Thrombosis Journal, 2005; 3: 21-21 (más artículos en esta revista)

Parámetros de la coagulación sistémica en ratones después del tratamiento con agentes de la orientación vascular

BioMed Central
Maike Unruh (m_unruh@gmx.de) [1], Andrea Grunow (grunow.a @ gmx.de) [1], Claudia Gottstein (gottstein@engineering.ucsb.edu) [1]
[1] Departamento de Medicina Interna I / Oncología Experimental y Biología Vascular, Hospital de la Universidad de Colonia, Joseph-Stelzmann-Straße, 50924 Colonia, Alemania

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Resumen
Antecedentes

Vascular orientación de los tumores malignos se ha convertido en un nuevo tratamiento clínicamente validado con enfoque claro beneficio del paciente. Sin embargo los estudios clínicos han puesto de manifiesto también que algunos tipos de agentes destinados a vascular (VTAs) son propensas a los efectos secundarios del sistema de coagulación. Por lo tanto, es esencial para predeterminar los parámetros de coagulación en los estudios preclínicos. Hasta la fecha, esto rara vez se ha hecho, fundamentalmente, debido a cuestiones técnicas.

El objetivo de este estudio fue establecer y aplicar un proceso de normalización, en virtud del cual activación de la coagulación sistémica se puede medir rutinariamente en ratones.

Resultados

Hemos evaluado una serie de técnicas de muestreo y pruebas de coagulación en cuanto a su idoneidad para este fin. Hemos sido capaces de adaptar dos ensayos de medición de solubles de fibrina, un marcador para un prethrombotic estado. Así, solubles de fibrina podría ser medido por primera vez en ratones. Todos los ensayos fueron validados en un modelo de control de activación de la coagulación sistémica, es decir, inducida por lipopolisacárido endotoxemia.

En base a nuestros resultados, se seleccionaron un grupo de pruebas de coagulación, que son a la vez viable e informativo para los ensayos preclínicos de VTAs: solubles de fibrina, la trombina-antitrombina complejos, libre de antitrombina III, glóbulos blancos y plaquetas. El efecto del tumor sobre los trasplantes de los parámetros de coagulación se evaluó usando este panel. A continuación, se aplica esta serie de ensayos en los estudios de tratamiento con un VTA desarrollados en nuestro laboratorio para investigar un posible sistema de activación de la coagulación.

Conclusión

Hemos establecido un grupo de ensayos normalizados que se pueden utilizar para probar murino muestras de sangre para la activación de la coagulación en los estudios preclínicos. Todas las pruebas son factibles de realizar en cualquier laboratorio de investigación sin equipo especializado. Además, este es el primer informe a la medida de solubles de fibrina, un marcador temprano de activación de la coagulación sistémica en ratones. El grupo se aplicó teniendo en tumor de los ratones y los ratones tratados con un VTA. Sugerimos su aplicación general para el análisis de activación de la coagulación en ratones.

Antecedentes

La vasculatura tumoral ha sido reconocido como un objetivo prometedor para los nuevos enfoques de tratamiento, tales como los inhibidores de la angiogénesis, vascular perturbar agentes específicos y oclusión vascular agentes [1 - 5]. Varios de estos agentes de la orientación vascular (VTAs) han sido evaluados en ensayos clínicos y la prolongación de la supervivencia se ha demostrado en un ensayo de fase III [6]. Sin embargo, en varios estudios de efectos secundarios graves en el sistema de coagulación, como el infarto de miocardio, thrombembolic complicaciones y hemorragias fatales se han observado [7 - 11]. Además, en pacientes con cáncer de la enfermedad subyacente también puede interactuar con el sistema de coagulación [revisado en [12]].

Por lo tanto, la evaluación de los parámetros de coagulación es de importancia en el estudio de los ensayos preclínicos, el efecto de VTAs como agentes contra el cáncer.

Sorprendentemente, se dispone de pocos datos sobre los parámetros de coagulación en el tratamiento preclínico VTA-estudios en ratones. Esto parece ser debido fundamentalmente a los desafíos técnicos: Ejemplos de volúmenes en ratones son pequeñas; artefactos son fácilmente introducido, y el número de pruebas que deberán utilizarse para murino muestras es limitado debido a que la mayoría de venta en el comercio ensayos de coagulación diseñado para su uso en seres humanos no son de aplicación en Ratones [13]. Amplia estudios de coagulación, por lo tanto, han restringido a los animales más grandes, como los conejos, las ratas y los perros [14 - 16]. Sin embargo, los animales son la especie más ampliamente utilizado para estudios preclínicos en oncología experimental.

