Plant Methods, 2005; 1: 14-14 (más artículos en esta revista)

Un procedimiento para la localización y caracterización electrofisiológicos de los canales iónicos heterologously expresado en una planta de contexto

BioMed Central
E Hosy (ehosy@cea.fr) [1], G Duby (duby@fysa.ucl.ac.be) [1], AA Véry (very@ensam.inra.fr) [1], A Costa (acosta @ Ucsd.edu) [1], H Sentenac (sentenac@ensam.inra.fr) [1], JB Thibaud (thibaud@ensam.inra.fr) [1]
[1] Biochimie Moléculaires et Physiologie des Plantes, UMR 5004, Agro-M/CNRS/INRA/UM2, F-34060 Montpellier Cedex 1, Francia
[2] actual dirección: Laboratoire de Biophysique Moléculaire et Cellulaire, UMR 5090, CEA-DRDC-BMC, 17 rue des Martyrs, F-38054 Grenoble Cedex 9, Francia
[3] actual dirección: Unidad de Biochimie Physiologique, Institut des Sciences de la Vie, Université Catholique de Louvain, Place Croix du Sud, 5-15, 1348 Louvain-la-Neuve, Bélgica
[4] Present address: Division of Biology, Cell and Developmental Biology Section, and Center for Molecular Genetics, University of California San Diego, CA 92093-0116 La Jolla, USA

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Resumen
Antecedentes

En silico análisis basados en la secuencia similitudes con los canales de los animales han identificado un gran número de genes de plantas probable que codifican los canales iónicos. Los intentos realizados para caracterizar tales putativo planta de los canales en el plano funcional tienen la mayoría de las veces se basó en los análisis electrofisiológicos clásica en sistemas de expresión, tales como los ovocitos de Xenopus o células de mamífero. En varios casos, estos sistemas de expresión han fracasado hasta ahora a proporcionar datos funcionales y uno puede especular que la utilización de una planta de sistema de expresión en lugar de un animal que se podría prestar un servicio más eficiente camino hacia la caracterización funcional de la planta de los canales, y un contexto más realista Para investigar la regulación de los canales de la planta.

Resultados

Con el objetivo de desarrollar una planta de sistema de expresión presta fácilmente a los análisis electrofisiológicos, optimizar las condiciones experimentales para la preparación y transformación de tabaco y de la ingeniería mesófilo protoplasts expresión plásmidos, que se diseñaron para permitir la localización subcelular y caracterización funcional de los canales iónicos en la larga presencia de sus Putativo (posiblemente sobre-expresado) reglamentarios asociados. Dos canales de K + hacia el interior de la familia son funcionalmente Shaker expresadas en este sistema: no sólo cumple la KAT1 recalcitrantes, sino también la AKT1 canal, que sigue siendo eléctricamente silencioso cuando se expresa en ovocitos de Xenopus o en células de mamíferos.

Conclusión

El nivel de las corrientes endógeno en el control protoplasts parece compatible con el uso de los procedimientos descritos experimental para la caracterización de la planta de los canales iónicos, por ejemplo, mediante el estudio de su localización subcelular, propiedades funcionales, las relaciones estructura-función, la interacción y la regulación socios, muy probablemente en Contexto más realista que el animal utilizado clásicamente sistemas.

Antecedentes

Ion canal de la actividad es esencial para las células vivas de las plantas y los animales. Música Clásica (o "adelante") electrofisiología consiste en la medición de conductancia de la membrana celular y en descifrar este complejo parámetro a la identificación de los sistemas de transporte de iones y, posteriormente, para obtener la mayor información posible sobre sus propiedades funcionales, la farmacología, la regulación y la integración En funciones celulares. A finales de los años 70's a principios de los 80, la invención de la técnica de patch-clamp permite que se realizó hasta el molecular "único canal". Casi al mismo tiempo, vino otro avance: la clonación de genes que codifican bombas y canales de iones permitió el inicio de lo que se puede llamar de "invertir" la electrofisiología, i e.., Tomando una carretera que conduce de la ex-situ de la caracterización Un determinado sistema de transporte de iones a su función en la célula o el organismo. Desde principios de la caracterización de un receptor de la acetilcolina y de un canal de Na + peces eléctricos [1, 2], esta ruta ha sido tomada cada vez más en tanto que el conocimiento de los genomas disponibles.

En las plantas, los canales iónicos son reconocidos a desempeñan funciones cruciales en el transporte de iones de nutrientes y el control de potencial de membrana, y de ser actores o los objetivos finales de las vías de transducción de señal [3]. En planta, electrofisiológicos análisis han revelado una gran variedad de canales de iones , Que difieren en su selectividad iónica (aniones o cationes canales, canales ción selectiva, ya sea permeable al K + o Ca 2 +, poco selectivo canales, etc), o en su mecanismo de activación (voltaje, estirado-activado, o ligando - Gated canales). Hasta la fecha sin embargo, la mediación de estructuras moleculares muchas corrientes iónicas descritos in vivo aún no se han identificado. Sólo unos pocos canales de la planta, la mayoría de ellos pertenecientes a la familia Shaker [4], se han caracterizado a nivel molecular y la correlación con las funciones fisiológicas. Poco se sabe a nivel molecular acerca de la no-ción selectiva de los canales, los canales de Ca 2 +, tramo canales activados o anión canales.

