Proteome Science, 2005; 3: 9-9 (más artículos en esta revista)

Aplicación de la proteína lisado microarrays marcador molecular para la verificación y cuantificación

BioMed Central
Luli Ramaswamy (pinkas@hotmail.com) [1], Lin E (eli@mdanderson.org) [2], Iou Chen (ichen@bcm.tmc.edu) [3], Rahul Mitra (rmitra@mdanderson.org) [4], Joel Morrisett (morriset@bcm.tmc.edu) [3], Kevin Coombes (kcoombes@mdanderson.org) [2], Zhenlin Ju (zju@txstate.edu) [1], Mini Kapoor (mkapoor @ Mdanderson.org) [1]
[1] Departamento de Genética Molecular, la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX 77030, EE.UU.
[2] Departamento de Bioestadística, de la Universidad de Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX 77030, EE.UU.
[3] Departamento de Medicina, Sección de aterosclerosis, Baylor College of Medicine, Houston, TX 77030, EE.UU.
[4] EE.UU. Genomics Inc, Houston, TX 77054, EE.UU.

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Resumen

Este estudio presenta el desarrollo y la aplicación de microarrays de proteínas de lisado (LMA), la tecnología para la verificación de la presencia y cuantificación de las muestras de tejidos humanos de biomarcadores de proteínas. Sub-picogramo rango de sensibilidad que se ha conseguido utilizando un sobre LMA no enzimáticos metodología de detección de la proteína. Los resultados de una serie de experimentos de control de calidad se presentan y demuestran la alta sensibilidad y reproducibilidad de la metodología de LMA. La LMA optimizado metodología se ha aplicado para la verificación de la presencia y cuantificación de marcadores de la enfermedad de la aterosclerosis. LMA se utilizaron para medir la lipoproteína [a] y de la apolipoproteína B100 en 52 muestras de la endarterectomía carotídea. Los datos generados por el LMA fueron validados por ELISA utilizando la misma proteína lisados. Las correlaciones de las cantidades estimadas de proteína por el LMA y ELISA fueron muy significativas, con r 2 ≥ 0,98 (p ≤ 0.001) para la lipoproteína [a] y con r 2 ≥ 0,94 (p ≤ 0.001) para la apolipoproteína B100. Este es el primer informe para comparar los datos generados utilizando microarrays de proteínas con ELISA, una tecnología estándar para la verificación de la presencia de biomarcadores de proteínas. La sensibilidad, reproducibilidad, de alto rendimiento y calidad de la LMA tecnología lo convierten en un potencialmente poderoso para la tecnología de perfiles de los marcadores específicos de la enfermedad de proteínas en muestras clínicas.

Antecedentes

Actual de las metodologías utilizadas para estudios de biomarcadores de proteínas incluyen i) 2-dimensional electroforesis en gel de poliacrilamida [2D-PAGE; 1-4], ii) la espectrometría de masas [MS; 5-6], y iii) pruebas inmunológicas como el ensayo inmunoenzimático Y la radio-inmuno ensayo [ELISA y RIA; 7-9]. Si bien son ampliamente utilizados para el descubrimiento de biomarcadores de proteínas, MS y 2D-PAGE metodologías se han utilizado para la verificación de la presencia de pre-determinada proteína biomarcadores en pocos estudios. Inmunológicas, como los ensayos de ELISA y RIA son los más usados para la verificación de la presencia de pre-determinada proteína biomarcadores [7 - 9]. Sin embargo, ELISA y RIA no son de fácil aplicación para la detección de marcadores de la enfermedad conocida desde muy pequeñas cantidades de los materiales de partida, como lisados de las células obtenidas de muestras clínicas. Un típico test requiere hasta microgramos a partir de las muestras que son difíciles de obtener en la mayoría de los casos. Además, estas técnicas no son fácilmente adaptables a las aplicaciones de alto rendimiento necesario para la manipulación de un gran número de muestras simultáneamente.

Microarray basados en ensayos [10 - 12] dar una solución a estos problemas. Un microarray es una colección de sondas direccionables espacialmente inmovilizado sobre una superficie como manchas. El aumento de rendimiento se debe al pequeño tamaño de terreno en el microarray (~ 150-200 μ de diámetro) que permite a un gran número de lugares por los microarrays. Miles de sondas (impreso en el microarray superficie) puede ser interrogado durante un objetivo específico (en la solución) en un único experimento de microarrays. Además del alto rendimiento alcanzado, los ensayos de microarrays son muy sensibles y requieren muy pequeñas cantidades de muestras. El aumento de la sensibilidad de los métodos basados en microarrays se debe al formato reducido, lo que lleva a un aumento de la densidad de la señal [intensidad de la señal o zona; 13]. En comparación con el formato de placa micro título empleados en ELISA, un típico microarrays terreno es más de 25 veces menor. Esta densidad se concentra la señal y aumenta la intensidad de la señal. La cantidad de muestra necesaria para empapar una micromatriz terreno también disminuye en proporción a su superficie y, por tanto, normalmente unos pocos nanogramos son suficientes para varios experimentos de microarrays. Así, la sensibilidad comparable o superior a ELISA que se puede lograr utilizando microarrays de sólo una fracción (hasta 1 / 1000 ª), de el tamaño de la muestra necesaria para ELISA. La ventaja obtenida por la miniaturización, de alta sensibilidad, de alto rendimiento y hace microarrays de proteínas potencialmente poderosa tecnología para el descubrimiento de nuevos marcadores y la detección de los marcadores de proteínas conocidas [14 - 20].

En el presente estudio se presenta, el desarrollo y la aplicación de microarrays de proteínas de lisado (LMA), también conocida como fase inversa arrays [21, 22] para interrogar a múltiples muestras de la enfermedad humana de los marcadores específicos de las proteínas en un solo experimento. En LMA, las muestras (hasta miles) están inmovilizados en la superficie de los microarrays y un único anticuerpo para la proteína biomarcador se utiliza para la inspección de las muestras de su presencia. Cada anticuerpo sobre LMA se utiliza en un experimento independiente que se centra en el perfil de expresión de una determinada proteína en todas las muestras impresas en la matriz que conduzca a la uniformidad de los resultados. El uso de un único anticuerpo también permite la determinación de las diferencias en el marcador de los niveles de proteína en diferentes muestras de los pacientes con mayor precisión.