Aunque hay una gran cantidad de literatura sobre modelos de ratones en relación con trombosis o lipopolisacárido (LPS) inducida por coagulación intravascular diseminada (CID), en la mayoría de los estudios sólo unos pocos parámetros de coagulación se midieron simultáneamente. La falta de consistencia en los parámetros seleccionados hace una comparación entre los diferentes informes difícil [16 - 24]. También las cuestiones técnicas, como las técnicas de muestreo y anticoagulante aditivos varían: En algunos experimentos es la muestra de sangre por punción Vena cava [25], en otros, por el corazón o por punción cola cortada [26, 27], y citrato: sangre ratios de 1:10 1:5 o se han reportado.

En este estudio, hemos establecido para establecer un proceso normalizado para la medición de los posibles efectos secundarios de los medicamentos, que puedan afectar el sistema de coagulación. Además de la optimización de las cuestiones técnicas, hemos querido reunir a un grupo de pruebas, que i) detectar alteraciones de la coagulación con un enfoque sistémico en la activación de la coagulación, ii) ser adecuados para murino muestras, iii) ser viable para llevar a cabo habitualmente en un gran número De las muestras y iv) ser preferentemente disponible comercialmente. Los ensayos fueron evaluados aquí: tiempo de protrombina (PT), un marcador global de coagulación indicativo de los cambios en la extrínseca y la vía común; tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa), un marcador global indicativo de los cambios en la vía intrínseca y común; solubles de fibrina (SF), un sensible marcador de activación de la coagulación sistémica; complejos trombina-antitrombina (TAT), un marcador de activación de la coagulación sistémica; funcional de la antitrombina III (ATIII), que se reduce en coagulopatía de consumo; de glóbulos blancos (WBC), que Muestran un patrón de evolución en el tiempo en DIC [28]; plaquetas (PLT), que suelen reducirse en DIC; schistocyte y que cuenta, es decir, la fragmentación de los eritrocitos, que también puede ser indicativo de la CID.

Solubles de fibrina (SF) no se habían medido en ratones, a pesar de que resultó ser un marcador útil para un prethrombotic estado en los seres humanos [29 - 31]. SF trombina se produce después de la división de fibrinógeno. No se trata de una molécula claramente definido homogéneo, sino más bien de fibrina se describen diversos compuestos de diferentes estructuras moleculares, incluidos los monómeros de fibrina, polímeros y crosslinked fibrina. En el pasado, una serie de ensayos de detección de solubles de fibrina se desarrollaron [revisado en [32]]: Gelation pruebas con etanol o con protamina [33, 34], el análisis cromatográfico [35], "Western Blotting de fibrina compuestos relacionados [35, 36] , Métodos inmunológicos, como las pruebas ELISA o aglutinación de látex [37], ensayos y pruebas funcionales. Los primeros son ni muy sensible ni adecuado para análisis de rutina, mientras que los métodos inmunológicos son especies específicas y no crossreact murino con muestras (13, datos propios). Entre las pruebas funcionales, dos principios diferentes han sido explotados para el desarrollo de pruebas: i) la reacción de aglutinación de fibrina, eritrocitos recubiertos con SF en muestras de plasma [38], y ii) la capacidad de SF para acelerar el tPA (activador tisular del plasminógeno) - Catalizada división de plasminógeno a plasmina [39]. Estas dos pruebas fueron desarrolladas para humanos y muestras disponibles en el comercio. Inicialmente no eran adecuados para la realización de pruebas murino muestras, por lo tanto, modificarse para la utilización en ratones.

Se seleccionaron los ensayos de un grupo de pruebas adecuadas para ensayos de coagulación sistémica en ratones. Esta serie de pruebas se aplicó en modelos de ratones para investigar el impacto de los trasplantes de tumores en el sistema de coagulación, y de determinar de antemano los posibles efectos secundarios causados por VTAs.

Resultados
Toma de muestras de sangre de la vena o la cola corazón introduce artefactos

Tres diferentes técnicas de muestreo se compararon en el control de ratones no tratados: cortar la cola, el corazón y la punción Vena cava punción. Los cuadros 1 y 2 se resumen los resultados.

