Journal of Carcinogenesis, 2006; 5: 1-1 (más artículos en esta revista)

CytoregR inhibe el crecimiento y la proliferación de las células de adenocarcinoma humano a través de la inducción de la apoptosis

BioMed Central
J Kumi-Diaka (jdiaka@fau.edu) [1], Hassanhi M (manzurhas@cantv.net) [2], J Brown (jbrow146@fau.edu) [1], K Merchant (kmerchan@fau.edu) [1], C García (cgarcia@cytorex.com) [3], W Jiménez (wjimenez@cytorex.com) [3]
[1] Department of Biological Sciences, Florida Atlantic University, Davie FL, 33314, USA
[2] Facultad de Medicina, División de Banco de Sangre, de la Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela
[3] Cytorex BioSciences Inc 2700 Glades Circle # 138, Weston FL. 3331, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

El cáncer es uno de los devastadores neovascular enfermedades que incapacitan a tantas personas en todo el mundo. Los recientes informes del Instituto Nacional del Cáncer indican algunos significativa ganancia de la terapia del cáncer y de gestión como se ha visto en el aumento de los 5 años la tasa de supervivencia en los dos últimos decenios. Aunque casi perfecto tasa de curación han sido reportados en la etapa temprana de la enfermedad, estos datos revelan alta tasa de recurrencia y de efectos secundarios graves incluidas las segundas neoplasias y de muertes. La mayoría de los agentes que actualmente se utilizan contra el cáncer sólo son eficaces contra la proliferación de las células cancerosas. Así, la atención se ha centrado en el potencial de lucha contra el cáncer de agentes capaces de matar las células del cáncer independiente del ciclo celular estado, para garantizar la eliminación efectiva de la mayoría de las células del cáncer. El objetivo de este estudio fue probar la chemosensitivity y potencial mecanismo de acción de una novela de cáncer de drogas, CytoregR, en un grupo de células humanas de cáncer.

Métodos

El estudio se realizó a través de una serie de bioensayos incluidos azul de Trypán exclusión, la inhibición del crecimiento de MTS, LDH-citotoxicidad, TUNEL-Terminal Apoptosis la fragmentación del ADN de ensayo, y la actividad de la caspasa CPP32 ensayos de la proteasa.

Resultados

Cytoreg R se asociaron con una dosis-y tiempo-dependiente de la inhibición del crecimiento en todas las células; con diferencias significativas en chemosensitivity (P <0,05) entre las células objetivo cada vez más evidentes a las 48 h de exposición. CytoregR no mostró ningún efecto significativo en las células normales en relación con las células del tumor. La inhibición del crecimiento en todas las células se debe a la inducción de la apoptosis en concentraciones más bajas de cytoregR (> 1:300). CytoregR inducida por la proteasa caspasa-3 (CPP32) activación significativa y positivamente correlacionada con la inducción de la apoptosis y la inhibición de crecimiento; CPP32 lo que plantea como principal vía de la muerte en cytoregR inducida por apoptosis.

Conclusión

CytoregR ejercido una dosis-y tiempo-dependiente efecto inhibitorio del crecimiento en todas las células diana a través de la inducción de la apoptosis a través de la vía CPP32 muerte, independiente de la sensibilidad hormonal de las células. Los datos actuales indican que no sólo CPP32 podría proporcionar un objetivo potencial para la regulación de la apoptosis inducida por cytoregR sino también cytoregR que podría desempeñar un papel importante en el régimen de quimioterapia en muchos tumores malignos humanos.