LMA variaciones de la tecnología se han utilizado en diferentes aplicaciones en los últimos años [23, 24]. El uso de preparados a partir de lisados láser captura microdissected muestras humanos, inversión de fase-arrays metodología se han utilizado con éxito para el estudio de la regulación en favor de las vías de supervivencia en la transición de epitelio normal de la próstata a neoplasia intraepitelial y invasiva en el cáncer de próstata [21]. Madoz-Gurpide y compañeros de trabajo [25] realizado fase líquida separación de proteínas de los extractos preparados a partir de un adenocarcinoma de pulmón A549 línea celular y de las diversas fracciones microarrayed y se probaron con anticuerpos contra proteínas específicas. Nishizuka y compañeros de trabajo [22] ha utilizado recientemente fase inversa-arrays a la pantalla de compuestos contra el cáncer en la actividad de un grupo que contiene 60 líneas celulares de cáncer humano. LMA también se han utilizado para el análisis de proteínas multiplexada 2 diferentes anticuerpos que se utilizaron para vinculantes en el mismo arrays para la verificación de la presencia de 2 o diferentes proteínas para determinar el estado de fosforilación de las proteínas de interés [26, 27].

El método de detección de la señal utilizada en la mayoría de los estudios mencionados es un enzimática tyramide basada en la reacción que cataliza la deposición de múltiples moléculas de colorante en el sitio de unión de anticuerpos. Un inconveniente de este método es la incapacidad de controlar la reacción enzimática de la deposición de los tintes que a menudo se traduce en la saturación de la señal de la intensidad de los microarrays puntos. En un informe anterior [28], se presentaron los diversos temas relacionados con tyramide utilizando un método basado en la amplificación de la señal de detección de microarrays. Un streptavidina-biotina basada (no enzimáticos) amplificación de la señal y la metodología utilizada en la detección de la LMA experimentos presentados aquí supera la señal de saturación de los problemas que enfrentan con la enzimática tyramide basado en la metodología.

En este informe se presenta el desarrollo y la validación de la LMA para la verificación de la presencia y cuantificación de marcadores predeterminado proteína utilizando anticuerpos especificidad de la prueba de Western blot. Hemos realizado experimentos de control de calidad para evaluar y optimizar la metodología de LMA. Hemos aplicado la metodología LMA optimizado para la verificación de la presencia y cuantificación de los marcadores de proteínas de las muestras de ateroma. Los resultados fueron altamente correlativos con los obtenidos por la técnica de ELISA utilizando el mismo lisados (con r 2 ≥ 0,98 (p ≤ <0,001) para la lipoproteína [a] y r 2 ≥ 0,94 (p ≤ 0.001) para la apolipoproteína B100), pero requiere mucho Menos la cantidad de muestras. Este es el primer estudio que muestra un paralelo comparación de los datos de los microarrays de proteínas con una herramienta estándar como ELISA, para la detección de los marcadores de proteínas conocidas.

Resultados

Se presentan los resultados de los experimentos realizados para probar y validar la LMA tecnología para la verificación de la presencia y cuantificación de biomarcadores específicos de la proteína. Elegimos utilizar una línea celular de los primeros experimentos para el control de la calidad LMA para facilitar el uso económico de los disponibles muestras del paciente. F9, un carcinoma murino terato-línea celular que puede ser fácilmente cultivadas se utilizó. Esta línea celular más expresa la proteína p53 supresor de tumor [29] y, por lo tanto, se determinó el nivel de expresión de la proteína p53 en lisados F9 preparado a partir de células de LMA en estos experimentos. Lisados preparado a partir de esta línea celular se utilizaron para optimizar la impresión y encuadernación pasos en LMA. Muestras de plasma humano normal también se utilizaron para mostrar la reproducibilidad de los datos generados. Todos juntos, los resultados de control de calidad de la reproducibilidad de los experimentos demuestran LMA impresión, la linealidad de las diferentes medidas vinculantes y la detección de la señal y la sensibilidad de la metodología de LMA. A continuación, hemos aplicado la LMA tecnología para la verificación de la presencia y de la cuantificación de los marcadores específicos de la proteína de muestras de tejidos y de ateroma comparación de los datos generados con los de ELISA experimentos.

LMA reproducibilidad en la impresión

Uno de los principales problemas en la impresión de microarrays es el punto-a-punto presentó variación debido a diferencias en la cantidad de material dispensado. Para demostrar la uniformidad de la dispensación de nuestro método (impresión), hemos preparado Cy3-etiquetados proteína F9 lisados de las células, hecho diluciones seriadas (7 diferentes concentraciones) e impreso en diapositivas. El conjunto de datos consiste de seis matrices con 3 repeticiones por importe lisado por serie, lo que resulta en un total de 18 puntos de datos por importe de lisado. La trama en la figura 1 se muestra un correlativo aumento de la intensidad de la señal con el aumento de la cantidad de lisado impresa. El cuadro 1 muestra un resumen de las estadísticas (media, desviación estándar (DE) y coeficiente de variación (CV)) de los datos generados. Observamos un CV de 2.59-5.47% de los 18 puntos de datos por lisado cantidad impresa, que indica alta reproducibilidad en la impresión de LMA. Similares datos se generaron utilizando la proteína marcada con Cy5 lisados (no se muestra).

La linealidad de las diferentes medidas vinculantes sobre LMA

Se utilizó un ensayo sándwich metodología para la detección de la señal de LMA. Lisados preparado a partir de las muestras se imprimieron en la membrana de nitrocelulosa revestidos diapositivas e incubadas con un anticuerpo específico contra el antígeno de interés. Los arreglos fueron incubadas con anticuerpos con biotina secundaria seguida de la detección de la señal utilizando streptavidina vinculados a Cy3 (o Cy5) tinte. La intensidad de la señal de final de la LMA puntos el resultado de una combinación secuencial de 3 vinculante eventos: 1) vinculante de la primaria de anticuerpos a la proteína marcadora en el lisado; 2) vinculante de la secundaria de anticuerpos a la primaria de anticuerpos, y 3) el carácter vinculante Cy3 de streptavidina-etiquetados a la secundaria de anticuerpos (Figura 2]. Para obtener uniformes, reproducibles y precisos es esencial para cerciorarse de que cada una de estas reacciones se produce vinculante en forma lineal.

