Cardiovascular Diabetology, 2006; 5: 1-1 (más artículos en esta revista)

Humanos epicárdicos tejido adiposo expresa un perfil de adipocytokines patógeno en pacientes con enfermedad cardiovascular

BioMed Central
Adam R Baker (arbaker@warwick.ac.uk) [1], Nancy F da Silva (N.Fernandes-da-Silva @ warwick.ac.uk) [1], David W Quinn (davidq@blueyonder.co.uk ) [2], Alison L Harte (a.harte @ warwick.ac.uk) [1], Domenico Pagano (domenico.pagano @ btinternet.com) [2], Robert S Bonser (robert.bonser @ uhb.nhs. Uk) [2], Sudhesh Kumar (Sudhesh.Kumar @ warwick.ac.uk) [1], Philip G McTernan (pgmcternan@warwick.ac.uk) [1]
[1] Unidad de Diabetes y Metabolismo, Facultad de Medicina de Warwick, de la Universidad de Warwick, Instituto de Investigaciones de Ciencias Clínicas, UHCW Campus, Clifford Bridge Road, Coventry, CV2 2DX, UK
[2] Departamento de Cardiothoracic Surgery, Queen Elizabeth Hospital, B15 2TH, UK

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Resumen
Introducción

La inflamación contribuye a las enfermedades cardiovasculares y se agrava con el aumento de adiposidad, especialmente omental adiposidad; sin embargo, el papel de la grasa epicárdicos es poco conocido.

Métodos

Para estos estudios de la expresión de marcadores de inflamación se evaluó en epicárdicos grasa biopsias de injerto de bypass de arteria coronaria (CABG) de los pacientes mediante RT-PCR cuantitativa. Además, los efectos de la medicación crónica, con inclusión de las estatinas, así como perioperatorio de glucosa, insulina y potasio infusión, en la expresión de genes También se evaluaron. Circulante resistin, CRP, adiponectin y se determinaron los niveles de leptina para evaluar la inflamación.

Resultados

La expresión de adiponectin, resistin y otros adipocytokine mRNAs fueron comparables a la de la grasa omental. Epicárdicos expresión CD45 fue significativamente mayor que los depósitos de control (p <0,01), indicando importante infiltración de macrófagos. Los pacientes tratados con estatinas mostraron significativamente menor epicárdicos expresión de la IL-6 mRNA, en comparación con el control de los depósitos abdominal (p <0,001). El suero CABG perfil de los pacientes mostraron significativamente más altos niveles de ambos CRP (control: 1,28 ± 1,57 μ g / ml vs CABG: 15,7 ± 9,11 μ g / ml, p <0,001) y resistin (control: 10,53 ± 0,81 ng / ml vs CABG : 16,8 ± 1,69 ng / ml, p <0,01) y significativamente más bajos niveles de adiponectin (control: 29,1 ± 14,8 μ g / ml vs CABG: 11,9 ± 6,0 μ g / ml, p <0,05) en comparación con el IMC controles pareados.

Conclusión

Epicárdicos y grasa omental exhiben una amplia comparables patógenos mRNA perfil, este puede surgir, en parte, la infiltración de macrófagos en la grasa epicárdicos. Este estudio pone de manifiesto que la inflamación crónica se produce a nivel local, así como sistémica potencialmente contribuir más a la patogénesis de la enfermedad arterial coronaria.

Introducción

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) y sus secuelas son la principal causa de muerte prematura, no sólo conduce a aumentado significativamente las tasas de mortalidad, sino también a los altos niveles de morbilidad [1]. Si bien las causas de las enfermedades cardiovasculares son complejas existe una creciente evidencia que sugiere un papel integral para la inflamación en la patogénesis de las enfermedades cardiovasculares, con una investigación reciente examen de este aspecto de orientación terapéutica de la enfermedad [2, 3]. Sin embargo, la causa de la inflamación y su relación con las enfermedades cardiovasculares aún es poco conocido, sobre todo en los seres humanos, debido a la dificultad en el estudio de los tejidos humanos.