El cuadro 1 muestra una comparación de los resultados de las mediciones de PT y TTPa en muestras obtenidas Vena cava, ya sea por punción o por la cola cortada. Citrato de diluciones de 1:5 y 1:10 se utilizaron como se indica. Ninguna de las muestras obtenidas por la cola cortada son evaluables porque coagulado antes de la prueba. Como era de esperar, los tiempos de coagulación de 1:5 y 1:10 citrato diluciones difieren ligeramente. Las muestras con citrato diluida en un 1:5 citrato: sangre mostró una alta desviación estándar, y algunas muestras no fueron evaluables a todos. Esto era más probable debido a la falta relativa de los iones Ca + +. Ajuste de la Ca + + concentración de iones podría haber eludido este problema. Sin embargo, debido al alto volumen de muestra necesario para PT y PTT mediciones, las muestras de plasma no pueden ser analizados simultáneamente por PT / PTT y para el grupo de SF, ATIII, TAT, WBC y PLT. Por lo tanto no era necesario utilizar el citrato 1:5: ratio de sangre, en el análisis de PT y PTT. Del mismo modo, cuando analizamos muestras de la trombina-antitrombina o complejos solubles de fibrina, las muestras obtenidas por la cola cortada o bien no evaluable o sistémica mostraron activación de la coagulación (datos no presentados). En conclusión, cortar la cola parece ser un inadecuado método de toma de muestras de sangre para análisis de los parámetros de coagulación.

En el Cuadro 2, una comparación de los resultados de solubles de fibrina (SF) determinaciones en Vena cava punción muestras y corazón punción muestras en diferentes citrato: se muestran ratios de sangre. Sólo las muestras obtenidas por punción Vena cava en un 1:5 citrato: ratio de sangre fueron negativos para el SF, como se esperaba en los ratones no tratados. Desde los ensayos de TAT, WBC y PLT también podría ser realizado con éxito usando esta técnica de muestreo (datos no presentados), Vena cava punción en una citrato: sangre factor de dilución de 1:5 es nuestro método preferido de muestreo (con la posible excepción de PT y TTPa).

Medición de la SF en ratones

Primero SF in vitro inducida por tratamiento de plasma humano o murino con la trombina, y verificó que la SF formación ha tenido lugar mediante "Western Blotting (Figura 1A].

Dos ensayos funcionales para medir SF en humanos muestras fueron adaptados para el uso en ratones:

El ensayo de aglutinación eritrocitaria es un kit de prueba se haría fácilmente, que mide el SF en un semicuantitativo de moda. Cuando lo llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero utilizando muestras murino, se observó aglutinación reacciones negativas en nuestras muestras de control (ratón normal plasma). Esto era más probable debido a un factor de transición inespecíficos. Sin embargo, después de diferentes condiciones de ensayo (dilución de plasma, los volúmenes de reactivos y condiciones de reactivo) se pudo eliminar la aglutinación inespecíficos. Usando el protocolo optimizado tal y como se describe en los métodos, los controles positivos, es decir, tratados con muestras de la trombina, que se ha mostrado por "Western Blotting para contener SF, mostraron una reacción de aglutinación, que no se observó en las muestras de control negativo (sin tratamiento normal de ratón plasma ). Esto se demuestra en la Figura 1B. A continuación, las muestras de plasma tratados con diferentes dosis de la trombina, por lo que las cantidades correspondientes de SF. Figura 1C pone de manifiesto que la reacción de aglutinación es visiblemente más fuerte en la presencia de cantidades superiores SF, lo que arrojó una evaluación semicuantitativo.

El ensayo cromogénico es más difícil y lenta. Originalmente fue desarrollado para mediciones automatizadas, pero estableció un procedimiento manual que mide 12 muestras por prueba. Controles positivos de la curva estándar y controles negativos se generaron como se describe en la sección Métodos. La curva es lineal para los estándares normales de ratón tratadas con plasma de 15 mU / ml a 50 mU / ml de trombina. Así, dentro de este rango, los valores de muestra podría ser su cuantificación en unidades arbitrarias correspondientes a la cantidad de activación de la trombina (Figura 1D]. Una conversión directa en μ g / ml SF no es posible, porque el plasma humano reaccionado diferente a los de plasma de ratón (datos no presentados), y, por tanto, el humano las normas previstas en el kit no puede utilizarse en el modelo murino.