La linealidad de cada una de las reacciones vinculante sobre la LMA se determinará de la siguiente manera: LMA con manchas que contienen F9 lisados o purificada proteína p53 (Figura 2, punto i), p53 purificada primaria de anticuerpos (Figura 2, punto ii), biotina secundaria de anticuerpos ( Figura 2, punto iii) y Cy3-etiquetados streptavidina (Figura 2, punto iv) se imprimieron. En el paso 1, de carácter vinculante, el LMA se incubaron con el anticuerpo primario p53, en el paso 2 con biotina secundaria de anticuerpos y, por último, con Cy3-streptavidina etiquetados en el paso 3. En el paso 1, de carácter vinculante, que es el principal anticuerpo se une a la F9 lisado (que son positivas para p53, [29]] y la proteína p53 purificada (figura 2, punto i). En el paso 2, la biotina secundaria de anticuerpos se unen a la principal anticuerpo ahora vinculado a la F9 lisado y purificado las proteínas p53 (Figura 2, punto i), ya que el anticuerpo purificado primaria impreso en la superficie de terreno 'ii'. En el paso 3 de la Cy3 etiquetados streptavidina secundaria se unen a la generación de anticuerpos fluorescentes señales en los puntos "i", "ii" y "iii". No se esperan reacciones en el lugar 'iv' donde Cy3-streptavidina sola etiqueta se imprimió.

Cada reactivo de la matriz se imprimió en una serie de dilución. Cada dilución de los distintos reactivos fue impreso por duplicado en la arrays. Dos matrices se procesaron los datos resultantes en 4 puntos por-por la concentración de reactivo. Este diseño experimental permite la determinación de la linealidad de cada vinculante reacción contribuir a la señal final, reproducibilidad de la reacción y de la saturación de cada uno si los hubiere, de las reacciones vinculante. La trama en la figura 3 se muestra la obligatoriedad de que todos los pasos descritos anteriormente se produjo en un lineal y reproducible la moda y no saturar. La figura 4 muestra una Western Blot donde extractos de las células F9 (carril 2) se probaron para la detección de p53 por el mismo anticuerpo que se utiliza en experimentos de la LMA. Lisados de bacterias sobre-expresión de la proteína p53 se utilizó como control positivo para p53 (carril 1). Estos datos demuestran la expresión de la proteína p53 en las células F9 y la especificidad de este anticuerpo como se indica en la única banda de p53 observados en el Western blot.

Reproducibilidad de la detección de la señal de LMA

Diluciones seriadas de las muestras de plasma humano normal se imprimieron en la membrana de vidrio revestida de diapositivas. Lisado existencias se utilizan para la impresión de 0,625, 1,25, 2,5 y 5 μ g / μ l. El volumen impreso por terreno por el robot se estima en 1 nl (Genómica Solutions, Inc Irvine, CA). El impreso cantidades de lisados en cada serie de dilución fueron 0,625, 1,25, 2,5 y 5 × 10 -9 g (nanogramos; ng). Impresión de buffer (PBS 1X) se utilizó como control negativo. Cada concentración de la muestra de plasma se imprimió 24 veces por cada variedad y de cada experimento se realizó por duplicado, resultando en un total de 48 puntos de datos por la concentración. Los arreglos fueron incubadas con un anticuerpo contra β-actina. Figura 5 (arriba) muestra los dos arrays, diluido en serie con muestras de izquierda a derecha en cada fila, en cada una de las 4 sub-arrays en el 2 arrays. La impresión de amortiguación fue avistada como control negativo en la quinta columna en cada sub-array. Una tercera serie procesado como un control negativo sin primario de anticuerpos se añadió al paso obligatorio, no mostró señales discernible (Figura 5 abajo). Las señales observadas en esta tercera serie se aproximaron a los antecedentes que sugiere no vinculante por la secundaria de anticuerpos en ausencia del anticuerpo primario. La Figura 6 muestra una parcela de correlación entre la intensidad de la señal y la cantidad de lisado impresa. Aumento de la cantidad de impresos lisado dado lugar a un correlativo aumento de la intensidad de la señal generada. El cuadro 2 muestra un resumen de las estadísticas de los datos generados. Para repeticiones de cada muestra manchas en los arrays, se calculó la media y SD y CV fueron determinados. Observamos un CV de 4.5-5.9% de los 48 puntos de datos lisado por importe impreso. Estos datos demuestran que la tecnología LMA puede potencialmente ser utilizado para detectar y reproducen las proteínas de muy pequeñas cantidades de lisado, menos de un nanogramo (625 picogramos) para la detección de β-actina de plasma humano. Figura 7 muestra un Western Blot donde 2 diferentes muestras de plasma humano se probaron para la detección de β-actina por el mismo anticuerpo que se utiliza en experimentos de la LMA. La única banda de 40 kD observado en el Western blot demuestra la especificidad de este anticuerpo para la β-actina.

Otras proteínas similares a prueba en la que participan los experimentos de detección de tubulina de plasma humano y de la insulina y la leptina de la diabetes muestras de suero (datos no presentados). En todos los casos, una correlación lineal entre la intensidad de la señal y la cantidad de lisado se observó y los datos muestran una alta reproducibilidad similar a la del conjunto de datos que aquí se presenta.

