Journal of Neuroinflammation, 2005; 2: 29-29 (más artículos en esta revista)

Estimulación de los receptores cannabinoides 2 (CB 2) suprime la activación microglial

BioMed Central
Jared Ehrhart (jehrhar1@hsc.usf.edu) [1], Demian Obregon (dobregon@gmail.com) [1], Takashi Mori (tmori@hsc.usf.edu) [1], Huayan Hou (hhou @ hsc. Usf.edu) [1], Sun Nan (nansun@hsc.usf.edu) [1], Bai Yun (yunbai@hsc.usf.edu) [1], Thomas Klein (tklein@hsc.usf.edu) [ 4], Francisco Fernández (FFernandez@hsc.usf.edu) [1], Jun Tan (jtan@hsc.usf.edu) [1], R Douglas Shytle (dshytle@hsc.usf.edu) [1]
[1] Neuroimmunlogy Laboratory, Silver Child Development Center, Department of Psychiatry and Behavioral Medicine, University of South Florida College of Medicine, Tampa, FL 33613, USA
[2] Institute of Medical Science, Saitama Medical School, Saitama 350-8550, Japan
[3] Departamento de Genética Molecular, en la Tercera Universidad de Medicina, Chongqing, China
[4] Department of Medical Microbiology and Immunology, University of South Florida College of Medicine, Tampa, FL 33613, USA
[5] Center for Excellence in Aging and Brain Repair, Department of Neurosurgery, University of South Florida College of Medicine, Tampa, FL 33613, USA
[6] Department of Pharmacology and Therapeutics, University of South Florida College of Medicine, Tampa, FL 33613, USA

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Resumen
Antecedentes

Activado microglial células han sido implicados en una serie de enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Alzheimer (EA), esclerosis múltiple (EM), el VIH y la demencia. Es bien sabido que los mediadores de la inflamación, tales como el óxido nítrico (NO), citocinas y quimiocinas juegan un papel importante en la célula microglial asociada a la neurona daño celular. Nuestros estudios previos han demostrado que la señalización CD40 está implicada en la activación patológica de las células microglial. Muchos datos revelan que los cannabinoides mediar supresión de la inflamación in vitro e in vivo a través de la estimulación de los receptores cannabinoides 2 (CB 2).

Métodos

En este estudio, hemos investigado los efectos de un agonista cannabinoide en la expresión y función de CD40 por las células cultivadas microglial activa por IFN-γ mediante RT-PCR, inmunotransferencia, citometría de flujo, y anti-CB 2 pequeños RNA de interferencia (ARNsi) análisis. Además, hemos examinado si la estimulación de CB 2 podría modular la capacidad de las células microglial a phagocytise Un péptido β 1-42 utilizando un ensayo de la fagocitosis.

Resultados

Hemos encontrado que la estimulación selectiva de los receptores cannabinoides CB 2 por JWH-015 reprimidas IFN-γ inducida por CD40 expresión. Además, este agonista CB 2 marcadamente inhibida IFN-γ inducida por fosforilación de JAK/STAT1. Además, esta estimulación también pudo reprimir microglial TNF-α y de la producción de óxido nítrico, ya sea inducida por IFN-γ o un péptido β reto en la presencia de CD40 ligadura. Por último, puso de manifiesto que la activación por 2 CB JWH-015 marcadamente atenuada CD40 mediada por la inhibición de la fagocitosis microglial de un péptido β 1-42. En conjunto, estos resultados proporcionan una idea de mecánica efectos beneficiosos proporcionados por receptores cannabinoides CB 2 modulación en las enfermedades neurodegenerativas, en particular AD.

Antecedentes

La mayoría de las enfermedades neurodegenerativas están asociados con la inflamación crónica como resultado de la activación de las células cerebrales mononuclear fagocítico, llamado microglial células [1]. Debido a una mayor proliferación de las células microglial se observa en los cerebros de pacientes con esclerosis múltiple (EM) [2], la enfermedad de Alzheimer (EA) [3], y el VIH [4], y debido a la activación microglial sostenido, en relación con estas enfermedades, que se conoce De tener efectos perjudiciales sobre las neuronas circundantes. [5], los factores de mediación de activación microglial son de gran interés.

La marihuana y su constituyente activo, Delta) (9-tetrahidrocannabinol (THC), suprimir las células de la respuesta inmune mediada (para revisión, véase. [6]]. Muchos de estos efectos son mediados por los receptores cannabinoides 2 (CB 2), como lo demuestra el hecho de que el THC inhibe la ayuda de la activación de células T por normal, pero no CB-2 knockout derivados, macrófagos [7]. Si bien muchos estudios han investigado los efectos de los cannabinoides sobre la función inmunológica, pocos estudios han examinado sus efectos sobre la vía CD40 [8].