Los límites de detección fueron comparables para el ensayo de aglutinación y el ensayo cromogénico (Figura 1C, D]. Controles positivos de la prueba de ensayo cromogénico kit también fueron positivos en la prueba de aglutinación. Cuando ambos se realizaron pruebas con muestras de plasma de la misma, sus resultados correlacionados entre sí y con un tercer ensayo, el ensayo TAT (Tabla 3): En ratones inyectados con 20 μ g LPS ip, 4 / 5 ratones se convirtió en positivo en los tres ensayos . Cuando 300 U de hirudina se inyectó además de 20 μ g LPS, todos menos uno en el ratón Berichrom FM prueba, fueron negativos para el SF o TAT en los tres ensayos. Así lo confirmó la trombina especificidad de las señales observadas en los tres ensayos.

SF se mide también en otro modelo de sistema de activación de la coagulación: 2 U de trombina iv fueron inyectados en ratones, y 7 de 9 ratones mostraron positivos resultados de la prueba. Los otros dos ratones, probablemente, no para desarrollar un sistema de activación de la coagulación, porque la trombina local inició una fuerte reacción de coagulación en la cola orden de cosas, que consumen la gran mayoría de la trombina en el sitio de inyección.

Iv inyecciones de una solución inerte puede activar el sistema de coagulación

Las comparaciones entre los ratones no tratados y ratones tratados con 0,9% de NaCl de la solución (grado clínico) iv puesto de manifiesto que las inyecciones pueden inducir la formación de SF. La Figura 2 muestra que el SF se convirtió detectable en el 32% de las muestras de plasma de los ratones después de un lento iv inyección de 0,4 ml de solución fisiológica de NaCl en comparación con el 0% en los ratones no tratados. LPS-ratones tratados sirvió como control positivo. Esto demuestra que la inyección iv inerte de una solución que no guardan relación con el sistema de la coagulación puede provocar la activación de la coagulación sistémica, probablemente por causar daños mecánicos a la pared venosa. La prueba de aglutinación de SF fue suficientemente sensible para detectar esta reacción.

Todos los parámetros de prueba positiva convertido en un modelo de ratón de la inducción de la coagulación sistémica

Como se ilustra en la Figura 3, todos los parámetros de prueba cambiado con el tiempo, después de la inyección de LPS. SF se convirtió en positivo en las primeras hora de puntos, TAT y libre ATIII más adelante en los puntos (6 h y 24 h después de la inyección de LPS). La cuenta de WBC y mostró un patrón de PLT, que fue descrita previamente para los seres humanos [28], es decir, que cuenta WBC cayeron inicialmente, seguido de un aumento por encima de lo normal, y se redujeron los cargos PLT. PT aumentó después de las 24 horas, pero no en todos los ratones, las desviaciones estándar, por lo tanto, eran altas. TTPa fue elevado ya en 2 h post inyección y sigue aumentando. Schistocyte cuenta cambió sólo ligeramente (del 3 al 6 de fragmentos por campo después de la inyección de LPS y del 4 al 9 de fragmentos por campo después de factor de necrosis tumoral-alfa inyección, datos no presentados). En conclusión, todos los parámetros probado aquí son adecuados para la detección de un sistema de activación de la coagulación, que cuenta con schistocyte siendo los menos sensibles.

WBC y PLT cuenta pueden ser elevados en los ratones con tumor

Se midió cada uno de los parámetros de laboratorio por vía subcutánea en varios modelos de crecimiento tumoral y de los valores en comparación a los de los no teniendo tumor de los ratones (Figura 4]. En los modelos probados, no hemos encontrado cambios significativos en los parámetros de laboratorio en comparación con ratones control, con excepción de WBC y PLT. WBC fueron elevados en el linfoma y el modelo PLT cuenta tanto en el mieloma y linfoma de la modelo.

Este argumenta en contra de un estado procoagulante en estos modelos, sino que tienen que ser evaluados por separado para otros modelos tumorales.

Selección de un grupo de los parámetros de coagulación para análisis de rutina

La selección de los ensayos se basa en los siguientes criterios: La sensibilidad de la prueba, para medir la idoneidad de activación de la coagulación sistémica, muestra el volumen necesario y la viabilidad para la realización de pruebas a un gran número de muestras. El volumen de muestra requerido es aún más crítica en los estudios con ratones enfermos, porque en nuestra experiencia, el volumen de sangre que se puede obtener de ratones enfermos es menor que la de los ratones sanos.

En consecuencia, la medición de PT y TTPa no se incluyó en el grupo porque i) un total de al menos 100 μ l de plasma (alrededor de 200 μ l de sangre) que se necesita para estas dos pruebas, ii) es bien aceptado que la PT y TTPa Son globales y no de marcadores específicos para la activación de la coagulación sistémica [40], y iii) un TTPa comparación de los resultados entre los diferentes laboratorios es difícil [41].