Introducción

El cáncer es uno de los devastadores neovascular enfermedades que incapacitan a tantas personas en todo el mundo. Es una de las principales causas principales de muerte en el mundo occidental. Continua búsqueda de la cura y la prevención en los últimos años parece estar dando resultados alentadores y esto le da el impulso necesario para continuar la búsqueda de regímenes terapéuticos eficaces contra esta inflexible enfermedades humanas y animales. Progresos significativos en la lucha contra el cáncer humano se ha hecho desde principios del decenio de 1960. Los recientes informes del Instituto Nacional del Cáncer [1] y la Sociedad Americana del Cáncer [2] indican algunas significativas ganancias durante los quemarse de cáncer como se ha visto en el aumento de los 5 años la tasa de supervivencia en los dos últimos decenios. En general, las tasas de incidencia de cáncer cayó el 0,5 por ciento por año de 1991 a 2001, mientras que las tasas de mortalidad de todos los cánceres combinados se redujo 1,1 por ciento por año de 1993 a 2001 [1]. Las tasas de mortalidad de todos los cánceres combinados han estado disminuyendo desde principios del decenio de 1990. Las tasas de mortalidad disminuyeron en el caso de 11 de los 15 principales tipos de cáncer en los hombres, y ocho de los 15 principales tipos de cáncer en la mujer. Las tasas de muertes por cáncer de pulmón entre las mujeres estabilizado por primera vez entre 1995 y 2001, después de un incremento constante durante muchas décadas [1]. El informe de este año indican que entre los períodos 1975-1979 y 1995-2000 los cinco años del cáncer de mejorar la tasa de supervivencia para la mayoría de los 15 principales tipos de cáncer en hombres y mujeres, y los primeros diez lugares en los niños [1]. Sin embargo, la tasa de incidencia de cáncer de mama en las mujeres es uno de los tipos de cáncer que siguen aumentando. Y en los hombres, aunque se hacen avances significativos en las tasas de supervivencia en muchos tipos de cáncer incluyendo el de próstata, la tasa de incidencia en el cáncer de próstata va en aumento [1]. Además, la incidencia de cáncer testicular ha aumentado de tres pliegues durante los últimos 40 años especialmente en la raza caucásica hombres jóvenes de 15 a 35 años de edad [3 - 5], a pesar de la alta sensibilidad de este tipo de cáncer al tratamiento. El riesgo de desarrollar cáncer testicular en la vida de un hombre es de aproximadamente 1 en 500 se producen en aproximadamente 1 de cada 25000 hombres por año [2]. Cáncer testicular es 4 veces más común en los caucásicos que en los hombres afro-americanos, con tasas de incidencia intermedia entre los nativos americanos, los hispanos y los asiáticos [6, 7]. Es la tercera (14,3% de todos los cánceres masculinos), el cáncer más comúnmente diagnosticado en los varones de edades entre los 15-19 años [8]. Cáncer testicular ha demostrado las tasas de curación más altas de todos los cánceres humanos. La mayoría de los pacientes con cáncer, especialmente los diagnosticados en la fase inicial, ya pueden esperar sobrevivir a la enfermedad [9, 10]. Satisfactorio tasa de supervivencia se ha logrado en la enfermedad metastásica avanzada mediante el uso de la terapéutica enfoque multidisciplinario [9, 11]. Aunque casi perfecto tasa de curación con quimioterapia se han notificado en una fase temprana [10], estos resultados revelan alta tasa de recurrencia, graves efectos secundarios [11 - 13], y la progresión de la enfermedad (tumores malignos secundarios) inducida por tratamiento y muertes.

La mayoría de los agentes que actualmente se utilizan contra el cáncer sólo son eficaces contra la proliferación de las células del cáncer [22]. Esto en parte el alto post-tratamiento tasa de recurrencia de cáncer de testículo. Actualmente, la atención se centró en el potencial de lucha contra el cáncer de agentes capaces de inducir la apoptosis de células de muerte independiente de la del ciclo celular estado, para garantizar la eliminación efectiva de todas o la mayoría de las células del cáncer. Uno de estos reactivos de interés es la novela de drogas, cytoregR

Cytoreg ® es un nuevo fármaco contra el cáncer que utiliza candidato hydrofluoric como los ácidos sulfúrico y compuestos activos. El producto es un farmacológicamente activas mezcla de bajo pH ácido (pH <1,0), de los cuales ácido fluorhídrico (HF) y ácido sulfúrico (H 2 SO 4) son los principios activos. El ion fluoruro en cytoreg induce la síntesis de las interleucinas-1 y 6 (IL-1, IL-6), factor necrótico tumoral alfa (TNF α), y factores estimulantes de granulocitos y macrófagos. IL-1 activa las células T y otras citoquinas. La IL-1 es conocido como quimio-protectora y radiosensitive, la protección de los animales contra la mielosupresión. Cytorex se centra en developingcompounds para tratar el cáncer y las enfermedades de base inmunológica. Cytorex tiene en todo el mundo los derechos de propiedad intelectual de Cytoreg ® y CytoregUNO ™ [30].