Estudios anteriores han puesto de manifiesto la importancia potencial de tejido adiposo en relación con la carga inflamatoria en las enfermedades cardiovasculares, la descripción de la expresión y secreción de ambos pro-inflamatorias y los factores de protección, denominados colectivamente adipocytokines [4]. Estos factores incluyen el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), una citoquina pluripotentes que es un mediador clave de la respuesta de fase aguda que afecta también a grasos no esterificados (NEFA) de ácidos del metabolismo, así como de la contractilidad miocárdica [5]. Resistin, un adipocytokine identificado recientemente, se ha propuesto como un posible vínculo entre la obesidad y la inflamación y ha sido relacionado con el riesgo de ECV [6, 7]. Adiponectin exposiciones tanto sensibilizadores a la insulina, anti-inflamatorio y anti-aterogénicas propiedades con niveles séricos reducido tanto en la diabetes mellitus tipo 2 (DM2) y la enfermedad arterial coronaria (CAD) [8, 9]. Kawanami et al han descrito efectos recíprocos directamente de resistin y adiponectin con respecto a la inflamación de las células endoteliales vasculares [10]. Tejido adiposo también produce más patógena adipocytokines incluidos inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) y la angiotensina II (ANG II), el metabolito activo de angiotensinogen (AGT), importantes en el fibrinolítico y trombóticos vías [11, 12]. Tejido adiposo aumenta la producción de estos patógenos adipocytokines en la obesidad y la hipótesis es que los macrófagos reclutamiento en el tejido adiposo puede contribuir a la respuesta de este patógeno [13, 14].

Los estudios han establecido además que la distribución de tejido adiposo tiene un impacto significativo en el riesgo de enfermedades con el aumento de la grasa abdominal central tanto del riesgo de ECV y de DM2 en comparación con el gluteo-femoral de grasa [15, 16]. Estas diferencias en el riesgo se puede atribuir al depósito de las diferencias específicas en la expresión y secreción de adipocytokines [17, 18]. No obstante, si bien muchas investigaciones han dilucidado la relación patógena abdominal y riesgo de gluteo-femoral tejido adiposo, hasta la fecha, pocos estudios han investigado el perfil de adipocytokine epicárdicos tejido adiposo. Este depósito, situado predominantemente a la derecha de la pared libre del ventrículo izquierdo y el ventrículo ápice [19], ha demostrado tener una alta capacidad de grasos no esterificados (NEFA) de ácido en libertad y se propone como fuente preferida de este metabolito Para el miocardio [20]. Si adipocytokines también son secretadas directamente en el tejido cardíaco aún no se ha establecido y, por lo tanto, el potencial de efecto paracrina epicárdicos adipocytokines sobre el metabolismo del miocardio y su papel en la patogénesis de la EAC es aún desconocido. Sin embargo, la falta de fascia entre los adipocitos y de la capa de miocardio sugiere que los factores secretados por los adipocitos que fácilmente interactuar con los cardiomiocitos adyacentes. Los estudios clínicos han observado una fuerte correlación entre la masa grasa de tejido adiposo epicárdicos, central de la grasa abdominal y el riesgo de DM2 y ECV [21]. Estudios de Mazurek y compañeros de trabajo de comparación de la expresión de factores patógenos entre epicárdicos y de la grasa subcutánea de la pierna en pacientes con CAD sometidos a cirugía de revascularización coronaria injerto (CABG), también destacar la posible importancia de la respuesta inflamatoria de los tejidos epicárdicos [22].