Sensibilidad de LMA

LMA con plasma humano lisado cantidades que van de 6 × 10 -12 g (6 picogramos; 6 pg) a 6 × 10 -15 g (6 femtograms 6; fg) se imprimieron y probaron de β-actina. Dos matrices que contienen 24 repeticiones de cada lisado cantidad se utilizaron para el experimento resulta en un total de 48 puntos de datos por la concentración. La figura 8 muestra las imágenes escaneadas de los 2 arrays cada uno con 4 sub-arrays. Diluido en serie las muestras se muestran de izquierda a derecha en cada fila, en cada una de las 4 sub-arrays. La impresión de amortiguación fue avistada como control negativo en la quinta columna en cada sub-array. Figura 9 muestra una parcela de correlación entre la intensidad de la señal y la cantidad de lisado. Resumen de los datos estadísticos se muestra en la Tabla 3. Los datos muestran que la media de la intensidad de la señal de lisado importes inferiores a 0,6 pg fue cercana a los generados por la impresión de amortiguación (1 × PBS en la figura 9], lo que indica lisado estas cantidades no eran óptimos para la detección de β-actina de estos ejemplos utilizando LMA. En lisado cantidades, de 0,6 y 6,66 pg la media intensidad de la señal es varias veces más alta (7 veces más alta después de 0,6 pg y 25 veces más altos que en 6,66 pg) que los antecedentes y los datos son reproducibles con un CV en el orden de 3.3-4.8 % (Figura 9 y Tabla 3]. Estos datos muestran que β-actina reproducibilidad puede ser detectado desde menos de un picogramo (600 femtograms), de plasma humano muestra impresa.

Aplicación de LMA: Verificación de los biomarcadores de proteínas de ateroma

En la serie de experimentos aquí descritos, la LMA tecnología se utilizó para detectar [a] apolipoproteína (apo [a]) y de apolipoproteína B100 (Apo B) en muestras de pacientes con aterosclerosis. Apo [a] exclusivamente en la figura de Lp [a] (lipoproteína [a], 30-31), mientras que la Apo B está presente en Lp [a], de LDL (lipoproteínas de baja densidad) y VLDL (muy baja densidad de la lipoproteína de 32; ). Lp [a] es un plasma de las lipoproteínas plasmáticas cuya concentración ha sido muy relacionada con las enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, estenosis coronaria cuantitativa determinada por angiografía; 30-31). Además, el plasma Lp [a] las concentraciones se asociaron significativamente con el tejido Lp [a] en los niveles resecado vena injertos de bypass y aneurismas de aorta [30, 31]. Estas observaciones sugieren que la Lp [a] pueden desempeñar un papel importante en la aterosclerosis se producen en otros lechos vasculares, como las arterias carótidas. Por ello, era bastante razonable para medir Lp [a] en carotídea placas obtenidas por la endarterectomía.

Desde la Lp [a] lipoproteína contiene una mol de apo [a] disulfuro vinculado a una molécula de ApoB [33], es posible calcular la cantidad de Lp [a] de la cantidad de medirse apo [a]. La ApoB, no vinculada a apo [a] en Lp [a], se supone que se presente en LDL. LDL es lo suficientemente pequeña como para penetrar en el revestimiento de íntima y se acumulan en el espacio subintimal. Desde VLDL es demasiado grande para acumular en este espacio y se integran en una lesión aterosclerótica, poca, o ninguna, de la ApoB presente en estas lesiones pueden atribuirse a VLDL. Por lo tanto, apo [a] y ApoB junto cuantificados permiten conocer la estimación de la cantidad de Lp [a] y LDL presentes en la placa de ateroma.

En las arterias carótidas, placa aterosclerótica se produce predominantemente en la bifurcación (B), sino también en el interior (I) y común (C) segmentos. La externa (S) segmentos suelen ser negativos para la placa. Anteriormente, ELISA ha demostrado ser un método eficaz para el perfil por encima de las proteínas en muestras de tejido de ateroma [34].

LMA tecnología se utiliza para la verificación de la presencia y de la cuantificación de estas proteínas marcadores de los diferentes segmentos (con y sin placa) de la arteria carótida 15 diferentes muestras de los pacientes (muestras-1014, 1023, 1042, 1098, 1103, 1117, 862, 865, 893, 989, 900, 904, 912, 935 y 979). Lisados se prepararon de 3-4 diferentes segmentos de un espécimen resecado endarterectomía de la arteria carótida para cada paciente (un total de 52 muestras). Diluciones seriadas purificado de Lp (a) (4 picogramos a 500 picogramos) y LDL (20 picogramos a 3 nanogramos) se imprimieron para preparar las curvas de calibración (complementario de los datos disponibles) para estimar la cantidad de estas proteínas en las diferentes muestras. Cada muestra fue impresa en una serie de dilución de 5 pasos y la cantidad de lisado impresos rango fue de unos 120 picogramos a 180 nanogramos. Cada dos matrices se probaron con anticuerpos de β-actina, apo [a] y Apo B. Cada dilución de cada muestra fue impreso por duplicado en cada serie de datos resultante en 4 puntos por-dilución por muestra. Dos matrices procesados en ausencia de un anticuerpo primario no generar señales discernible. El importe de la señal generada en los arrays determinada con apo [a] y Apo B, los anticuerpos fueron utilizados para estimar la cantidad de los dos marcadores de proteínas en las diferentes secciones para cada paciente con la ayuda de la norma de parcelas. La especificidad de los anticuerpos para la detección de apo [a] y Apo B ya ha sido demostrado y publicado [34, 35].

Citoesqueleto, como las proteínas β-actina pueden ser regulados diferencialmente durante la aterogénesis se determinó su estabilidad en estos casos para establecer β-actina como control viable. Con el fin de detectar cualquier variación en los niveles de β-actina, los niveles de β-actina de ateroma en las diferentes muestras fueron determinados. Los datos de 2 pacientes (muestras-1103 y 898) se muestra en la figura 10. El promedio de los niveles de β-actina de las muestras disponibles de las diferentes secciones (C, B, I, E) se muestran para cada paciente. No había muestras disponibles para el segmento E en los pacientes 898. Los datos no muestran una variación significativa en los niveles de β-actina por lo tanto, el establecimiento de esta proteína como un control estable en estas muestras válidas para su utilización como medio de la normalización de los datos. Similares datos se generaron para otras muestras del paciente.