El CD40 es un receptor de 50 kDa de tipo I phosphoprotein miembro del factor de necrosis tumoral (TNF)-receptor (TNFR) superfamilia, que se expresa en una gran variedad de células [8]. El ligando de CD40 (CD154, es decir, CD40L) es principalmente expresada por activados CD4 + T-células. Después de la ligadura de CD40, numerosas células de tipo dependen de los productos básicos se activan vías de señalización, que producen cambios en la expresión génica y función. Estos cambios incluyen varias vías de transducción de señales: factor nuclear kappa B (NF-κ B), mitogen-activated proteínas quinasas (MAP), TNFR-factor asociado proteínas, fosfatidilinositol-3 kinasa (PI3K), y la quinasa Janus (JAK) / Transductor de señales y activador de la transcripción 1 (STAT1) vía. [9, 10]. Ligadura de las células CD40 en microglial conduce a la producción de TNF-α y otras neurotoxinas no identificados [11 - 13]. Así, la señalización a través de microglial en las células CD40 induce mediadores solubles que podría tener importantes funciones en el sistema nervioso central (SNC).

En el cerebro normal, microglial células mostrar un fenotipo quiescente, incluida la baja expresión CD40 [14]. Sin embargo, a insultar al cerebro, microglial convertirse en células altamente activado, modificando su fagocitosis y la presentación de antígeno funciones [15], así como la producción de citoquinas [13]. Montaje de pruebas implica microglial CD40 como contribuir a la iniciación y / o la progresión de varias enfermedades neurodegenerativas [15]. De hecho, el bloqueo de las interacciones CD154-CD40 por una estrategia de neutralización de los anticuerpos murinos impide la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), la actividad de la enfermedad [16 - 19], así como AD-como patología en modelos de ratón de la enfermedad [20].

Dada la reciente descripción inmunomoduladores papel de los cannabinoides, la importancia de la interacción CD40-CD40L en neuroinflammatory enfermedades, y la clínica y estudios de ciencia básica que sugiere que los cannabinoides pueden ser terapéuticas en el AD y MS, [21 - 25], se examinaron, en el presente Estudio, si los cannabinoides (CB 2 agonista principalmente JWH-015) puede oponerse microglial expresión CD40 siguientes interferón-γ (IFN-γ) desafío. Además, examinó si CB 2 agonista JWH-015 influye en la función fagocitaria microglial y / o la producción de citoquinas proinflamatorias CD40 después de la ligadura.

Materiales y métodos
Los péptidos y las drogas

Un péptido β 1-42, pureza superior al 95% de acuerdo a las instrucciones del fabricante análisis HPLC, se obtuvo de QCB (Hopkinton, MA). Un péptido β 1-42 utilizado para todos los experimentos se hizo fibrilar / agregados, como ha sido descrito previamente [26]. En resumen, 2 mg de A β 1-42 se añadió a 0,9 ml de agua pura (Sigma), la mezcla se vortex, y 100 μ l de PBS, de 10 × (1 × PBS contiene NaCl 0,15 M, 0,01 M de fosfato de sodio, pH 7,5) Y se añadió la solución se incuba a 37 ° C por 24 hr. El Cy3-A conjugación del péptido β se llevó a cabo en estricta conformidad con las instrucciones del fabricante descritas protocolos. En pocas palabras, un β 1-42 se disolvió en 0,15 M de cloruro de sodio y Cy3 mono-reactiva NHS éster (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) fue diluido en dimetil sulfóxido (DMSO) a una concentración de 10 mg / ml y esto se añade lentamente A la A β 1-42 solución agitando. El Cy3-A β 1-42 solución fue protegido de la luz mientras agita durante 45 minutos a temperatura ambiente. Para separar la libre Cy3-tinte, la solución fue dializados contra 1 L, de 0,15 M de cloruro de sodio para 4 horas a temperatura ambiente. La solución fue entonces intercambiaron fresco con 0,15 M de cloruro de sodio y dializados la noche a 4 ° C. Al día siguiente el Cy3-A β 1-42 solución fue dializados contra 1 L de PBS 0,1 M durante 4 horas a temperatura ambiente, y de nuevo la noche a la mañana utilizando dializados fresca 0,1 M PBS. La solución fue entonces jeringuilla esterilizada a través de un filtro de 0,22 μ m-filtro y el efluente se alicuotar y almacenados a -20 ° C hasta su utilización. No selectivo agonista cannabinoide (CP 55940), CB 2 agonista (JWH-015), y el THC se obtuvieron de Tocris (Ellisville, MO) y disuelta en 1% DMSO a una concentración stock de 50 mM.