Durante la operación de CABG, infusiones sustrato metabólico sistémica puede administrarse proporcionar protección y la promoción de miocardio post-operatorio de la función miocárdica. Esto incluye la glucosa, insulina y potasio (GIK) infusión. Tanto la insulina y la glucosa puede mediar adipocytokine cambios en la expresión, por lo que debido a la grasa epicárdicos la cercanía de la miocardio, que puede ser importante a la acción paracrina el metabolismo del miocardio a través de cambios en la secreción de adipocytokine por este depósito. En consecuencia los objetivos del presente trabajo fueron: 1) caracterizar el perfil de expresión de adipocytokines epicárdicos en grasa de los pacientes sometidos a CABG en comparación con el tejido adiposo del centro y grasa de los muslos sin CAD; 2) analizar los niveles séricos de pro-y anti - Citoquinas inflamatorias en pacientes sometidos a CABG caso, y los controles y, por último, 3) evaluar el potencial efecto de las drogas y tratamientos de infusión de GIK epicárdicos adipocytokine expresión mRNA.

Materiales y métodos
Temas
La extracción de RNA

ARN fue extraído de muestras de tejido de lípidos usando RNeasy kit (Qiagen, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La extracción fue seguida de una digestión DNasa paso para eliminar cualquier contaminación de ADN genómico. ARN se cuantificaron utilizando el Nanodrop ND-1000 Espectrofotómetro (LabTech, Reino Unido) y 1 μ g de ARN de cada muestra fue transcrita invertir usando RevertAid ™ H Minus M-MuLV Reverse Transcriptase (Fermentas, Reino Unido) y hexámeros al azar, de acuerdo con las instrucciones del fabricante .

PCR en tiempo real

RT-PCR se realizó en una mezcla de reacción que contiene TaqMan PCR Universal Master Mix (AmpErase UNG), 100-200 nmol TaqMan sonda, 900 nmol primers y 25 ng cDNA para todas las reacciones de PCR excepto resistin, donde 115 ng cDNA se utilizó. Todas las reacciones fueron multiplexados con la limpieza gen 18S, siempre como un pre-control optimizado de la sonda (Applera, Reino Unido) que permite a los datos que deberán expresarse como umbral ciclo delta (Δ Ct) valores (donde Δ Ct = Ct de restar de 18 Ct de genes de interés ). Las mediciones se llevaron a cabo al menos en tres ocasiones para cada muestra. Las reacciones fueron las siguientes: 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, luego 44 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto. Primer y secuencias de la sonda para resistin, adiponectin, PAI-1, activador tisular del plasminógeno (t-PA) y AGT fueron las descritas previamente [17, 18, 23, 24]. Leptina y CD45 primers fueron diseñados utilizando Primer 3 [25] y su especificidad determina utilizando BLAST en el NCBI. Primers fueron diseñados para amplificar a través de un exón / exón frontera (leptina adelante: ACC AAA CAC CTC ATC AAG ACA ATT, la leptina inversa: TCC AAA CCG GTG TGT ACT TTC T, la leptina sonda: ATT TCA CAC TCA ACG CAG GTC CTP CTP A, CD45 adelante: CGT AAT GGA GCT AGT GCA ATG T, CD45 inversa: CTG GGA GGC CTA TTG CAC ACA, CD45 sonda: ACA acto AAA GCT AGT AAC AGC CAG CCA GTC T). TNF-α e IL-6 expresión se evaluó a través de un pre-ensayo de la expresión génica diseñadas a la carta kit (Applera, Reino Unido).

El análisis de los datos

La expresión de un gen se comparó entre los depósitos usando el método ΔΔ Ct [26]. Todas las estadísticas se realizaron en la etapa Δ Ct con el fin de excluir el posible sesgo debido a una media de los datos transformados a través de la ecuación 2 - ΔΔ Ct. El análisis estadístico se realizó mediante ANOVA o dos colas estudiante t-test a menos que se indique (12,0 SPSS para Windows, SPSS UK Ltd, Reino Unido).