Schistocyte que cuenta son muy intensiva en mano de obra, un tanto subjetiva, y no resultó ser muy sensible. Por lo tanto no se incluyen en el panel.

En contraste, SF y TAT indican una activación del sistema de coagulación y los volúmenes de las muestras requeridas son bajas (5 μ l y 20 μ l de plasma, respectivamente). ATIII medidas de otro parámetro (el consumo), con diferentes cinéticas y también requiere un bajo volumen de muestra (5 μ l de plasma). WBC y PLT, que pueden ser realizadas con un volumen total de la muestra de 10 μ l de sangre, tienen un conocido patrón de cambio en DIC.

En conclusión, proponemos SF, TAT, ATIII, WBC y PLT como un grupo útil de las pruebas de la activación de la coagulación sistémica.

A VTA consistente en el dominio extracelular de los tejidos factor orientado a VCAM-1 no induce activación de la coagulación sistémica

Hemos probado entonces el impacto de un VTA, que induce selectivamente en el tumor de activación de la coagulación vasculatura [5], en los parámetros de coagulación en diferentes puntos de tiempo después de la inyección en ratones con tumores. Los resultados se ilustra en la Figura 5 y demostrar que no había ninguna indicación de la activación sistémica cogulation después del tratamiento con ese VTA.

Discusión

Pese a la importancia de la medición de los parámetros de coagulación en estudios preclínicos, el tratamiento con VTAs, ha habido prácticamente ningún informe sobre este tema. Esto es principalmente debido a problemas técnicos. Por lo tanto, nuestra primera tarea consiste en seleccionar y perfeccionar las pruebas para la detección de la activación de la coagulación sistémica en ratones. En cuanto a las cuestiones técnicas, se observó que el muestreo del corazón o vena cola introducido artefactos en la coagulación mediciones. La comparación directa de tres diferentes técnicas de muestreo demostrado que la cola corta y la punción del corazón parecen ser inadecuados para los estudios de coagulación. Esto se debe a daño tisular, lo que resulta en la activación artificial de la coagulación conduce a los resultados de las pruebas positivas para principios de los marcadores de activación de la coagulación. Por lo tanto, proponemos Vena cava punción como el método de muestreo de elección. Una segunda fuente potencial de activación de la coagulación es la aplicación ruta. Nuestra observación de que la formación de SF se produjeron después de la inyección iv lenta inerte de una solución, es importante, ya que las inyecciones iv se utilizan con frecuencia en los estudios preclínicos. Esto debe ser considerado para la selección adecuada de los controles negativos y valores de referencia.

Sistémico activación de la coagulación puede en última instancia conducir a coagulación intravascular diseminada (CID), un trastorno complejo thrombohemorrhagic. El diagnóstico de la CID se complica porque no hay realmente pruebas de laboratorio específicas disponibles. Diversas pruebas de coagulación se han clasificado en función de su fiabilidad para detectar DIC en el siguiente orden [40]: 1. Fragmentos de protrombina 1 y 2, 2. Fibrina D-dímero, 3. Antitrombina III, 4. Fibrinopeptide A, 5. Factor plaquetario 4, 6. Productos de degradación de fibrina, 7. Plaquetas, 8. Protamina prueba de detección de SF, 9. Trombina tiempo de 10. Fibrinógeno, 11. PT, 12. TTPa. Desde la venta en el comercio para los ensayos de los fragmentos de protrombina 1 y 2, D-dímero de fibrina, fibrinopeptide A, el factor 4 plaquetario y productos de degradación de fibrina no son adecuadas para el análisis de muestras murino (13, datos propios), probamos la antitrombina III, TAT, Plaquetas y fibrina soluble. Solubles de fibrina es de diagnóstico para la acción de la trombina y fibrinógeno se ha descrito como un marcador temprano de activación de la coagulación sistémica [29 - 31]. Este es el primer estudio para describir la medición de la SF en ratones. Hemos adaptado dos de venta en el comercio SF ensayos funcionales para este propósito. Se correlacionaron entre sí y con los niveles de TAT en un modelo de ratón para DIC. Hirudina, un inhibidor directo de trombina, abolió la respuesta indicando que los resultados se debieron a una acción específica de la trombina. No se incluyen la medición de fibrinógeno, ya que se ha descrito a ser ni sensible ni específico para la activación de la coagulación sistémica [42]. Desde nuestra propuesta técnica de muestreo que requiere de un punto cada vez que el ratón se sacrifica, se convierte en importante, que todas las pruebas se realizó con una muestra razonable de volumen. Las pruebas con diferentes cinética deberían combinarse para aumentar la probabilidad de detección de la activación de la coagulación sistémica en cualquier timepoint. Pruebas con baja especificidad para la activación de la coagulación sistémica o pruebas que exigen altos volúmenes de las muestras son de menor valor, por ejemplo, PT y TTPa.