Microglial animales y cultivos celulares

Parejas reproductoras de ratones BALB / c fueron comprados a Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y de los animales alojados en las instalaciones de la Universidad del Sur de la Florida, de la Facultad de Medicina. Murino primaria de la cultura microglial células fueron aisladas de ratón cerebral cortices y crecido en RPMI 1640 suplementado con 5% de suero de ternera fetal (FCS), 2 mM de glutamina, 100 U / ml de penicilina, 0,1 μ g / ml estreptomicina, y 0,05 mM 2-mercaptoetanol De acuerdo a métodos descritos anteriormente [27]. En pocas palabras, cortices cerebral de ratones recién nacidos (1-2 días de edad) fueron aislados, en condiciones estériles y se mantuvieron a 4 ° C antes de la disociación mecánica. Las celdas eran de plata de en 75-cm 2 frascos y completo medio se añadió. Cultivos primarios se mantuvieron por 14 días a fin de que sólo las células gliales y se mantuvo microglial células fueron aisladas agitando frascos a 200 rpm en una incubadora Lab-Line-agitador. Más del 98% de estas células gliales manchadas microglial marcador positivo para Mac-1 (CD11b/CD18; Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN; datos no presentados). Todos los animales protocolos fueron aprobados por el Comité de Investigación Animal de la Universidad del Sur de la Florida, de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud. N9 microglial células fueron cultivadas a lo descrito previamente [28].

La transcriptasa inversa (RT)-PCR análisis

ARN total fue aislado de las células primarias cultivadas microglial utilizando reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), como se recomienda en el protocolo del fabricante. Concentración de ARN se determinó mediante espectrofotometría a 260 nm. RT-PCR se realizó como se describió anteriormente [28]. En pocas palabras, cDNA se prepara mezclando 1 μ g de RNA total de cada tratamiento con un oligo (dT) y el primer MMLV la transcriptasa inversa (Invitrogen), la mezcla de reacción se incubó en un 37 ° C el agua de baño durante 50 minutos antes de la inactivación de calor De la mezcla mediante el aumento de la temperatura a 70 ° C durante 10 min. Este cDNA mezcla de reacción (20 μ l) fue diluido con 180 μ l de DNAase / RNAase libre de agua y 10 μ l de la solución de ADNc se usó PCR para genes específicos. La PCR primers utilizados fueron 2 CB sentido: 5'-GAA AAG CCG AGG ATG GCA ATG AAT-3 'y antisentido: 5'-CTG CTG AGC GCC CTG GAG AAC-3' oligonucleótidos fueron diseñados para producir el parcial de 239 bp ratón CB 2 cDNA (MGI: 104650); ratón β-actina sentido: 5'-AGA TTG AAC CCC TCA ACA-3 'y β-actina antisentido: 5'-GCA GCT AGC CAT TCT TCT-3', que el rendimiento de las 357 bp Β-actina fragmento de cDNA. Las muestras no fueron sometidos a la transcripción reversa correr en paralelo con el control técnico de errores que dan lugar a la contaminación de ADN (datos no presentados). Mouse β-actina es más grande de todas las muestras como de limpieza para normalizar la expresión de genes. Un control (sin plantilla) se incluyó para cada primer set. PCR se realizó con cada ciclo consta de 94 ° C durante 1 min, 55 ° C por 2 min, y 72 ° C por 2 min, seguido de un paso de extensión final a 72 ° C durante 10 min. PCR ciclo de los números se mantuvieron bajos para llevar a cabo semi-PCR cuantitativa (actina, 25 ciclos; CB 2 30 ciclos). Productos de PCR se resolvieron en el 1,2% de bromuro de etidio geles de agarosa teñidos, y visualizados por transiluminación ultravioleta.

Análisis de citometría de flujo microglial expresión CD40

Primaria microglial células fueron cultivadas en plata de 6-y el cultivo de tejidos placas a los 5 × 10 5 células / pozo e incubadas con THC, CP55940 o CB 2 agonista (JWH-015) en dosis diferentes en la presencia o ausencia de IFN-γ (100 U / ml). Doce horas después de la incubación, microglial estas células fueron lavadas con buffer de flujo [PBS que contenía 0,1% (w / v) de azida sódica y el 2% (v / v) FCS] y re-suspendido en 250 μ l de helado de amortiguación del flujo de fluorescencia Activado la célula de clasificación (FACS) análisis, de acuerdo con los métodos descritos anteriormente [28]. Brevemente, las células fueron pre-incubadas con anticuerpos anti-ratón CD16/CD32 anticuerpo monoclonal (clon 2.4G2, PharMingen, Los Angeles, CA) por 10 min a 4 ° C para bloquear una unión no específica a los receptores Fc. Las células fueron entonces hilar abajo a 5000 g lavados 3 veces con la corriente de amortiguación y luego incubadas con hámster ratón anti-CD40-FITC o isotipo control de anticuerpos-FITC (1:100 dilución; PharMingen) en la corriente de amortiguación. Después de los 30 min de incubación a temperatura ambiente, las células fueron lavadas dos veces con la corriente de amortiguación, de nuevo suspendida en 250 μ l de buffer de flujo y analizadas por un instrumento ™ FACScan (Becton Dickinson, Franklin Carriles, NJ). Un mínimo de 10000 células fueron aceptadas para su análisis FACS. Las células fueron con acceso basado en características morfológicas de manera que las células apoptóticas y necróticas no se acepta el uso de análisis FACS ™ software CellQuest (Beckton Dickinson). Los porcentajes de células positivas (es decir, que expresan CD40-) se calculará de la siguiente manera: para cada tratamiento, la media del valor de fluorescencia para el control de isotipo concordancia de anticuerpos fue restada de la media de fluorescencia de valor para el CD40-de anticuerpos específicos.