Análisis de muestras de suero

Resistin (R & D Systems, UK), CRP (Diagnóstico de la Vida Inc, EE.UU.), la leptina, la insulina y adiponectin (Biogenesis, Reino Unido) y) se evaluaron mediante el uso de la norma de todas las pruebas ELISA comerciales de acuerdo con los fabricantes de los protocolos recomendados (Resistin intra - Ensayo CV 4,7%, entre el 8,4% ensayo de CV; CRP intra-ensayo CV 4,4%, entre el 3,3% ensayo de CV; Leptina intra-ensayo CV 3,7%, entre el 4,0% ensayo de CV; ensayo de la insulina dentro de la CV 5,96%, Inter-ensayo CV 10,3%; Adiponectin intra-ensayo CV 3,4%, inter-ensayo CV 5,7%;). Concentración de glucosa se determinó a través de la YSI 2300 STAT PLUS, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados
La expresión de genes en epicárdicos abdominal y depósitos

Epicárdicos tejido adiposo se evaluó la expresión de resistin, adiponectin, IL-6, CD45, AGT, TNF-α PAI -1, t-PA y de la leptina por PCR en tiempo real. Se determinó que la expresión de mRNA resistin fue 3 veces mayor en el tejido adiposo epicárdicos glútea que en el tejido adiposo (P <0,05), mientras que epicárdicos resistin expresión mRNA expresión es comparable con la observada en los depósitos de grasa abdominal (Figura 1]. En cambio, adiponectin expresión mRNA fue de 5 veces más altos que en el tejido adiposo glúteo epicárdicos que en el tejido adiposo (P <0,01). Además, el nivel de mRNA adiponectin también fue significativamente menor en el tejido adiposo epicárdicos que en cualquiera de los depósitos abdominal (P <0,01) (Figura 1]. IL-6 mRNA expresión en epicárdicos grasa fue significativamente inferior en comparación con otros depósitos abdominal (Tabla 2]. CD45 fue significativamente mayor en comparación con epicárdicos grasa abdominal y muslo depósitos (muslo vs epicárdicos P <0.01) (Tabla 2]. Los niveles de expresión de mRNA AGT fueron epicárdicos también en el aumento de la grasa en comparación con el muslo de grasa (P <0,05), mientras que la expresión de PAI-1 fue significativamente menor en el que cualquiera de los dos epicárdicos grasa abdominal subcutánea o grasa omental. Leptina mRNA expresión fue significativamente menor en los dos epicárdicos y omental tejido adiposo, en comparación con las dos subcutáneo abdominal y glútea tejido adiposo, mientras que el TNF-α no mostró diferencia detectable a través de los depósitos (Cuadro 2]. Además sub-grupo de análisis del ARN mensajero de genes entre todos los diabéticos (n = 10) vs no diabéticos (n = 36) CABG pacientes no mostró diferencias significativas.

El efecto del tratamiento farmacológico sobre la expresión de genes epicárdicos

El tratamiento con β-bloqueadores, aspirina, inhibidores de la ECA y Ca 2 + bloqueadores del canal no afecta a la adipocytokine la expresión de genes en el tejido adiposo epicárdicos (datos no presentados). Sin embargo, mientras que las estatinas también se observaron no afectar a la mayoría de los adipocytokines la expresión de la IL-6 fue alterado. La expresión de la IL-6 mRNA CABG en los pacientes que reciben tratamiento con estatinas se redujo a sólo el 16% de la cuantía expresada en los pacientes que no recibieron tratamiento con estatinas (estatinas Δ Ct = 22,8 ± 0,48 (media ± SEM); estatinas no Δ Ct = 20,1 ± 0,88, P = 0,028).

El efecto de la infusión de GIK epicárdicos la expresión de genes

La comparación de la expresión de genes entre los pacientes que recibieron GIK CABG infusión y los que no reciben GIK determinó que no hubo diferencias significativas entre los grupos en la expresión a través de todos los genes analizados (datos no presentados).

