Journal of Negative Results in Biomedicine, 2005; 4: 11-11 (más artículos en esta revista)

Cortactin y fagocitosis en células de Sertoli aisladas

BioMed Central
Katja M Wolski (kwolski@hsc.usf.edu) [1], Edward Haller (ehaller@hsc.usf.edu) [2], Don Cameron F (dcameron@hsc.usf.edu) [1]
[1] Departamento de Anatomía de la Universidad de South Florida College of Medicine, 12901 Bruce B. Downs Blvd., MDC6, Tampa, FL 33612, EE.UU.
[2] Departamento de Patología de la Universidad del Sur de la Florida, la Facultad de Medicina, 12901 Bruce B. Downs Blvd., MDC6, Tampa, FL 33612, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Cortactin, una proteína de unión actina, se ha asociado con las células de Sertoli ectoplasmic especializaciones in vivo, sobre la base de su immunolocalization torno a los jefes de espermátidas alargadas, pero no se había identificado anteriormente aislados en células de Sertoli. En un modelo in vitro de células de Sertoli-spermatid vinculante, cortactin fue identificado en torno a los desechos muertos y las células germinales. Sobre la base de esta observación, la hipótesis de que este actina proteína de unión puede estar asociada con un no-relacionados con el cruce de funciones fisiológicas, como la fagocitosis. El propósito de este estudio fue determinar la presencia y distribución de cortactin aislado de rata en células de Sertoli activa en actividad fagocitaria tras la adición de 0,8 μ m perlas de látex.

Resultados

De células de Sertoli monocultivos fueron incubadas con o sin la hormona folículo estimulante (FSH; 0,1 μ g / ml) en presencia o ausencia de citocalasina D (2 μ M), como un disruptor actina. Cortactin fue identificado por norma inmunomarcación con anti-cortactin, clon 4F11 (Upstate) después de los tiempos de incubación de 15 min, 2 h, y 24 h, con o sin piedras. Las células expuestas a la hormona y no cuentas no parece tener una distribución ubicua de cortactin en todo el citoplasma. En presencia de citocalasina D, cortactin inmunoticción punteada y se distribuyen en un patrón similar a la de la actina en las células expuestas a la citocalasina D. células de Sertoli no expuestos a la FSH, pero activado con piedras, no mostró cortactin inmunoticción todo el phagocytized cuentas En cualquiera de los períodos de tiempo. FSH exposición no alteró la distribución de cortactin dentro de las células de Sertoli, incluso cuando se upregulated actividad fagocitaria por la presencia de piedras.

Conclusión

Los resultados de este estudio sugieren cortactin no está asociado con peripheralized actina en ocasiones presentan sitios o fagocíticas. Son necesarios más estudios para aclarar el papel de cortactin en células de Sertoli.

Antecedentes

La proteína de unión actina cortactin [1 - 3] Se cree que está involucrado con la actina relacionadas con eventos celulares, como la motilidad celular, la adhesión celular, la citocinesis, endo-y la fagocitosis, el movimiento de partículas intracelulares a través del citoplasma, y la organización de las proteínas transmembrana [ 4]. Es evidente que son las células de Sertoli y phagocytize fagocíticas, entre otras cosas, órganos residual, apoptosis las células germinales, las células germinales necrótico, y tubulobulbar complejos [5 - 9]. Del mismo modo, las células de Sertoli aisladas de pre-puberal testículos de ratas han sido marcados para su posterior detección por la fagocitosis de perlas de látex [10]. Cortactin crosslinks F-actina in vivo [11], es un sustrato de la tirosina quinasas src [12], y puede unirse a otras proteínas (por ejemplo, ZO-1), con lo que, posiblemente, la estabilización de las redes de actina [3, 13].

Alteraciones en el citoesqueleto cortical se observan en la fagocitosis [1], y la actina ha sido implicado en el proceso endocítica [14 - 16]. Cortactin es contratado actina a la membrana ricas en volantes a la entrada de la estructura de Shigella flexneri cuando invadir células HeLa y se encuentra también en la periferia de la phagosome poco después de la internalización [17]. Sin embargo, no se encontró cortactin a asociarse con la F-actina de las fibras de estrés [1, 17]. Doble etiquetado en los experimentos con células HeLa invadido S. Flexneri mostró un casi perfectas co-localización de actina cortactin con la entrada en la estructura y en la periferia de la phagosome [17].