Cytoreg ® ha demostrado actividad anticancerígena en una batería de células humanas de cáncer en estudios in vitro en nuestro laboratorio, y la escasez de pre-preliminar de los estudios clínicos en otros lugares. Varios estudios preliminares in vitro en nuestro laboratorio indican que cytoregR inhibe el crecimiento y la proliferación a través de la inducción de la apoptosis en una batería de células de cáncer humano. En este estudio la hipótesis de que la cytoregR induce la inhibición del crecimiento de la próstata, de mama y de las células del cáncer de testículo a través de la inducción de la apoptosis. El objetivo de este estudio fue evaluar el grado de potencial chemosensitivity de cytoregR a estas células de cáncer y el mecanismo de acción del fármaco en las células objetivo.

Materiales y métodos
Productos Químicos

Medios de cultivo (RPMI 1640 completo), antibióticos, suero fetal bovino (SFB), la tripsina-EDTA, la cultura y otros materiales fueron comprados de la Ciencia Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). El kit de caspasa (Ac-DEV-AFC/z-VAD-fmk) fue de Geno Tech Inc St Louis MO.

Prueba de agentes

Cytoreg ® fue suministrado por Cytorex Biosciences, Inc

Líneas celulares

GI-101, un estrógeno-independiente metastásico de células humanas de cáncer de mama, se obtuvo de Rambaugh Goodwin-Instituto de investigación del Cáncer (RGI) en Plantation FL; MCF-7, el estrógeno-dependientes de las células del cáncer de mama, fueron inicialmente obtenidos de la American Type Culture Collection (ATCC) y mantenido en nuestro laboratorio; PC3, andrógeno-dependientes de las células de adenocarcinoma de próstata humano, fueron inicialmente obtenidos de la ATCC y mantenidos en nuestro laboratorio. Otras células del cáncer humano originalmente obtenido de ATCC fueron: LNCaP, independiente de andrógeno-adenocarcinoma de próstata; INTERA-2 cl.D1, andrógeno-dependientes humanos adenocarcinoma de células de los testículos, y 1.Tes Hs, testículo humano normal líneas celulares (nPL ) Normal primaria de células de placenta humana son una cortesía de la Profesora Manzur Hassanhi (Colegio de Medicina de la Universidad del Zulia, Maracaibo, Venezuela). Todas las células fueron cultivadas y mantenidas en humidificado ambiente a 37 ° Cy 5% de CO 2 en RPMI1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), 2 mM de glutamina y de 100 U / mL de penicilina + 100 mg / mL de estreptomicina ( Sigma, St Louis, MO. EE.UU.).

El cultivo de drogas y el tratamiento de las células

Las células se chapada y se vació en los pozos de 96-y placas microtiter (MTP), con una concentración de 2 × 10 3 células / así en el 100 μ l volúmenes, y se incubaron durante 48 horas a 37 ° C en un ambiente humidificado contiene 5% de CO 2 Para permitir el cumplimiento, antes de la exposición a diversas concentraciones o diluciones de cytoregR (2000, 1000, 500, 200, 100, 50 diluciones, la más alta dilución siendo la más baja la concentración de la exposición, y el más bajo es el más alto de dilución de la concentración de la exposición). Brevemente, las células fueron tratadas con la concentración predeterminados por triplicado y cultivadas / humidificado crecido en el ambiente a 37 ° Cy 5% de CO 2 durante un máximo de 48 hr. Post-tratamiento. Después de las 48 h de incubación, se recolectaron los sobrenadantes y congelados de lactato deshidrogenasa (LDH) determinación; el adherente células fueron evaluados para el tratamiento posterior a la viabilidad utilizando azul de Trypán ensayos de la exclusión y la MST. La información sobre el número de células con respecto a los controles es importante a fin de determinar si se cytoregR tóxicos o simplemente frenar o inhibir la replicación celular. TUNEL El ensayo se utilizó para determinar el tratamiento en la apoptosis inducida por las células, y la caspasa-3 proteasa participación en la apoptosis inducida por cytoregR se evaluó como se describe a continuación: El experimento se repitió dos veces con la misma dosis varía de cuantificar actividad inhibidora del crecimiento.