Análisis de muestras de suero

Las citoquinas pro-inflamatorias resistin fue significativamente elevados en el suero de pacientes RAC en comparación con el sano, los controles no diabéticos (P <0,01) al igual que los niveles de CRP (P <0,001) (Tabla 3]. En cambio, adiponectin fue significativamente menor en los pacientes CABG en comparación con los controles (P <0.05) (Tabla 3]. No se observaron diferencias significativas en los niveles séricos de leptina. El análisis de subgrupos de diabéticos versus no diabéticos CAD de los pacientes suero, identificó una diferencia significativa en los niveles adiponectin (diabético: 9,8 μ g / ml ± 0,9 (media ± SEM); no diabéticos: 12,7 μ g / ml ± 1,0, P <0,05 ).

Discusión

Este estudio caracteriza la adipocytokine perfil de un único humanos epicárdicos grasa de cohortes comparando esto con otros depósitos de tejido adiposo, evaluar el potencial patógeno paracrina epicárdicos papel de la grasa en el metabolismo del miocardio. Nuestro estudio demuestra que los marcadores metabólicos de riesgo y pro-inflamatorias, incluyendo resistin, TNF-α y AGT se expresaron en niveles similares en la grasa del CAD epicárdicos pacientes a los que la grasa abdominal omental de la falta de temas de CAD. El impacto de la expresión de mRNA exceso de estos factores en epicárdicos grasa puede representar un importante y de influencia directa en el metabolismo del miocardio debido a la íntima asociación de estos tejidos. A diferencia del músculo esquelético no hay separación de la fascia del miocardio, de la capa de grasa y los dos componentes comparten el mismo coronaria suministro de sangre [19]. Estudios anteriores han puesto de relieve la función paracrina de la ANG II sobre la función cardíaca. Estudios de perfusión con corazones de ratas han demostrado ANG II a reducir el flujo coronario y perjudicar la recuperación post-isquémica [27]. Como tal, regional inducción de la AGT / ANG II en humanos epicárdicos grasa que además puede agravar la disfunción miocárdica. Además, los datos sugieren que el TNF-α, la leptina y otros adipocytokines puede reducir la contractilidad miocárdica implica otro posible vínculo entre epicárdicos adipocytokine secreción y la función cardíaca [5, 28, 29]. También hemos mostrado significativamente menor expresión de ARNm adiponectin epicárdicos por el tejido adiposo que apoya el estudio anterior muestra adiponectin menor contenido de proteína en el epicardio de CABG pacientes en comparación con los no-CAD temas [30]. Con tanto anti-inflamatorios y anti-aterogénicas propiedades, locales de la secreción de los adipocitos esta molécula específica bien puede ser importante para la función de la salud del corazón y, como tal, un nivel reducido de expresión por epicárdicos grasa puede representar un factor importante en el desarrollo de CAD.

