, Xiomara Fernández, Anahit Ghochikyan, Vitaly Vasilevko, Maya Hatch, Jeffrey Glabe, excelente para la asistencia técnica, y K. Pisalyaput para la lectura cuidadosa del manuscrito.