Resultados
Inhibición del crecimiento de células

Cytoreg ® fue examinado por su capacidad para inhibir el crecimiento y proliferación de un grupo de células del cáncer humano [células del cáncer de mama - GI-101, MCF-7; células de cáncer de próstata - PC3, LNCaP; células de cáncer de testículo - INTERA-2 cl.D1 ; Normal de la placenta humana - nPL; testículo humano normal principal línea celular - Hs 1.Tes]. Cytoreg R se añadió al adherente células directamente en diluciones de 50, 100, 200, 500, 1000, y 2000, tal como se describe en los materiales. Los datos obtenidos revelaron que Cytoreg R se asociaron con una dosis-y tiempo-dependiente de la inhibición de la proliferación y el crecimiento en todas las células, con diferencias significativas en chemosensitivity (P <0,05 - P <0,01) en las diferentes células del cáncer que se resumen en Figs 1 , 2, 3 y la Tabla 1. Diferencia de chemosensitivity a cytoregR aumentó con el tiempo de exposición, más evidente a las 48 h de incubación. La tinción de azul de Trypán exclusión indicó que la viabilidad de células disminuyó significativamente en todos los tipos de células con el aumento de la concentración de la exposición Cytoreg R, pero no un efecto significativo sobre las células normales en relación con las células del tumor en la pH7.1 fisiológicas (la dilución 1:500), de Cytoreg R [Figs 1, 2, 3, 4]. Negativos significativos se encontraron correlaciones entre el MST y la LDH y azul de Trypán actividades (r = -. 75, P <0,01), y correlaciones positivas significativas entre MTS y azul de Trypán ensayos de exclusión (r = 63, P <0,01). Estos resultados indican la validez y precisión de los datos obtenidos. Significativo tratamiento inducida por cambios morfológicos indicativos de la muerte de las células y la inhibición del crecimiento se observó en todas las celdas con el aumento de la concentración de cytoregR.

Tratamiento de la apoptosis inducida

TUNEL El análisis de la fragmentación del ADN se utiliza para determinar el modo de la muerte celular en la inhibición del crecimiento de células en el tratamiento tal y como se describe en los métodos. Figs 4, 5 y Tabla 1 reveló que CytoregR indujo apoptosis en la principal modalidad de inhibición del crecimiento en el grupo de células estudiadas, en una forma dependiente de la dosis, y con diferencias significativas en chemosensitivity (P <0,01) entre las células. La normal, no las células del cáncer, y nPL Hs 1.Tes células testiculares, no se vieron afectados significativamente (P <0,05) por CytoregR fisiológicas en la pH7.1 (1:500 dilución). Sin embargo, con el aumento de las concentraciones de la exposición (diluciones inferiores, 200 - 50) la muerte de las células debido a la necrosis aumentado significativamente coincidiendo con la disminución de la muerte de las células apoptóticas (Figs 4, 5, Tabla 1]. Las clásicas características de la apoptosis - encogimiento celular, la condensación nuclear, formación de cuerpos apoptóticos-se observaron en todas las células (Fig 7-microphotos], en diversos grados, lo que indica que la inhibición del crecimiento fue predominantemente debido a la apoptosis inducida por el tratamiento.