Con el fin de validar los datos generados, alícuotas de la misma lisados (100 nanogramos a 1 microgramo) fueron utilizados para la verificación de la presencia y cuantificación de estas proteínas por ELISA, utilizando el mismo conjunto de anticuerpos. Norma parcelas fueron generados por ELISA (complementario de los datos disponibles), utilizando purificado de Lp (a) (1 nanogramo a 10 nanogramos) y LDL (10 nanogramos a 140 nanogramos) y utilizados para estimar las cantidades de estas proteínas presentes en la muestras de paciente. Figuras 11 (apo [a]) y 13 (Apo B), muestra correlación estadística de la estimación de las cantidades de proteínas obtenidas utilizando LMA y ELISA para los dos marcadores de proteínas. La correlación de la estimación de las cantidades de proteínas son muy importantes con el r 2 ≥ 0,98 (p ≤ 0.001) para apo [a] y r 2 ≥ 0,94 (p ≤ 0.001) para apo B. Cifras 12 (apo [a]) y 14 (Apo B) muestran comparativa histograma parcelas para el cálculo de las cantidades de proteína en cada sección de cada muestra del paciente incluidos en el estudio. Los perfiles de proteínas para las dos proteínas a través de las diferentes secciones variadas, pero entre los pacientes fueron similares para LMA y ELISA para todas las muestras.

Discusión

Actualmente se utilizan métodos de detección de proteínas marcador se basan en clásicos como métodos inmunológicos ELISA que no son adecuadas para la proteína de alto rendimiento de la detección de marcadores clínicos de muestras de tejidos humanos, en donde se muestra la limitación de las cantidades, como el láser o la captura microdissected muestra con aguja fina El aspirado de las muestras, debido a la relativamente gran cantidad de muestras necesarias para la prueba. Microarrays ofrecer un medio de la verificación de la presencia de marcadores de proteína en una forma de alto rendimiento, por lo general, en el orden de miles de muestras en un único experimento, utilizando mucho menor cantidad de muestra de lo necesario para ELISA. Hemos evaluado sistemáticamente LMA y optimizado para la impresión en la reproducibilidad, linealidad de la encuadernación, etiquetado y medidas de detección y de alta sensibilidad. Los datos presentados aquí establecer LMA como potencialmente poderosa tecnología para la verificación de la presencia y cuantificación de los marcadores de proteínas conocidas. Este es el primer estudio comparativo de los datos generados por el LMA y ELISA, que muestra una alta correlación entre las dos series de datos. La LMA reduce la cantidad de lisado de muestra requerido por tanto como 1,000 veces (nanogramo versus picogramo cantidades) en comparación con el ELISA. Nuestros datos mostraron un coeficiente de correlación, r 2 ≥ 0,98 (p ≤ 0.001) para apo [a] (figura 11] y r 2 ≥ 0,94 (p ≤ 0.001) para apo B (figura 13], entre LMA y ELISA datos.

En muy pocos casos la estimación de las cantidades de proteínas por la LMA y ELISA fueron significativamente diferentes. Creemos que esto puede ser debido a la naturaleza de las calcificaciones endarterectomía carotídea muestras, que pueden alterar la viscosidad de la muestra y, por tanto, puede interferir con los microarrays de impresión. La presencia de calcio en las muestras, junto con la sólida tecnología de impresión-pin (que es muy sensible al nivel de viscosidad de la muestra), de microarrayer utilizados para este estudio, podría hacer difícil para el calcificado muestras que se dispensan en un De forma precisa.

LMA ofrece un fácil medio de la verificación de la presencia de marcadores en una proteína de alto rendimiento. El formato de LMA, donde el lisado es inmovilizados en la superficie y determinada con un anticuerpo, proporciona un alto rendimiento, y también reduce la cantidad de muestras necesarias desde el lisado no es el factor limitante en el carácter vinculante experimentos. En LMA, la cantidad de anticuerpos en la solución excede de la cantidad de lisado en la superficie y, por lo tanto, las señales de vinculantes son un verdadero reflejo de la cantidad de proteína en el marcador lisado. Esto es crucial para la comparación de las muestras a través de los marcadores de proteínas.

LMA diluido en serie con proteínas purificadas se utilizan para preparar las curvas de calibración que puede permitir la cuantificación de las proteínas de interés en las muestras. En LMA, lisado muestras son dispuestos en una serie de dilución por lo tanto, dando por lo menos uno o más puntos de datos en el rango dinámico de la curva estándar de la proteína específica de la prueba de anticuerpos par.

La sensibilidad de la detección de la presencia de la proteína en LMA biomarcador es muy dependiente de la señal de detección y amplificación método empleado. En la mayoría de los estudios realizados hasta la fecha LMA utilizando una enzima mediada por la deposición de biotina-tyramide conjugados en el sitio de unión de los anticuerpos ha sido utilizado [36]. Aunque una sensibilidad en la femtogram gama que se ha logrado con esta tecnología [21], que sufre de saturación en los lugares en LMA que contienen altas cantidades de la proteína de interés, debido a la incapacidad de controlar la reacción enzimática [28]. Hemos demostrado la detección de β-actina proteína de plasma humano muestras de 600 femtograms (10 -15 gramos) de proteínas utilizando un lisado no enzimáticos método de detección de la señal. Desde β-actina es una proteína abundante, esperamos que la LMA sensibilidad para la detección de las proteínas menos abundantes a no ser tan alta.

El valor y la aplicación de la LMA se entiende mejor en estudios con grandes ensayos clínicos. En estos ensayos clínicos, la presencia y el nivel de biomarcadores de proteínas (hasta 10) en un grupo de pacientes (100-1000 o más) puede ser necesario determinar. El número de proteínas es demasiado pequeño para una variedad de anticuerpos, y el rendimiento de la cantidad de muestras procesadas, utilizando anticuerpos serie es muestra de un paciente a la vez. Si se utilizan matrices de anticuerpos para este estudio, 100-1000 o más arrays será necesario (una serie de muestras por paciente), mientras que el LMA con este estudio se puede completar con 10 matrices con todas las muestras de pacientes dispuestos en cada serie y con un sondeo de anticuerpos Por la matriz. LMA También sería útil utilizar la tecnología para cuando un gran número de muestras archivadas (en miles) necesidad de ser interrogado por un conjunto predefinido de los marcadores de proteínas.