Inmunotransferencia análisis

Lisados de células murinas microglial (incluyendo primaria microglial células cultivadas) se prepararon de helado buffer de lisis (20 mM Tris, pH 7.5,150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% Tritón X-100, 2,5 mM de pirofosfato de sodio , 1 mM glycerolphosphate, 1 mM Na 3 VO 4, 1 μ g / ml leupeptina, y 1 mM PMSF) y concentración de proteínas fue determinada por el Bio-Rad proteína de ensayo a lo descrito previamente [29]. Una alícuota correspondiente a 100 μ g de proteína total de cada muestra fue separada por SDS-PAGE y la electroforesis transferidos a membranas PVDF immunoblotting. Inespecíficos unión de los anticuerpos fue bloqueada con 5% de leche sin grasa de 1 hora a temperatura ambiente en solución salina tamponada de Tris-(20 mM Tris y 500 mM NaCl, pH 7,5). Posteriormente, estas membranas se hibridó con la primera cabra anti-CB 2 de anticuerpos (1:100 dilución; Santa Cruz) para 2 horas y luego se lavan 3 veces en TBS y immunoblotting usando un anti-cabra conjugado HRP-secundaria de anticuerpos IgG como un trazador (Pierce Biotechnology, Inc Rockford, Illinois). Reactivo luminol (Pierce Biotechnology, Inc) fue utilizado para desarrollar la blots. Para demostrar la igualdad de la carga, la misma de las membranas fueron despojados con β-mercaptoetanol stripping solución (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8,2% SDS, y 100 mM β-mercaptoetanol), y, por último, volver a determinada con anticuerpo monoclonal de ratón Β-actina (Pierce Biotechnology, Inc).

Análisis inmunohistoquímico

Seis ratones (10 semanas de edad, 3 hombres / 3 mujeres, C57 BL/6N; Crea, Tokio, Japón) se utilizaron para examinar la expresión de CB 2 en células microglial. Después de los ratones fueron sacrificados con una sobredosis de pentobarbital sódico (50 mg / kg), el cerebro se transcardinally perfundidos con 200 mL de 10 U / mL de solución salina en heparina seguida de 200 ml de paraformaldehído al 4% en 0,1 M (pH 7.4) PBS. Los cerebros fueron removidos y fijados en el mismo fijador de la noche a 4 ° C, deshidratado, y habitualmente incluidas en parafina, con 16 horas de procesamiento. Para la detección in situ de CB 2, secciones (5 μ m de espesor) fueron premeditados, y por deparaffinized hidrolíticas autoclave en 10 mM citrato buffer (pH 6.0) durante 15 minutos a 121 ° C para obtener los antígenos. Posteriormente, las secciones fueron tratadas con peroxidasa endógena refrescante (0,3% H 2 O 2 durante 10 min) y pre-bloqueada con suero sin solución de bloqueo (DAKO, Carpinteria, CA) durante 30 min antes de la incubación primaria de anticuerpos. La inmunohistoquímica se realizó de acuerdo al protocolo del fabricante utilizando el kit de Elite Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA), junto con la reacción diaminobenzidine. Por doble etiquetado de 2 y Iba CB-1 (marcador de célula microglial) en secciones congeladas, otros seis ratones fueron sacrificados con la misma anestesia que arriba, y entonces el cerebro se transcardially perfundidos con 200 mL de 10 U / mL de heparina en solución salina . Cerebros de ultracongelados a -80 ° C durante la crio-sección (5 μ m de espesor). Antes de inmunohistoquímica, congelados secciones fueron fijadas con paraformaldehído al 4% en 0,1 M (pH 7.4) PBS para 1 hora, y pre-bloqueada con suero sin solución de bloqueo (DAKO, Carpinteria, CA) durante 30 min. Los siguientes primaria y secundaria de anticuerpos fueron utilizados: cabra anti-ratón CB 2 de anticuerpos (1:400 dilución; Santa Cruz biotecnologías), de conejo anti-C-terminal de Iba-1 anticuerpo (1:500 dilución; Wako Pure Industrias químicas, Osaka , Japón), FITC-conjugado burro cabra anti-IgG (1:50 dilución; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA), y la peste porcina TRITC-conjugado IgG anti-conejo (1:50 dilución; DAKO, Carpinteria, CA). Además, para una prueba de neutralización (antes de la prueba de absorción), de cabra anti-ratón anticuerpo CB 2 se pre-incubaron durante 30 minutos con un cinco veces (w / v), el exceso de ratón CB 2 bloqueo péptidos (Santa Cruz biotecnologías) . Considerando que el control del isotipo apropiado suero o PBS se utilizó en lugar de anticuerpos primarios o ABC reactivo como un control negativo, el bazo se utilizó como control positivo. Counterstaining se realizó con hematoxilina.