Para determinar la relación entre la inhibición del crecimiento y la inducción de la apoptosis, se correlacionó el porcentaje de células viables con el porcentaje de apoptosis inducida. Fig 5 reveló que la disminución de la viabilidad (el aumento de la inhibición del crecimiento) simultáneamente en paralelo aumento de la tasa de inducción de la apoptosis en las células. En general, los datos pusieron de manifiesto una significativa correlación negativa entre MTS / Trypán azul de la exclusión y la inducción de la apoptosis (r = -0,67, P <0,01).

Para determinar la posibilidad de que participen en la proteasa caspasa 3 en el mecanismo molecular de Cytoreg R inducida por la apoptosis, las células fueron tratadas con Cytoreg R co-administrarse con o sin inhibidor CPP32 (DEVD-fmk), y luego cultivadas a lo descrito previamente. Post-tratamiento de la apoptosis se determinó que se describió anteriormente. CytoregR induce la expresión de CPP32 en todas las células, con la consiguiente inducción de la apoptosis; coherentes con observaciones anteriores en las células tratadas genistein-(Kumi-Diaka et al, NA Alexis Sanderson y Hall, 2000). Como se muestra en la Figura 6, el tratamiento de la expresión inducida por la caspasa-3 proteasa (CPP32) se correlacionaron con la apoptosis inducida por el tratamiento en todas las células, con la manifestación de la dependencia de la dosis Cytoreg R. Se observó que el bloqueo de CPP32 con el inhibidor de la caspasa-3, DEVD-fmk, significativamente (P <0,001) la reducción de la inducción de apoptosis en las células cancerosas, que indica el importante papel de la CPP32 molecular en la vía de Cytoreg R-indujo apoptosis en El grupo de células estudiadas, de acuerdo con las observaciones de otros estudios anteriores. El bloqueo de la expresión de CPP32 no detener completamente la apoptosis inducida por el tratamiento en cualquier célula, sugiriendo la existencia de una alternativa o potencial, caspasa-independiente de muerte en la vía Cytoreg R-indujo apoptosis en las células de todos. Caspasa-3 activación de la proteasa / expresión significativamente correlacionado con la inducción de la apoptosis (0,78, P <0,01).

Debates

La batería de pruebas que se utilizaron en el presente estudio indica que cytoregR inhibe el crecimiento y la proliferación celular en el panel de las células del cáncer humano a través de la inducción de la apoptosis en la concentración fisiológica / dilución de la droga. La inhibición del crecimiento de las células probada fuertemente correlacionada con la MTT, Trypán azul de la exclusión, la LDH y resultados de ensayo. El patrón de respuesta en todas las células orientadas fue significativamente similares, y en consonancia con los resultados de estudios anteriores con isoflavone genistein [18, 20, 21]. El tratamiento inducida por cambios morfológicos observados en todas las celdas (de la muerte de la célula, y la inhibición del crecimiento) fueron consistentes con observaciones anteriores en otros estudios con otros agentes citotóxicos [18, 22]. La correlación inversa entre la MTT y la LDH ensayos ofrece un firme apoyo a la fiabilidad de los datos. En general, los datos demuestran que Cytoreg R inhibe significativamente el crecimiento y la proliferación celular a través de la inducción de la apoptosis como la vía principal de muerte en todas las células, en consonancia con los resultados anteriores con otros agentes en [23, 24]. En todas las células, la inducción de la apoptosis disminución correlaciona inversamente con la viabilidad celular, simultáneamente con la creciente concentración de cytoreg R; más que indica que la apoptosis es principalmente responsable de la muerte de las células y la inhibición del crecimiento. La bio-observado cambios morfológicos indicativos de la apoptosis eran idénticos en el patrón y la gravedad en las células; coherente con resultados anteriores [25, 26]. Sin embargo, cytoregR no tiene efecto significativo sobre la normalidad, no cancerosos células humanas en relación con el cáncer de las células estudiadas. La bio-morfológicas características de la apoptosis observada en las células fueron tratadas de conformidad con las observaciones anteriores en la apoptosis en células de cáncer de otros mamíferos [26, 27]. Similares a las observaciones en los estudios preliminares, los efectos de chemotoxic R cytoreg en las células en diluciones dentro fisiológico (pH 7-7,2) concentraciones (diluciones de 2000, 1000, 500, 200) son selectivos para el cáncer de las células estudiadas, lo que indica que la Efectos diferenciales de cytoreg R en el tumor humanos versus las células normales se debe principalmente a la composición química de los compuestos y no a la acidez del compuesto.