Además, se dirigió a la posible contribución de los macrófagos hacia el aumento de la expresión de genes inflamatorios en epicárdicos perfil de grasa en comparación con otros depósitos de grasa. Utilizando la expresión mRNA CD45 como marcador de macrófagos, hemos determinado que epicárdicos tejido adiposo mostraron niveles elevados de la infiltración de macrófagos en comparación con los depósitos de grasa no CABG temas. Estudios anteriores también han destacado el aumento de la infiltración de macrófagos en la grasa epicárdicos [22]. El alto nivel de infiltración de macrófagos y activación de este importante depósito indica que se está produciendo una inflamación local. Los macrófagos son conocidos por expresar altos niveles de muchos inflamatoria adipocytokines incluidos resistin [31] y puede que representan gran parte de la inflamación perfil de la expresión genética observada. En este contexto, es de destacar que la grasa epicárdicos en este estudio mostraron bajos niveles de expresión de mRNA de IL-6 en comparación con otros depósitos de grasa abdominal. Aunque los informes han implicado la IL-6 como una citoquina pro-inflamatoria, estudios recientes han sugerido propiedades anti-inflamatorias [32, 33]. Es evidente que los niveles de IL-6 se plantean en el estado inflamatorio, pero si esto es como parte integrante de la respuesta o de reacción que se le sigue equívoca. Además, los niveles séricos de ambos IL-6 y TNF-α están planteadas en el CAD pacientes [34] que implica que la disminución de la expresión de IL-6 se localiza al tejido epicárdicos. Si, como sugiere Febbraio, Pedersen y otros, IL-6 juega un papel anti-inflamatorio y es beneficiosa para ambas la captación de glucosa y metabolismo de los lípidos entonces los niveles más bajos de ARNm epicárdicos expresión en el tejido adiposo de pacientes CABG sólo pueden servir para aumentar la Disfunción miocárdica en el metabolismo de los combustibles [32, 33]. El panorama se complica aún más por nuestra conclusión de que la IL-6 de expresión se ha reducido drásticamente en los temas en tratamiento con estatinas. Estudios anteriores han demostrado que el tratamiento con estatinas puede reducir los niveles circulantes de IL-6 [35], así como su expresión en determinados tipos de células incluyendo monocitos circulantes [36].

Análisis sistémico suero de los pacientes sometidos a CABG determinado planteadas resistin y niveles de PCR, mientras que se redujeron los niveles adiponectin, esta reducción está exacerbado CAD en pacientes con diabetes. La reducción prevista en los niveles séricos de adiponectin confirmó informes anteriores [37], con una correlación negativa entre la PCR sérica y los niveles adiponectin ya identificados [38]. Sin embargo, este estudio es el primer informe a los niveles más altos de suero resistin ECV en los pacientes.

En conclusión, este estudio arroja luz sobre el papel de tejido adiposo humano epicárdicos como posible paracrinos y / o tejido endocrino, específicamente en el contexto de riesgo cardiovascular. Epicárdicos tejido adiposo muestra un patrón similar de expresión de un número de clave adipocytokines a la de tejido adiposo omental. También hemos confirmado un alto nivel de infiltración de macrófagos en este depósito, que pueden contribuir a la expresión de genes patógenos perfil en este tejido. Omental adiposidad ha demostrado ser un predictor independiente de riesgo metabólico, con un aumento de resistin, AGT y PAI-1 mRNA expresión en representación importante de mediadores inflamatorios, trombóticos y fibrinolítica riesgo [16]. Los bajos niveles de adiponectin, que es cada vez más asociada con el síndrome metabólico y riesgo cardiovascular [39], refuerza el argumento de que en los pacientes CABG epicárdicos tejido adiposo representa una influencia negativa en los resultados cardiovasculares y la función miocárdica. Debido a la CAD de los pacientes del miocardio, la historia pudo haber sido directamente afectado por el insulto isquémico, el perfil de expresión de genes que hemos descrito pueden, por tanto, no ser representativos de la normalidad epicárdicos tejido adiposo. Se requieren estudios adicionales con el fin de evaluar el efecto directo de estos factores en cardiomiocitos y para establecer el papel de la grasa de depósito en epicárdicos no CAD temas.

Contribuciones de los autores

AB llevó a cabo el suero estudios, contribuyó a los estudios de la expresión de genes y el análisis estadístico y redactó el documento. NFS contribuido al análisis estadístico. DQ llevado a cabo la recogida de datos y muestras clínicas. AH contribuido a los estudios de la expresión génica. DP & RB contribuido al diseño del estudio y coordinado de las cohortes de pacientes y recogida de muestras clínicas. SK & PM concibe el estudio y contribuyó al análisis de datos y la redacción del documento.

Agradecimientos

Esta labor fue apoyada por el Dunhill Medical Trust. Damos las gracias a todos los cirujanos y el personal médico en el Priorato y Hospitales de la Reina Isabel, y también a Michelle Lauer por su asistencia técnica.