Sobre la base de los criterios de viabilidad y conveniencia hemos seleccionado del siguiente grupo de ensayos para detectar activación de la coagulación sistémica: SF, TAT, ATIII, WBC y PLT. El conjunto completo de pruebas seleccionadas se pueden realizar con 50 μ l de plasma, las pruebas son adecuados para la realización de pruebas en un gran número de muestras, todas ellas positivas convertido en un modelo de ratón de la CID, y están generalmente disponibles.

A continuación, analiza el impacto de los tumores murinos sobre el estado de coagulación. En el tumor de modelos que se utilizan aquí no hay cambios significativos en la mayoría de los parámetros de coagulación, pero esto aún no se ha validado por separado para cada tumor modelo utilizado.

Desde entonces hemos aplicado este panel de forma rutinaria en los estudios preclínicos con VTAs desarrollados en nuestro laboratorio, y se presenta un ejemplo. Para esa VTA, todos los parámetros de coagulación permanecieron dentro del rango normal durante todo el período de tiempo a prueba.

Conclusión

Vasculares de orientación es un nuevo y prometedor enfoque para el tratamiento del cáncer y otras enfermedades. Los estudios clínicos han puesto de manifiesto, que existe un potencial de efectos adversos en el sistema de coagulación. Por lo tanto, es esencial para predeterminar estos posibles efectos secundarios en los estudios preclínicos. Prueba de los parámetros de coagulación en ratones, las especies más frecuentemente utilizado para estos ensayos, que hasta ahora ha sido reservada a los laboratorios especializados. En este estudio un grupo de ensayos y optimizado métodos para medir la activación de la coagulación sistémica murino muestras se presenta. El grupo se aplicó teniendo tumor en ratones y en ratones tratados con un VTA. Sugerimos su uso general para el análisis de activación de la coagulación en ratones.

Métodos
Toma de muestras de sangre

Tres diferentes técnicas utilizadas fueron: Vena cava punción, punción corazón y corte de la cola. Si no se especifica de otra forma, la sangre se extrajo de la Vena cava.

Para Vena cava o la punción del corazón, los ratones fueron anaesthetized con éter, el thoracical cavidad se abrió, y la sangre se extrajo de la Vena cava superior del corazón o en una jeringa que contenga citrato de sodio (1 / 10 o 1 / 5 del volumen del 3,1% Citrato de sodio). Para cortar la cola, los ratones fueron calentado bajo una lámpara de infrarrojos (250 W) durante un minuto. La cola estaba cortada con un bisturí, las tres primeras gotas de sangre no se utilizaban y, a continuación, la sangre se recogió en una heparina revestida de tubo de centrífuga, que contiene citrato de sodio (véase más arriba). Después de extraer la sangre de células sanguíneas (WBC, PLT, schistocytes), se centrifuga la sangre citrada dos veces (500 g y 8000 g) para eliminar las plaquetas. Plaquetas de los pobres en plasma fue analizado inmediatamente por fibrina soluble y el resto de las muestras fueron congeladas a -80 ° C hasta nuevo uso.

Control negativo de plasma

Control negativo ratones fueron ratones no tratados o ratones inyectados con 0,9% de NaCl de la solución (grado clínico). En algunos experimentos se utilizó plasma combinados, que se preparó de la siguiente manera: La sangre de 20 ratones fue sacado a la Vena cava punción de los pobres y de plaquetas del plasma fue obtenido como se describe más arriba. En raros casos, la técnica de muestreo podría producir valores atípicos. Con el fin de excluir estos artefactos de nuestro control negativo piscina, cada muestra se realizarán las pruebas de solubles de fibrina y de los complejos trombina-antitrombina (método véase más adelante). La gran mayoría de las muestras fueron negativos en estas pruebas, y las muestras se agruparon. La piscina se congeló en alícuotas a -80 ° C.