CB 2 pequeños RNA de interferencia

N9 células fueron transfectadas con especial orientación murino CB 2 ARNsi diseñado para desmontables murino CB 2 expresión (Humesis Biotecnología Corporation, de Nueva Orleans, LA). En pocas palabras, N9 células fueron sembradas en placas de 24 y así hasta que llegó cultivadas 70% confluency. Las células fueron transfectadas con 100 nM anti-CB 2 ARNsi o de lucha contra la proteína verde fluorescente (GFP, no de control de la orientación; Humesis) utilizando Código-Breaker transfección reactivo (Promega, Madison, WI) y cultivadas a otros 18 hr en MEM sin suero. Las células se recuperarse a las 24 Horas de en medio completo (MEM el 10% de SFB) antes de los tratamientos. Las células fueron evaluadas por immunodetection occidental de la expresión de CB 2 usando anti-CB 2 anticuerpos (Santa Cruz), a raíz ARNsi tratamiento. Las células fueron cultivadas también por 4 h con LPS, JWH-015, o varias combinaciones, y la liberación de TNF-α se midió específicas ensayo inmunoenzimático (ELISA). Transfección eficiencia está decidido a ser superior al 80% (datos no presentados) sin usar-RISC siGLOW obtenidos de Dharmacon (Lafayette, CO).

TNF-α y NO (óxido nítrico) los análisis

Murino primaria microglial células fueron cultivadas en plata de 24 y placas de cultivo de tejidos (Costar, Cambridge, MA) en el 1 × 10 5 células por bien y estimulado por 24 horas, ya sea con IFN-γ (100 U / ml) / proteína CD40L ( 2,5 μ g / ml) o un β 1-42 (3 μ M) / CD40L proteína (2 μ g / ml) en presencia o ausencia de CB 2 agonista JWH-015 (5 μ M). Cell-libre sobrenadantes fueron recolectados y almacenados a -70 ° C hasta el análisis. TNF-α y NO los niveles en los sobrenadantes se han examinado utilizando los kits de ELISA (R & D Systems) y NO ensayo (Calbiochem), en estricta conformidad con los fabricantes de protocolos. Cell lisados También se prepararon y el Bio-Rad proteína de ensayo (Hercules, CA) se ha realizado a la medida total de proteínas celulares. Los resultados se muestran como media pg de TNF-α o NO por mg de proteína total celular (+ / - SD).

JAK/STAT1 vía de señalización análisis

Primaria cultura microglial células fueron chapada en 6-placas de cultivo de tejidos y en una densidad de 5 × 105 células por igual y co-incubadas con IFN-γ (100 U / mL) en presencia o ausencia de un rango de dosis de 2 agonista CB (0,31, 0,62, 1,25, 2,5 y 5,0 μ M) durante 30 min. Al final del periodo de tratamiento, las células se lavaron microglial en helado PBS tres veces y lisadas en helado lisis de amortiguación. Después de una incubación de 30 min en hielo, las muestras fueron centrifugadas a alta velocidad durante 15 minutos, y sobrenadantes fueron recolectados. Total de contenido de proteínas se estimó mediante el Bio-Rad proteína ensayo. Por fosforilación de JAK1 y JAK2, las membranas fueron hibridada con fosfato Tyr1022/1023 JAK1 específicos o de anticuerpos Tyr1007/1008 JAK2 (Señalización Cell Technology, Beverly, MA) y, a continuación, y finalmente despojado analizados por JAK1 total o JAK2 anticuerpos. Por STAT1 fosforilación, las membranas se probaron con un fosfato Ser727 STAT1 anticuerpos (Célula de Señalización de Tecnología) y despojados con stripping solución y volver a determinada con un anticuerpo que reconoce total STAT1 (Tecnología de Señalización Celular). Alternativamente, las membranas con idénticas muestras se probaron ya sea con fosfato o JAK STAT1, o con un anticuerpo que reconoce JAK total o STAT1. Immunoblotting se realizó con un anticuerpo primario seguido de un anti-conejo conjugado HRP-secundaria de anticuerpos IgG como un trazador. Después de TBS en el lavado de las membranas fueron incubadas en el reactivo luminol y expuestos a rayos X película.