Utilizando ELISA, la cantidad de material de partida (lisados) requerido es de por lo menos 10 veces superior a LMA y el rendimiento del número de muestras procesadas mediante la prueba ELISA es sólo el 96 por placa (8-200 muestras por experimento usando SELDI-TOF MS). Uso de LMA, hasta 4000 muestras de los pacientes pueden ser ensayadas para la detección de una única proteína, de manera simultánea en un solo experimento, el simple uso de los medios de arraying, la hibridación y la imagen, sin dejar de mantener controles de calidad en cada paso. Dado que la cantidad de muestra requerido por lugar está a pocos picogramos, muchas proteínas se puede estimar (aunque uno a la vez) a través de LMA. Así, LMA ofrecen una forma más rápida, más fácil y más barato (una sola diapositiva en LMA frente a muchas diapositivas de anticuerpos en arrays) método de estudio para los grandes ensayos clínicos.

Un requisito esencial para la aplicación de la LMA como una proteína de alto rendimiento biomarcador es herramienta de poder y el proceso de generar la proteína lisados de las muestras de paciente en un igualmente alto rendimiento. Esto se puede lograr un mínimo de personalización de cualquiera de los varios líquidos de manipulación robótica set-ups comercialmente disponibles en la actualidad. Los protocolos aprobados para la generación de lisado se depende de la fuente de las muestras, como por ejemplo, el suero, etc biopsias Con capacidad actual de la robótica cientos de muestras podría ser lisadas directamente en placas de microtitulación y preparado para la impresión de LMA, que puede utilizar como Entrada de las placas de impresión para un robot, lo que exige un mínimo de muestras de manipulación.

Conclusión

Hemos demostrado el uso y aplicabilidad de la tecnología de microarrays lisado para la detección y cuantificación de los pre-determinada proteína marcadores. La alta sensibilidad (reduce la cantidad de muestras necesarias de entrada) y formato de miniatura (aumenta el número de muestras ensayadas en una sola diapositiva) de la tecnología LMA, lo hace adecuado para la realización de estudios como los grandes ensayos clínicos donde miles de muestras (disponible en cantidades limitadas) Puede ser necesario interrogado nivel de la expresión de un conjunto definido de los marcadores de proteínas. LMA puede utilizarse para estimar la cantidad de proteínas específicas presentes en estas muestras mediante la generación de estándar de las parcelas correspondientes preparados utilizando proteínas purificadas dispuestos en la LMA. El análisis comparativo de datos de LMA y ELISA datos muestran que los datos son altamente correlativos (en más del 90% de las muestras) que indica que el LMA puede potencialmente ser utilizado como una herramienta de diagnóstico para la verificación de la presencia y cuantificación de marcadores específicos de la proteína en muestras clínicas Donde la muestra son la limitación de las cantidades.

Métodos
Purificado proteínas, anticuerpos, cultivo de células y las muestras de paciente

Purificado proteínas p53 (sc-4246, humano) y p53 (C-19, de cabra policlonal), se compraron Tecnologías de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). El anticuerpo de β-actina (AC-15, monoclonales) se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Anticuerpos policlonales para apo [a] y Apo B se suscitaron en el cabra y purificado como se describe anteriormente [34, 35]. Anticuerpos con biotina secundario se compraron de Vector Laboratories (Burlingame, CA).

F9 células se cultivaron en Dulbecco modificado esenciales del medio (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), complementado con un 10% de suero fetal bovina. Todas las células fueron cultivadas a 80% confluency en placas de 10 cm a 37 ° C. Las células fueron lavadas dos veces en 1XPBS y "pellets" de células se almacenaron a -70 ° C hasta nuevo uso. Lisados de bacterias más de expresar la proteína p53 fueron un regalo del Dr Guillermina Lozano [37]. Plasma humano normal y quirúrgico muestras de tejido se obtuvieron en virtud de un protocolo aprobado por el Comité de Investigación Humanos de la Facultad de Medicina Baylor, Houston, TX.

Procesamiento de tejidos

Se obtuvieron muestras de tejido en la endarterectomía carotídea aterosclerótica de las arterias de los pacientes inscritos en un estudio cardiovascular en el Hospital Metodista (Houston, TX) y se almacena inmediatamente después de la cirugía en PBS que contenía 50% de glicerol a -20 ° C hasta imágenes o analizados. Clase en la arteria carótida tejido creado en la cirugía se cerraron por recocido partes enfrentadas con el súper a fin de recuperar el espacio de relaciones en el tejido. El tejido se rayos x usando un analizador FAXITRON para identificar las áreas de calcificación y guía posterior disección. Después de la resonancia magnetica (MRI), el tejido se caracterizó por una fina línea de tinta de la India lo largo del eje longitudinal. Transversal segmentos de 3 mm de longitud (corresponde a la RM rebanada de espesor) fueron cortadas con un bisturí, a partir de la bifurcación, y la común, áreas internas y externas de las arterias. Segmentos se entintado en el extremo proximal de preservar la correcta de extremo a extremo relación. Segmentos (100 mg) fueron trasladados a los tubos de plástico de 15 ml que contiene 3 ml de buffer de extracción (50 mM Hepes, pH7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10 mM de pirofosfato de sodio, 100 mM NaF, 1,5 mM MgCl2, 10 Glicerol%, 1% Tritón X-100, pH 7.4), luego homogeneizado a 10 ° C durante 10-20 segundos (Polytron, Brinkmann). El homogenado se centrifuga a 3500 rpm durante 30 min y el sobrenadante decantada para el almacenamiento de -80 ° C hasta el análisis.