Aunque la presencia de células de Sertoli en cortactin se ha abordado en relación a su papel en la celda de la adhesión celular [18], su papel en la fagocitosis aún no ha sido investigado. El actual estudio examinó el papel de cortactin relativo a la función de células fagocíticas del in vitro.

Resultados

Todas las culturas se immunostained para cortactin y no counterstained. Resultados de microscopía de contraste diferencial de interferencia indicaron que las piedras fueron localizadas dentro de las células. No hubo intento de cuantificar el immunoreaction producto, aunque con cantidades fueron determinadas. La presencia o ausencia de FSH no tuvo un efecto aparente sobre la distribución o localización de cortactin dentro de las células de Sertoli.

15 min

Cortactin inmunomarcación fue difusa en todo el citoplasma de células de Sertoli cuando se incubaron sin piedras (Figura 1A]. Cuando se incubaron con cuentas, el patrón de tinción intracitoplasmática es menos difusa y se muestran las zonas de densidad variable (Fig. 1B]. Cortactin inmunoticción no era evidente en todo el phagocytized perlas (Fig. 1B]. El principal anticuerpo supresión de manchas de control dio lugar a la falta de reacción de producto (Fig. 1A inserción).

2 hr

Cortactin inmunoticción se distribuyó en todo el citoplasma de las células de Sertoli sin perlas cultivadas (Fig. 1C], y con piedras (Fig. 1D], y en ambos fue menos difuso que observó en el 15 min culturas. Además, en ambos grupos de tratamiento, producto de reacción parecía más densa en la periferia de la célula (Fig. 1C, D] que la observada en el 15 min culturas (Fig. 1A, B]. Cortactin inmunoticción no era evidente en todo el phagocytized perlas (Fig. 1D].

24 Horas

En las culturas sin piedras, cortactin inmunoticción se observó en todo el citoplasma de las células de Sertoli (Fig. 1E]. Aunque no cuantificado, parece que hay menos cortactin que la observada a los 15 min (fig. 1A], y de 2 horas (Fig. 1C] y menos perceptible peripheralization que observó en el período de tiempo de 2 horas. La adición de piedras (Fig. 1F] no parece modificar el patrón de cortactin inmunoticción en comparación a la cultura sin piedras (Fig. 1E].

Citocalasina D

Unos 15 minutos, 2 horas, 24 Horas y cultivos fueron expuestos a la citocalasina D. En el 15 min cultura, ninguna diferencia notable en la cantidad de cuentas de los primeros. En la cultura de 2 horas (Figura 2A], se observó un menor número de granos en los cultivos expuestos a la citocalasina D. La cantidad de cuentas en las 24 Horas cultura también parece ser inferior a la cantidad de cuentas en las culturas no expuestas a la citocalasina D (Fig. 2B], como en el de 2 horas culturas. En las 24 Horas cultura, la reacción cortactin producto fue punctata (Fig. 3], mientras que los no expuestos a la cultura Cytochalasin D (Fig. 3 inserción) no fue, con indicación de su localización con la citocalasina D-perturbado F-actina [19] .

Western blot

Western blot (Fig. 4] confirma la especificidad de los anticuerpos primaria en el control de las células (3T3 lisado) y cultivadas en células de Sertoli.

Discusión

Cortactin se ha asociado con endo-y fagocitosis in vivo e in vitro [4, 14 - 16]. Un estudio realizado por Chapin et al [18] indica la presencia de cerca de la cortactin lumen de los túbulos seminíferos en las fases VII y VIII de la rata epitelio seminífero ciclo, que se correlaciona con el fuerte aumento de la actividad fagocitaria de las células de Sertoli [20, 21]. Sobre la base de esta correlación, el actual proyecto fue diseñado para determinar si cortactin participa en el proceso de fagocitosis de las células de Sertoli, como se indica en células HeLa [17], en la que cortactin inmunomarcación positiva se observó en asociación con actina en la fagocitosis De S. Flexneri por estas células.