Microglial A β ensayos de fagocitosis

Microglial fibrilar de la fagocitosis / agregados Un péptido β 1-42 se llevó a cabo de manera similar a la descrita previamente protocolos [30 - 32]. Microglial células fueron cultivadas en el 5 × 10 5 / 6-así en el tejido de la cultura y las placas de vidrio con inserciones (por microscopía de fluorescencia). Al día siguiente, microglial células fueron tratadas con Cy3 conjugada A-β 1-42 (3 μ M) y CD40L proteína (2,5 μ g / ml) en presencia o ausencia de CB 2 agonista (5 μ M) de 3 hr. Paralelamente platos, microglial células fueron incubadas con Cy3 conjugada A-β 1-42, en las mismas condiciones de tratamiento anterior, salvo que se incubaron a 4 ° C en el control de la no específicamente celular asociación de Cy3-A β 1-42. Microglial células fueron entonces Enjuagarse 3 veces en un 1-42 β-libre completa a medio y el medio se intercambió con un fresco β 1-42-libre completa mediano durante 10 minutos para permitir que tanto la eliminación de los no-incorporado Cy3-A β 1-42 y promover la concentración de La Cy3-A β 1-42 péptido en phagosomes. Este medio fue retirada y microglial células fueron lavadas 3 veces con helado de PBS. Por microscopía de fluorescencia, microglial en las células de vidrio coverslips se fijaron durante 10 minutos a 4 ° C, con un 4% (w / v) paraformaldehido (PFA) diluido en PBS. Después de tres sucesivos aclarados en TBS, microglial núcleos celulares fueron detectados por incubación con DAPI durante 10 minutos y, por último, montado con fluorescencia de montaje Slow Fade medios de información que contienen reactivos antifading (Molecular Probes, Eugene, OR) y, a continuación, visto bajo un microscopio de fluorescencia Olympus IX71/IX51 Equipado con un sistema de cámaras digitales para permitir la captura digital de imágenes (40 ×).

Inmunoblot para la detección de células β-Un asociado, primaria microglial células fueron 6-chapada en el cultivo de tejidos y placas de vidrio con inserciones en el 5 × 10 5 células / así y tratados como se describe para immunofluorescense detección de Cy3-A β 1-42 salvo que estos experimentos Un empleado β 1-42. Immunoblotting se llevó a cabo con el monoclonal anti-β Un anticuerpo humano (BAM-10, 1:1000 dilución; Sigma), seguido de un anti-IgG de ratón-HRP como un trazador. Blots fueron desarrollados utilizando la Immun-Star quimioluminiscencia sustrato. Las membranas fueron despojados y volver a una referencia determinada con anti-β-actina de ratón anticuerpo monoclonal, que permite la cuantificación de la banda de densidad de A β a β-actina por análisis densitométrico.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como media + / - SD. Todas las estadísticas se analizaron utilizando una sola dirección múltiple gama análisis de la varianza (ANOVA) de prueba para comparaciones múltiples. Un valor de p <0,05 fue considerado significativo.

Resultados
Estimulación de CB 2 inhibe IFN-γ inducida expresión CD40 en las células microglial

En estudios anteriores, nosotros, y otros, mostraron que la expresión constitutiva de los niveles de CD40 en las células puede ser microglial inducida en respuesta a IFN-γ desafío [28, 33]. Recientemente hemos informado de que el tratamiento lovastatina inhibe la expresión CD40 en las células cultivadas microglial [34]. Para investigar cannabinoide regulación de la expresión CD40 en las células microglial, primaria murino microglial células cultivadas fueron tratados con IFN-γ (100 U / ml) en presencia o ausencia de THC, CP55940 o JWH-015 durante 12 horas y la expresión de CD40 era Analizadas por citometría de flujo. Como era de esperar, el tratamiento de las células cultivadas microglial con THC, CP55940 y JWH-015, inhibió CD40 expresión inducida por IFN-γ (Figura 1A]. El tratamiento con el agonista CB 2, JWH-015, inhibido IFN-γ-CD40 induce la expresión de una manera dosis-dependiente (Figure. 1B]. Además, Western Blot examen mostró que constantemente JWH-015 co-tratamiento mitiga la inducible aumento de la expresión de la proteína CD40 en la enseñanza primaria microglial células cultivadas después de IFN-γ tratamiento (Figure. 1C, D]. En conjunto, estos resultados sugieren que la estimulación de CB 2 disminuye la expresión CD40 en las células primarias cultivadas microglial.

Microglial células Express CB 2

Para examinar si CB 2 podría ser expresado en células cultivadas microglial, primero aisló ARN total de la primaria microglial células cultivadas de la transcriptasa inversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) análisis. Los resultados muestran que CB 2 mRNA es constitutivamente expresada en primaria de las células cultivadas microglial (Figure. 2A] y, más importante aún, es significativamente mayor después de IFN-γ (50 U / ml y 100 U / ml) problema (Figure. 2A, B] . Además, la Figura 2C y 2D, CB 2 muestran que la proteína se detecta en la enseñanza primaria microglial células cultivadas, y es también aumentó notablemente tras el desafío con IFN-γ, por Western Blot. Para seguir evaluando CB 2 expresión microglial en las células, se realizó inmunohistoquímica en el cerebro del ratón adulto, y encontraron que las células adultas de ratón microglial manchadas positivamente para CB 2 (Figure. 2E, arriba). Para descartar la posibilidad de que las células microglial no específicamente obligado anti-anticuerpo CB 2, que pre-absorbido la cabra anti-ratón CB 2 con anticuerpos de ratón CB 2 bloqueo péptido. CB La señal 2 es reducido en el cerebro del ratón cuando el péptido está bloqueando empleados (datos no presentados). Además, indicó que el análisis inmunohistoquímico de la expresión CB 2 por microglial células fue co-localizada con marcador de célula microglial Iba-1 (Figure. 2E, la parte inferior).