Preparación de células lisado

Los gránulos de las células F9 y muestras de los pacientes se suspendieron en la extracción de amortiguación (como arriba) que contiene 0.5X cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). El lisado celular se incubó en hielo durante 30 min seguido de centrifugación a 4 ° C, 14000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. La concentración de proteínas se midió usando el ensayo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) según las instrucciones del fabricante. Las proteínas fueron solubilizados por adición de un tercer volumen de amortiguación 4X SDS (0,25 M Tris.HCl, pH 6,8, el 40% de glicerol, el 8% SDS y 10% β-mercaptoetanol) y desnaturalizado a 94 ° C durante 5 min. Alícuotas de los extractos que contengan proteínas desnaturalizado se almacenaron a -70 ° C. Muestras de plasma y purificado las proteínas fueron desnaturalizados directamente en el buffer 4X SDS como anteriormente.

Array fabricación y de procesamiento

La serie lisados fueron diluidos en 1 X-buffer fosfato salino (PBS, Invitrogen, Carlsbad, CA), a la concentración deseada y trasladado a un 384 y placa (20 μ l / así; Fisher Científico, Pittsburg, PA). Los lisados se imprimieron en la membrana de vidrio revestida de diapositivas (FAST diapositivas, Schleicher y Schuell Bioscience, Keene, NH) utilizando el robot Flexys (Genómica soluciones, Ann Arbor, MI). Flexys sólidos es un robot con un pin impresos importe estimado de 1 por cada spot nl (Genómica Solutions, Inc Irvine, CA). Todas las muestras fueron impresas en una serie de dilución de 4 o más pasos. Dos o más repeticiones de cada muestra fueron impresos por la concentración y variedad cada experimento conjunto incluido 2 o más matrices (2 o más diapositivas). Los arreglos fueron almacenadas a 4 ° C hasta nuevo uso.

No específico sobre la unión de los vectores fueron bloqueados por adición de 10 ml de 1 X Lavar / Bloque de amortiguación (Fast Pak2 proteína matriz kit, Schleicher y Schuell Bioscience, Keene, NH), y con el suave balanceo de incubación, durante 2 horas a temperatura ambiente . El exceso es drenado de amortiguación frente a los arrays sin permitir que se seque. Esto fue seguido por medio de la unión con 50 μ l de primaria de anticuerpos a una concentración de 10 ng / μ l en 1XPBS al 0,5% de Tween-20 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y un 5% de la albúmina sérica bovina (BSA, Sigma-Aldrich , St Louis, MO). El conjunto se cubre con una hoja de cubierta y se incuba en una cámara húmeda noche a la mañana (15-16 h) a 4 ° C. Las láminas fueron lavadas en 1 X Lavar / Bloque de amortiguación por 5 min con suave balanceo a temperatura ambiente para eliminar la hoja de la cubierta. Cada diapositiva fue cuidadosamente eliminado de la Lavar / Bloque de buffer permitiendo que el exceso de amortiguación frente a la fuga de los arrays sin permitir que se seque. A continuación, 50 μ l buffer (50 mM Tris pH 7,5, 1,5 M NaCl y 0,1% de Tween-20), que contiene secundaria de anticuerpos con biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a una concentración de 5 ng / μ l fue agregado a los arreglos y una portada Desliz se incluyó en el arrays. Los arreglos fueron incubadas en cámara húmeda a temperatura ambiente durante 1 h.

Las láminas fueron lavadas en 1 X Lavar / Bloque de amortiguación por 5 min con suave balanceo a temperatura ambiente para eliminar el coverslip. Las láminas fueron retirados del lavado / Bloque de buffer permitiendo que el exceso de amortiguación frente a la fuga de los arrays sin permitir que se seque. Cyanine 3/Cyanine 5 (Cy3/Cy5)-etiquetados streptavidina tintes (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) se reconstituye en el agua a una población de 1 mg / ml. A continuación, 50 μ l de la Cy3/Cy5-labeled streptavidina (1:3 (v / v) en 1XPBS) se añadió a la matriz y cubierto con una hoja de cubierta. Los arreglos fueron incubadas en cámara húmeda oscuridad a temperatura ambiente durante 1 h. Las láminas fueron lavadas en 1 X Lavar / Bloque de amortiguación por 5 min con suave balanceo a temperatura ambiente para eliminar la hoja de la cubierta. Las diapositivas fueron eliminados de la bandeja de lavado, colocados en un tubo de 50 ml y secado por centrifugado en el 1,5 rcf durante 90 segundos en una clínica de centrifugación.

Monofunctional NHS formas de ésteres (compuestos de etiquetado que contienen grupos amino libre), de Cy3 y Cy5 monoreactive tintes (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) fueron utilizadas para caracterizar proteínas lisados. 100 μ l de 0,1 M de carbonato de sodio buffer (pH 8.0) se agregó a cada una de las Cy3 y Cy5 monoreactive tintes (para producir un stock de 10 mg / ml) y 25 μ l de la tintura (Cy3 o Cy5) fue añadido a diferentes cantidades De proteína / lisado a ser etiquetada. El volumen final de la solución se ajustó a 35 μ l uso de carbonato de sodio 0,1 M buffer (pH 8.0). La proteína-colorante mezcla se incubó a 4 ° C durante 1 hora y agita suavemente cada 10 min. Esto fue seguido de la adición de 3,5 μ l de 1 M Tris.HCl (pH 8,0) y 1XPBS para dar un volumen final de 500 μ l. La solución de proteína se concentró con la superación de las microempresas a través de un concentrador spin columna (Amicon-Microcon YM-10 columna, Millipore, Billerica, MA) y centrifugado a 14000 rcf durante 25 minutos, reducir el volumen a 30 μ l. Este paso también facilitó la eliminación de las moléculas de colorante no incorporado de la etiqueta de proteínas solución.