Medición de solubles de fibrina (SF) en ratones

Como control positivo, se incubaron ya sea purificada humanos fibrinógeno o plasma humano y murino con muestras de 0,02 mU / ml de trombina bovina (Dade Behring, Liederbach, Alemania). Para demostrar la formación de fibrina y fibrina crosslinked-dímeros, Western Blot digeridos de fibrinógeno en plasma o muestras fue realizado. Las muestras fueron separadas por SDS-PAGE (dodecil-sulfato sódico-electroforesis en gel de poliacrilamida) capilar seguida de la transferencia de calor en las membranas de nitrocelulosa. Membranas se tiñeron con una oveja policlonal de conejo anti-fibrina (ogen) anticuerpo (Haemochrom, Essen, Alemania), que se sabe que son crossreactive con ratón y humanos de fibrina (ogen), seguido por la detección quimioluminiscente.

SF en el plasma fue medido con dos ensayos funcionales: i) una modificación de un ensayo de aglutinación de venta en el comercio (FM-prueba, de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), que mide la reacción de aglutinación con SF-monómero de fibrina y eritrocitos recubiertos ii) Una modificación de un ensayo cromogénico (Berichrom FM ensayo, Dade Behring), que se basa en la capacidad de SF para mejorar el activador tisular del plasminógeno (tPA) inducida por la conversión del plasminógeno. Para la prueba de aglutinación modificado, 5 μ l de citrada ratón diluido en plasma fueron de 100 μ l de Owren del buffer (28 mM de sodio 125 mM barbital en solución de cloruro de sodio, pH = 7,35), y mezclados en una diapositiva (siempre en el kit) con 50 Μ l de la suspensión de eritrocitos. Después de incubación a 37 ° C durante 10 minutos, las muestras se mezclaron de nuevo y la reacción de aglutinación en comparación con positivas y negativas de muestras de control. Controles positivos fueron las muestras de plasma de ratón tratadas con 0,02 U / ml de trombina (Dade Behring), controles negativos sin tratar fueron las muestras de plasma de ratón normal. Para el ensayo cromogénico, 250 μ l de la mini-solución del plasminógeno (siempre en el kit) se pipeta en los pozos de una placa de microtiter y 96, y la placa fue precalentada a 37 ° C. Una curva estándar generado por incubando murino muestras de plasma con diferentes cantidades (2 mU / ml - 100 mU / ml), de la trombina bovina. L 5μ muestras y controles fueron agregados a la solución del plasminógeno-, y 50 μ l de reactivo tPA se pipeta para cada bien con un pipettor multicanal. Las muestras fueron incubadas a 37 ° C durante 5 minutos, luego 25 μ l de sustrato plasmina se añadió con un multicanal pipettor y absorción a 405 nm (menos 650 nm) se midió kinetically en un lector de ELISA. Las pruebas fueron llevadas a cabo también con la trombina no tratados o tratados con plasma humano.

Para verificar que los resultados de la prueba se debe a la acción de la trombina, hemos añadido la hirudina específico inhibidor de la trombina. Hirudina (Roche, Mannheim, Alemania) fue mixta, ya sea in vitro a una concentración de 1,4 U / ml con las muestras de control positivo, o inyectado además de LPS en estudios in vivo (ver abajo).

Otros ensayos de los parámetros de coagulación

Por plaquetas y de glóbulos blancos, de sangre citrada se mezcla con el 1% (w / v) de oxalato de amonio (para plaquetas) o con el 3% (v / v) de ácido acético (glóbulos blancos) en la dilución 1:20, y se incubaron en un agitador durante 10 min. Las plaquetas y glóbulos blancos fueron contados bajo un microscopio de luz a 400 × magnificación en una cámara de recuento (Neubauer Mejora de tipo). Por schistocyte cuantificación, diluir la sangre se prepararon frotis de sangre total. Frotis se secaron y manchadas de la Pappenheim Método: fijación en el 100% (v / v) de metanol, seguidos de 5 minutos en la tinción de mayo-Grünwald solución (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y 30 minutos en la solución de Giemsa (Sigma - Aldrich). Schistocytes fueron contados en tres campos de alta potencia a 400 × aumento en un microscopio de luz. Tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activado (TTPa) se medirá automáticamente en un analizador de coagulación BCS (Dade Behring) utilizando el kit Innovin (Dade Behring) para el PT, la Actina FS kit (Dade Behring) para TTPa y plasma humano normal (SHP, Dade Behring) como estándar. Complejos trombina-antitrombina (TAT complejos) se mide a través de una prueba de ELISA (Enzygnost-TAT, Dade Behring) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero con 20 μ l de las muestras de plasma y las normas. Esta prueba es plenamente crossreactive murino con muestras [13]. En pocas palabras, microtiterplates que fueron recubiertos con un anticuerpo anti-trombina se incubaron con las muestras y las normas (siempre en el kit), lavado, incubadas con un conjugado de peroxidasa anti-antitrombina III de anticuerpos, lavada y detectados con OPD (o-fenileno-diamine - Diclorhidrato) sustrato. Absorción se midió en un lector de ELISA. Normal ratón deficiente de plaquetas del plasma se utilizó como control negativo. Antitrombina III (ATIII) se midió usando una prueba funcional de antitrombina (Coamatic-antitrombina, Chromogenix, Milano, Italia) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, utilizando 5 μ l de plasma y de las normas por prueba en la recomendó diluciones. Brevemente, las muestras de plasma y de las normas (siempre en el kit) fueron incubadas con un exceso de factor de coagulación Xa en presencia de heparina. El factor Xa residual se cuantificó con un sustrato cromogénico específico para el factor de coagulación Xa y la disminución de la absorción se midió en un lector de ELISA. Normal ratón deficiente de plaquetas del plasma se utiliza como estándar para definir la actividad del 100%.