Los posibles vías de señalización de la apoptosis inducida por cytoregR es objeto de investigación actualmente. Sin embargo, en el presente los resultados de la correlación positiva significativa CPP32 expresión con la inducción de apoptosis por ciento en todas las células firmemente implica caspasa-3 en el mecanismo de inducción de apoptosis en las células. La observación es consistente con el importante papel de la caspasa-3 en la proteasa genistein en la apoptosis inducida por ambos testículos humanos y células de cáncer de próstata [18, 19, 21, 28, 29].

CytoregR tanto en la apoptosis inducida por la hormona sensible (GI-101, LNCaP) y la hormona independiente de las células cancerosas (PC3) en diversos grados, con diferencias significativas en la sensibilidad. CytoregR, por lo tanto, podrían ser utilizados en el tratamiento del cáncer de células hormonales, independientemente de la sensibilidad de las células. Como se observó en este estudio, ya que ambos sensibles a la hormona y la hormona independiente de los tumores fueron susceptive a cytoregR por inhibición del crecimiento, se podría deducir que la acción de cytoregR no parece relacionado con la hormona de la modulación / regulación de actividades, al menos no directamente.

Conclusión

Se concluye de los datos obtenidos que: i) Cytoreg R ejerce una dosis-y tiempo-dependiente de inhibición del crecimiento de los efectos en el grupo de células de cáncer de la investigación, y con diferencias significativas (P> 0,05) en chemosensitivity entre las células; ii ) De inhibición del crecimiento de células en su mayor parte fue a través de la vía de la apoptosis de muerte, iii) CytoregR no inhiben significativamente en el crecimiento normal de la placenta y las células testiculares estudiado; iv) Cytoreg R induce la activación / expresión de CPP32 concurrente con la inducción de apoptosis en las células, por lo Que implican la utilización de CPP32 en la inducción de la apoptosis-muerte maquinaria; en consonancia con los datos anteriores, y v) la caspasa-3 proteasa podría proporcionar objetivo potencial para Cytoreg regulación de la apoptosis inducida por R en el grupo de células investigadas independiente de la sensibilidad hormonal de las células. Nuestros datos muestran que Cytoreg R es un fuerte inhibidor de la proliferación y el crecimiento de una serie de células de cáncer humano, y, por tanto, apoya la opinión de que esta novela de drogas puede desempeñar un papel importante en el régimen de quimioterapia para, al menos, algunos humanos de los tumores malignos. Preliminares de los estudios in vivo en animales y humanos limitados estudios no mostraron efectos secundarios significativos.

Conflicto de intereses

Nosotros, los autores, declarar que no tenemos intereses en competencia de la clase con respecto a esta investigación.

Contribuciones de los autores

JK-D contribuido a la concepción y diseño del experimento; contribuido a la cultura, los bioensayos, el análisis de los datos iniciales y la escritura / redacción del manuscrito. HM contribuido al cultivo y bioensayos, a la recogida de datos y ayudó en la redacción final del manuscrito. CG y WH participado en el diseño del estudio, recogida y análisis estadístico de los datos. JB y KM ayudado en el cultivo y bioensayos (independiente) y probar a leer el manuscrito final para la presentación.

Agradecimientos

Florida Atlantic universidad se reconoce para la financiación de este proyecto. Cytorex BioSciences Inc bibliográfica de prestar algunos de los materiales y el bioensayo cytoregR de drogas para este proyecto. Los autores también reconocen el Dr Matucci, el inventor de cytoregR para la liberación de la droga para este proyecto.