Anti-CB 2 pequeños RNA de interferencia bloqueado efecto de CB 2 agonista tratamiento JWH-015

N9 células transfectadas para 18 Horas, con especial orientación murino CB 2 ARNsi (100 nM), fueron tratados durante 4 h con LPS, JWH-015, o en varias combinaciones, y la liberación de TNF-α se midió por ELISA (Figura 3A]. Anti-CB 2 ARNsi fue capaz de abolir completamente JWH-015 mediada por las reducciones de LPS inducido por TNF-α liberación. Además, para evaluar la eficiencia knock-down, se realizó el Western blot usando anti-CB 2 de anticuerpos y encontró una significativa disminución del nivel de expresión en el CB 2 ARNsi transfectadas condición (Figura 3B]. Estos datos indican que JWH-015 es activar CB 2 a oponerse a la liberación de TNF-α LPS causados por el tratamiento.

CB 2 agonista inhibido JAK / STAT de señalización inducida por IFN-γ en células microglial

Informes anteriores demuestran la capacidad de IFN-γ inducen a potentemente microglial CD40 expresión [28]. La vía de transducción de señales involucradas en esta inducción más probable es que involucra elementos de la JAK / STAT vía de señalización [35, 36]. Curiosamente, muchos de los factores (citoquinas, neurotrophins, neuropéptidos, estatinas) que inhiben el IFN-γ-microglial inducida expresión CD40 hacerlo por la modificación de JAK / STAT vía [34 - 39]. Por lo tanto, hemos examinado los efectos de la estimulación de CB 2 en el JAK / STAT principal vía de señalización en las células cultivadas microglial. Microglial células cultivadas fueron tratados con IFN-γ durante 30 minutos en la presencia o ausencia de un rango de dosis de 2 agonista CB JWH-015. Inmunotransferencia análisis reveló que el tratamiento JWH-015 mitigado notablemente JAK1 Tyr1022/1023 y JAK2 Tyr1007/1008 fosforilación en forma dosis-dependiente (Figure. 4A, B]. Además, es bien sabido que el IFN-γ durante la interacción con su heterodimer de receptores de citoquinas tipo II, la JAKs están directamente activado conduce a la fosforilación STAT1 [35, 36, 38]. En consecuencia, se examinaron los efectos de la estimulación CB 2 fosforilación de STAT1, en el mismo rango de dosis se ha mencionado anteriormente, el principal microglial células tratadas con IFN-γ durante 30 min. Los resultados mostraron que JWH-015 co-tratamiento inhibió Ser727 fosforilación de la proteína STAT1 en 10 μ M (Figure. 3C]. No microglial células muestran muy poco detectable JAK1, 2 o fosforilación de STAT-1 (datos no presentados).

Estimulación de 2 CB funcional CD40 inhibe la señalización en las células microglial

Para examinar las consecuencias funcionales de CB 2 agonista de la expresión CD40 en el tratamiento, nos estimuló primaria microglial células de ratón, ya sea con IFN-γ / CD40L proteínas [28, 40, 41] o un β 1-42 / CD40L proteína en la presencia o ausencia de JWH -015 Para 24 Horas. Sobrenadantes de cada condición de tratamiento fueron examinadas por ELISA de moléculas pro-inflamatorias que hemos descrito previamente como microglial inducida por la ligadura de CD40 [14, 27 - 31]. Como es de esperar, ELISA mediciones revelaron que ninguna de IFN-γ / CD40L o un β 1-42 / CD40L aumento de la secreción de las moléculas pro-inflamatoria TNF-α y NO, como se indica en la figura 5A y 5B. Sin embargo, cuando CB 2 es estimulada por la presencia de JWH-015, estas moléculas pro-inflamatorias se redujo significativamente. La función canónica microglial en el SNC se piensa que es la fagocitosis, y dado que el IFN-γ y de señalización CD40 maduración son agentes que se oponen a esta función fagocitaria [15, 42 - 47], se examinó si CB 2 agonista co-tratamiento de rescate podrían microglial Fagocíticas función. Murino primaria microglial cultivos fueron expuestos a 3 μ M de A β 1-42 (de immunoblotting) o Cy3 ™ - A β 1-42 (ensayo de la fagocitosis), en la presencia o ausencia de la proteína CD40L o CD40L protein/JWH-015. Después de 3 horas, la cantidad de phagocytosed Un péptido β 1-42 se determinó por inmunofluorescencia estudios tanto cualitativos (Figura 6A], y con los experimentos cuantitativos immunoblotting (Figura 6B y 6C]. Como se muestra en la Figura 6A, CD40 ligadura de la función fagocitaria microglial disminuido en comparación con los controles (Figura 6A, grupo a, b versus c, d), mientras que CB 2 agonista de tratamiento solo aumentó en comparación con el control (Figura 6A, grupo a, b versus c, D). Curiosamente, la presencia de JWH-015 rescatados microglial fagocitosis de Cy3-A β 1-42 siguiente CD40L tratamiento (Figure. 6A, grupo g, h, frente e, f). En un experimento paralelo, que además puso de manifiesto que la estimulación por 2 CB JWH-015 dio lugar a una significativa atenuación de CD40L mediada por alteraciones de la fagocitosis microglial de A β 1-42, como lo demuestra el aumento de la densidad de banda ratio de A β a β-actina utilizando Occidental Immunoblotting (Figure. 6B y 6C].