Mouse modelos sistémicos de la inducción de la coagulación

Los ratones fueron inyectados por vía iv, ya sea con 2 U de trombina bovina (Dade Behring) o ip con 20 μ g o 50 μ g lipopolisacáridos (LPS de E. coli serotipo 055: B5, Sigma-Aldrich). Por schistocyte cuenta, los ratones fueron inyectados con 20 μ g LPS ip o con 100 μ g factor de necrosis tumoral-alfa iv Después de los períodos de tiempo especificados, de sangre citrada se señalaron y analizaron parámetros de la coagulación como se ha descrito anteriormente. En los casos en que la acción de la trombina se inhibió, 300 U iv hirudina se inyecta antes de 20 μ g LPS.

Tumor modelos

Inmunodeprimidos ratones fueron inyectados por vía sc con 1 × 10 7 células tumorales. Línea celular son: F9 Teratocarcinoma células murinas (ECACC, Salisbury, Reino Unido), Colo 677 células de mieloma humano (DSMZ, Braunschweig, Alemania), L540rec humanos células de linfoma de Hodgkin [43], HT29 células de carcinoma de colon humano (ATCC / LGC, Middlesex, Reino Unido), LS174T células de carcinoma de colon humano (ATCC), IMR5 células de neuroblastoma humano (amablemente proporcionados por el Dr Unwicker, de la Universidad de Marburg, Alemania). Los ratones fueron analizadas para los parámetros de coagulación cuando los tumores habían alcanzado un tamaño de 150-500 μ l. Las diferencias entre grupos fueron analizadas para significación estadística con la U de Mann-Whitney test para unpaired grupos. El término "significativo" se utiliza, en donde los valores de p se inferior a 0,05.

Parámetros de coagulación tras el tratamiento del tumor con ratones con un VTA

Teniendo Colo677 tumores de los ratones fueron tratados con un VTA desarrollados en nuestro laboratorio. Consistió en una sola cadena de fragmentos de anticuerpos variable (scFv) dirigido contra murino molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1), que se expresó en tumor de las células endoteliales, y el dominio extracelular del factor tisular. Esta proteína de fusión induce la activación selectiva de coagulación en la vasculatura tumoral [5]. Una dosis única de 20 μ g iv se administró a ratones fueron sacrificados especificado timepoints después del tratamiento, y el análisis de los parámetros de coagulación se realizó como se describió anteriormente.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MU llevado a cabo ensayos de la coagulación y de los estudios en animales, y participó en la redacción del manuscrito. AG participó en el diseño del estudio y llevó a cabo la validación de la prueba de solubles de fibrina. CG concibe el estudio y participaron en su diseño, ejecución, coordinación y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a Maria Weber y Tiffani permisos de salida para una excelente asistencia técnica y Samir Tawadros animales de laboratorio para la vigilancia. El ensayo de PT y TTPa se realizó en el Instituto de Química Clínica en el Hospital Universitario de Colonia. Agradecemos el apoyo financiero de la Deutsche Forschungsgesellschaft (DFG SFB502-T6), la Fundación Novartis para la Investigación y Terapéutica Köln Fortune Programa de la Facultad de Medicina en la Universidad de Colonia. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a las directrices institucionales y en el cumplimiento de todas las normas y reglamentos pertinentes.