Los resultados del presente estudio muestran que cortactin se encuentra en todo el citoplasma de las células de Sertoli aisladas llevan de Matrigel ® para un máximo de 96 horas de incubación. El tratamiento con citocalasina D, confirmó que el cortactin en células aisladas probablemente asociado con F-actina, ya que las células de Sertoli tratados con citocalasina D mostró la misma punctata inmunoticción de cortactin de actina como se observa en las células expuestas a esta toxina [19]. Del mismo modo, es bien conocido que se asocia con la actina cortactin en otras células, según lo informado por Wu y Parsons [1], Urono et al [2], y Weaver et al [3].

Las observaciones de Dehio et al [17] que cortactin parece ser que participan en principios de la fagocitosis en células HeLa sugiere que esta proteína de unión actina también pueden estar involucrados en la fagocitosis de las células de Sertoli. Como observó Filippini et al [22], aisladas células de Sertoli comienzan phagocytizing cuentas después de 15 min de incubación, como se observa en el estudio actual, y la tasa de fagocitosis mesetas después de 5 horas. Si cortactin fagocíticas se asocia con la invaginación de la membrana celular, a principios phagosomal formación, y / o transporte phagosomal, esta proteína probablemente se localiza alrededor de las piedras después de 15 min, con un aumento de la inmunomarcación en 2 hr. Esto, sin embargo, no se observó en el estudio actual. La aparente falta de correlación entre cortactin localización y captación talón, sugiere cortactin no participa en la fagocitosis inicial aislados en células de Sertoli.

FSH tratamiento no parece alterar la distribución de cortactin dentro de las células de Sertoli en cualquier momento, el punto observado en todo el período de tratamiento. FSH Se ha demostrado que el aumento de la unión de los órganos y residual cytoplasts alargada de las células de Sertoli a espermátidas [6], sin embargo, Filippini et al [22] demostraron que la FSH inhibe la actividad fagocitaria de las células. Nuestros resultados sugieren que el papel de la FSH en células de Sertoli fagocitosis no está relacionada con cortactin.

Conclusión

La distribución de cortactin dentro de las células de Sertoli no parecen estar relacionados con la FSH en cualquier momento, el punto observado, por lo tanto, lo que sugiere que el papel de la FSH en células de Sertoli fagocitosis no está relacionada con cortactin. Cortactin también no parece estar relacionada con ocasiones presentan F-actina, en la que peripheralized actina en los cultivos de células de Sertoli no parece incluir cortactin. Los resultados de este estudio indican una necesidad de estudios adicionales para esclarecer el papel de cortactin en las células de Sertoli.

Métodos
El aislamiento de células de Sertoli, la cultura, y el pretratamiento

Se aislaron las células de Sertoli de 16 días de edad, ratas Sprague-Dawley (Harlan) secuencial por digestión enzimática con tripsina y colagenasa, que se describió anteriormente por Cameron et al [23]. En pocas palabras, se extirparon los testículos de las ratas macho prepúberes, y el parénquima es digerido con la enzima de rutina secuencial de los tratamientos (0,25% de tripsina, seguida de la colagenasa 0,20%). Las células se chapada (<1,5 × 10 6 células / cm 2) en 4 y cámara de diapositivas (Lab-Tek ®) precubiertos con Matrigel ® (1:5 dilución con complementada medio). Viabilidad de células de Sertoli en enchapado fue> 95%. Chapada células fueron incubadas en MEDM: F12 suplementado con 50 ng / ml de retinol (Acros) y 0,01 cc / ml de insulina-transferrina-selenio (ITS; Sigma) a 39 ° C, en un incubador humidificado con 5% de CO 2 -95 % De aire, de 2 días, para acelerar la eliminación de la contaminación de las células germinales. Los cultivos de células de Sertoli fueron tratados con una solución hipotónica de estériles 20 mM Tris-HCl buffer durante 2,5 min a 37 ° C para eliminar cualquier resto de las células germinales, después de lo cual la pretratados células posteriormente se colocaron en una cámara de humidificado a 33 ° C con 5% de CO 2 -95% de aire.