ELISA

ELISA se realizó como se describe anteriormente por nosotros [29]. En resumen, 100 μ l purificada diluida en serie de Lp (a) o LDL (a partir de un stock de 1 mg de proteína / ml en PBS, pH7.2) se agregaron a 96-y placas de microtitulación (Dynatech Labs, Alexandria, VA) y se incubaron Durante 2 horas a temperatura ambiente (RT). Dos pozos quedaron sin revestir para servir como controles. Las placas se lavaron sucesivamente con PBS-BSA (PBS que contenga el 0,5% de BSA) y PBS. Las placas fueron incubadas con PBS-BSA durante 2 horas a RT, y luego la noche a 4 ° C. Diluciones apropiadas (preparado en PBS-BSA), de homgenate supernanants preparado a partir de muestras de tejidos de ateroma se mezcla con el anticuerpo contra el apo [a] o Apo B (1: 5000 dilución) y se añadirán a las placas. Antibody diluida en PBS-BSA fue agregado a los pozos sin revestir. Las placas fueron incubadas durante 2 horas a RT, y luego la noche a 4 ° C. Las placas fueron lavadas como antes y se incubaron con un conjugado de peroxidasa secundaria de anticuerpos que es inmunorreactiva en contra de la especie IgG (anti-IgG HRP-1;: 2500 dilución; Cappel laboratorios, Cochranville, PA), seguido de la incubación en RT y de 2 h Lavado. Sustrato solución fue preparada por la disolución de 10 mg de o-fenilendiamina en 25 ml de buffer fosfato-citrato (24,3 mM citrato, el 51,2 mM fosfato, pH 5,0) con 10 μ l de 30% de H 2 O 2. Siguiente 160 μ l de solución de sustrato se añadió a cada pozo, la reacción realizadas por 30-60 min a TA y luego apagado por la adición de 40 μ l de ácido sulfúrico 2,5 N. Absorbancia a 492 nm se midió utilizando un lector de placas (Titertek Multiskan Plus MKII placa de microtitulación lector, Flow Laboratories). Los valores de absorbancia de las muestras se equipara a Lp [a] LDL o proteínas utilizando las curvas de calibración generadas con lipoproteínas purificado, cuyo contenido en proteínas había sido previamente medido por ensayo de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA).

Western blot

Treinta desnaturalizado microgramos de lisados fueron objeto de 10% de sulfato de sodio dodecil-electroforesis en gel de poliacrilamida. Después de la electroforesis, Western Blot se realizó a través de membranas de nitrocelulosa Hybond (Amersham, Piscataway, NJ) según las instrucciones del fabricante protocolos. Después de la proteína de transferencia, las membranas se lavaron y 1XPBS bloqueado en una solución tampón que contiene 0,3% de Tween 20 y el 5% para la leche en la RT 15 min y se incubaron con el anticuerpo primario respectivos (en la dilución 1:1000 en 1XPBS que contiene 0,3% de Tween 20 y el 5% de BSA ) La noche a 4 ° C en un agitador. Las membranas se lavaron 3 veces con PBST (1XPBS que contiene 0,3% de Tween 20) por 10 min a TA y, posteriormente, cada vez que se incubaron con las respectivas secundaria de anticuerpos (1:1000-3000 dilución de conjugado HRP-anti-IgG de conejo, anti-ratón IgG o anti-conejo IgG en 1XPBS que contiene 0,3% de Tween 20 y el 5% de BSA; Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) durante 1 h con agitación a TA. Los blots fueron lavados con PBST como antes y las bandas de proteínas se detectaron utilizando ECL Plus "Western Blotting Detección Reactivos (Amersham, Piscataway, NJ).

Imágenes y análisis de datos

Todas las imágenes fueron microarrays a 10 μ resolución utilizando un doble láser-escáner (GenePix 4000; Axon Instruments, Union City, CA) para capturar la intensidad de las señales de fluorescencia para Cy3 en Cy5 o 532 nm a 635 nm. Adquisición de imágenes y la cuantificación se realizaron con GenePix Pro 4.1 (Axon Instruments, Union City, CA). La intensidad de la señal en cada uno de los cuales se determina restando de la mediana intensidad de los píxeles de fondo de la intensidad media de los conocimientos adquiridos píxeles. Estos antecedentes han corregido valores de intensidad fueron truncados por la sustitución de los valores negativos o cero por el valor límite de 1.

Para algunos análisis, la señal intensidades fueron transformados por la computación el logaritmo (base dos). Para repeticiones de cada muestra manchas en cada gama, media, desviación estándar (DE) y coeficiente de variación (CV) fueron calculados. Para analizar los datos para determinar el rendimiento de diferentes reacciones vinculante, adaptamosuna Lineal Generalizado modelo mixto con la pendiente común para registro de la concentración, de efectos fijos para el paso específico vinculante con Cy3 como el grupo de referencia y para la gama de efectos aleatorios. La respuesta fue log intensidad. Dado que la intensidad fue transformada logarítmica de base dos, de dos a la diferencia de potencia de las intersecciones entre las diferentes reacciones fue la razón de las intensidades, que representa la cantidad relativa de la señal para la reacción específica. Se utilizó Cy3-streptavidina como referencia y calculado los ratios de otras señales de reacción se basa en él. Esto dio lugar a la relativa señal concreta de la señal en comparación con Cy3.

Para la comparación de los datos generados utilizando ELISA y LMA, mismo conjunto de proteínas lisados fueron utilizados para experimentos LMA y ELISA. Norma parcelas fueron generados utilizando proteínas purificadas para ambas tecnologías. El estándar parcelas fueron utilizadas para estimar la cantidad de las proteínas específicas de cada muestra. SigmaPlot (Soluciones de Estadística, Saugus, MA) fue utilizado para determinar la correlación entre la proteína en cantidades estimadas por cada muestra LMA y ELISA experimentos.

Lista de las abreviaturas

LMA (lisado microarrays), ELISA (ensayo inmunoenzimático), apo [a] (apolipoproteína [a]), LDL (lipoproteínas de baja densidad), Apo B (apolipoproteína B)

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

AR realizado experimentos de los microarrays, imágenes y los datos cuantificados. EL participó en el análisis de datos. IC realizó el ELISA en la muestras de ateroma. RM participado en el diseño y análisis de los datos muestra aterosclerótica. JM proporcionó a la aterosclerosis y coordinado de las muestras ELISA experimentos. KC participó en el análisis de datos. ZJ realizó el Western blot. MK concebido del estudio, participó en el diseño y elaboró el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado conjuntamente por la UT MD Anderson Cancer Center de subvención institucional a MK, de subvención # 1 R03 CA011006-01 de NCI y conceder a MK # HL63090 a JM.