Discusión

Los resultados del presente estudio sugieren que los cannabinoides, es decir, 2 agonista CB JWH-015, reducir IFN-γ inducida sobre regulación de la expresión CD40 en las células de ratón microglial por interferir con la JAK/STAT1 vía. Habida cuenta de que este hallazgo es consistente con los inmunosupresores efectos de los cannabinoides se informó anteriormente [48], la importancia de nuestro presente conclusiones deben considerarse en el contexto de la función de microglial CD40.

Expresión aberrante de las células CD40 por microglial, en relación con la liberación de TNF-α, está directamente correlacionado con patógenos hechos ocurridos en el SNC de los pacientes con EM [49 - 51] y en la EAE ratón modelo de la EM [52]. En AD, activado microglial células son considerados uno de los principales contribuyentes a las respuestas inflamatorias locales se pone de manifiesto en neuritic placas. Además, la CD40-CD40L díada se potenció, como puede observarse en el aumento del número de CD40-positivo microglial células, así como una mayor expresión de CD40L astrocitos en AD [53, 54]. Nuestro trabajo anterior ha demostrado una correlación entre un aumento de los niveles de péptido β y el aumento de la expresión CD40 en las células microglial derivados de la Tg2576 ratón modelo de la EA [28]. También informó de que un péptido β puede crear sinergia con el IFN-γ vía de señalización para inducir microglial expresión CD40 y posterior neurotoxicidad [28].

Una revisión de las bases moleculares de la expresión CD40 en macrófagos / células microglial ilumina la función esencial de los JAK/STAT1 vía [55]. En este estudio, mostramos que el CB 2 agonista JWH015 inhibe IFN-γ-CD40 expresión microglial inducida por oponerse JAK/STAT1 vía. Un mecanismo posible de JWH015 la inhibición de la vía JAK/STAT1 es proporcionado por un informe reciente que muestra que el tratamiento con cannabinoides novela, PRS-211092, disminuyó significativamente Concanavalina A inducida por la lesión del hígado en ratones que fue acompañado por una inducción de la expresión de genes de los principios de Supresores de la señalización de citoquinas (SOCS-1 y 3). Las proteínas SOCS actuar como reguladores negativos de la vía JAK/STAT1 ya sea de carácter vinculante y por la inhibición de la tirosina quinasas JAK o por la inhibición de STAT1 factores vinculantes a los dominios citoplásmica de los receptores [56].

Hemos informado anteriormente de que los mecanismos que antagonizar microglial expresión CD40 o CD40 señalización microglial también podrían bloquear la producción de mediadores proinflamatorias [27]. En este estudio, hemos demostrado también que CB 2 agonista JWH-015 inhibe de manera similar microglial CD40 ligadura de la producción de citoquinas proinflamatorias. Este hallazgo es consistente con estudios que muestran que CB 2 agonistas microglial inhibir la producción de mediadores proinflamatorias [22]. Estos datos, lo que sugiere que el CB 2 agonista JWH-015 promueve la función fagocitaria microglial, son de gran interés dado que los mecanismos de limpieza de la conducción cerebral de un β principios subyacentes de muchas estrategias terapéuticas para AD.

Lista de abreviaturas

A β: Amyloid β-péptido

CD40: receptor CD40

CD40L: CD40 ligando

SNC: sistema nervioso central

VIH: virus de la inmunodeficiencia humana

IFN-γ: interferón-gamma

JAK: Janus quinasa

MHC II: complejo principal de histocompatibilidad II

STAT1: transductor de señales y activador de la transcripción 1

TNF-α: factor de necrosis tumoral-alfa

Conflicto de intereses

El autor (s) declaran que no tienen interés de completar.

Contribuciones de los autores

JE llevado a cabo el análisis de citometría de flujo, RT-PCR, TNF-a/NO análisis, el análisis experimental y la interpretación de datos, y preparó el manuscrito. HACER realizó el BC 2 pequeños ensayos de interferencia de ARN y ayudado en la preparación del manuscrito. TM realizó el análisis de inmunohistoquímica CB 2. HH y POR realizado microglial A β ensayos de fagocitosis. NS llevado a cabo por Western blots JAK/STAT1 vía de señalización análisis. Los conocimientos tradicionales, FF, JT y RDS concebido el diseño del estudio, con la ayuda en la preparación del manuscrito, y siempre y análisis crítico del manuscrito.

Agradecimientos

Este trabajo recibió el apoyo de la Asociación de Alzheimer (JT), The Johnnie B. Byrd Sr Alzheimer's Center & Research Institute (RDS y JT), y en parte por la Fundación Nacional de Ciencias de China (JT/BY/30228018).