Grupos de tratamiento

Pretratados monocultivos de células de Sertoli se incubaron durante 24 horas, tras el tratamiento con Tris-HCl, en completarse MEDM: F12 medio e incubadas con o sin 0,1 μ g / ml FSH (NIDDK-oFSH-19-SIAFP, 94 × NIH-FSH-S1 / Mg; regalo de NIDDK-NIH) humidificado en una cámara a 33 ° C con 5% CO 2 -95% de aire por un período adicional de 24 horas.

Al tiempo 0 (4 días en la cultura), algunos premeditados, de células de Sertoli monocultivos recibido 2 μ M citocalasina D (Sigma) [24], el 0,8 μ m perlas de látex (Sigma), o ambos 2 μ M citocalasina D, y de 0,8 μ m perlas de látex. Estos monocultivos de células de Sertoli premeditados, se incubaron durante 15 minutos, 2 horas, o 24 horas en completarse MEDM: F12 medio en un humidificado cámara a 33 ° C con 5% CO 2 -95% de aire. No se hizo ningún intento de cuantificar talón absorción por las células de Sertoli, si bien todas las culturas se observaron por microscopía de contraste diferencial de interferencia después de la fijación y repetidos lavados a fin de determinar si se encontraban en las cuentas o en las células. Control de células de Sertoli pretratados monocultivos no recibió citocalasina D látex o piedras.

Cortactin inmunoticción

Células de Sertoli se fija con un 100% de etanol y immunostained para cortactin, tal y como se describe por el Vino y Chapin [25], utilizando 10 μ g / ml anti-cortactin (p80/p85), el clon 4F11 (Upstate) como el principal anticuerpo. Dos secundarios se utilizaron anticuerpos. La primera fue la rata antimouse IgG1 pesada cadena: biotina (1:200; Serotec), que fue conjugado con peroxidasa de rábano streptavidina (Zymed). Inmunomarcación positiva se visualiza con luz brillante por la reducción de DAB (Vector Labs). El segundo fue una rata antimouse IgG1 pesada cadena: FITC (1:200; Serotec). Inmunomarcación positiva fue visualizado por la luz ultravioleta. Latex cuentas fluoresced cuando entusiasmado con 540 nm de longitud de onda de luz, no había counterstaining, adecuada y positiva (células 3T3) y negativo (supresión de anticuerpos primaria) tinción controles se utilizaron.

Western blot

SDS-PAGE en gel de electroforesis se realizó para verificar la especificidad de anticuerpos. 20 μ g de proteína se cargaron en el gel. Cold lisis celular buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% NP-40; 0,25% de sodio deoxycholate; NaCl 150 mM, EDTA 1 mM; Complete ™ Mini cóctel inhibidor de la proteasa (Roche), 1 mM Na 3 VO 4; 1 MM NaF) fue agregado a los cultivos celulares, y las células fueron separadas utilizando un rascador de células desechables. La suspensión celular fue lisadas en un agitador orbital durante 15 min a 4 ° C, después de lo cual el lisado se centrifuga a 14000 × g durante 15 min a 4 ° C. El sobrenadante fue recogido por Western blot.

Lisados fueron separados en un 7,5% Tris-HCl Listo Gel (BioRad) y transferidas a nitrocelulosa utilizando un semi-seco secante aparato. La membrana se immunostained con 1 μ g / ml anti-cortactin (p80/p85), el clon 4F11 (Upstate), como el principal anticuerpo, y anti-ratón IgG (H & L) AP conjugada (Promega), en la secundaria de anticuerpos. El objetivo de proteínas en la membrana se visualizan a través de Western Blue ® estabilizado Sustrato para Fosfatasa alcalina (Promega).

Contribuciones de los autores

KMW llevado a cabo todos los experimentos. EH KMW ayudado en el desempeño de la inmunocitoquímica. DFC participado en el diseño del estudio y leído y aprobado el manuscrito final.