Un conveniente y realista sistema heterólogo de expresión es un requisito previo para el éxito de "invertir" electrofisiología investigaciones. Un sistema ideal debería consistir en celdas privadas de la actividad de transporte de iones endógena ( "eléctricamente en silencio") y de más permisivo en cuanto a la expresión de genes de los extranjeros. Los sistemas más utilizados, los ovocitos de Xenopus [5] o líneas de células, como COS, Sf9 Sf9 o células HEK [6 - 10] no cumplen este requisito fundamental, pero en general ofrecen compromisos aceptables. Planta electrophysiologists, no obstante, han experimentado que las estrategias dependen de expresión heteróloga en contextos de los animales son a menudo poco eficiente para la caracterización de la planta de los canales iónicos. Por ejemplo, esto ha sido cierto en el caso de algunos Shaker-al igual que los canales de K + [11], los canales de cationes de los nucleótidos cíclicos putativo gated canal (CNGC), la familia [12], receptores de glutamato [13, 14] y los canales de aniones (CLCs) [ 15]. Tales dificultades pueden deberse a problemas de traducibilidad ARN y proteínas de orientación, o de las diferencias de después de la traducción o en la modificación de los procesos de control de la interacción de proteínas asociadas, entre las plantas nativas contexto, el animal heteróloga. Sorprendentemente, en algunos casos, después de varios fracasos para caracterizar un determinado canal planta de los animales en diferentes sistemas de expresión, el uso de otro sistema de los animales puede abrir el camino a los análisis funcionales. Este ha sido el caso de la Arabidopsis canal de K + Shaker AKT1, que es eléctricamente silencioso cuando se expresa en ovocitos de Xenopus [11], pero da lugar a las corrientes hacia el interior hyperpolarisation activado cuando se expresa en células de insectos [16]. Sin embargo, la búsqueda de la adecuada sistema seguirá siendo bastante empírica hasta las razones por las cuales un determinado canal se expresa en un estado funcional o no en un determinado sistema se descubren animales.

Bei Luan y abrió el camino hacia un "green" sistema de expresión heteróloga, cuando se dieron cuenta de que el tabaco mesófilo protoplasts carezcan de las corrientes de K + hacia el interior y demostró que el canal Shaker KAT1 podría heterologoulsy expresadas y posteriormente caracterizado en él [17]. El protocolo de transformación estable por Agrobacterium infiltración de discos de hoja y la posterior regeneración de una planta [18], sin embargo, una pérdida de tiempo. Otro inconveniente de este método es que la ubicuidad de expresión de algunos transgenes pueden, en algunos casos, evitar la regeneración de una planta transformada que se requiere para obtener mesófilo protoplasts, o inducir inoportuno transcriptome modificaciones. Por otro lado, la expresión transitoria de la proteína GFP-fusiones en células de tabaco se ha utilizado desde alrededor de 8 años para estudiar la orientación de las proteínas [19, 20] que sugiere el posible uso de estas células para electrofisiológicos electrogenic caracterización de los sistemas de transporte [21] . En base a esto, se desarrolló un nuevo procedimiento transitorio basándose en la transformación de tabaco mesófilo protoplasts. Vectores (disponibles bajo petición) fueron de ingeniería que permiten la selección de la transformada protoplasts (reportero GFP), de expresión de GFP-proteínas etiquetadas o carecen de etiquetas (para la localización subcelular y análisis electrofisiológicos, respectivamente), y co-expresión de dos proteínas con el fin de Investigar sus interacciones funcionales. A PEG-transformación mediada protocolo fue adaptado y la posible utilidad del método fue evaluada por la expresión funcional de la AKT1 canal, un resultado que no se había obtenido en ovocitos de Xenopus o células COS como se mencionó anteriormente. El conjunto de los datos indica que el método puede proporcionar una nueva forma de análisis funcionales de la planta de los canales iónicos.

Resultados
Genéticos construcciones para la expresión transitoria en el tabaco protoplasts

Expresión plásmidos fueron diseñados para mostrar las siguientes características principales: (i) el etiquetado de las células transformadas, (ii) la obtención de altos niveles de expresión de la proteína estudiada (s), (iii) que permite tanto la localización subcelular y caracterización funcional de la proteína (s) De interés.

Selección de los marcadores de resistencia a antibióticos, como la tinción GUS o no son adecuados para la selección de protoplasts de parches destinados a la sujeción de la pieza. Por lo tanto, optaron por una selección basada en las buenas prácticas agrarias. De hecho, las buenas prácticas agrarias es fácilmente expresado en células vegetales con pocos o ningún inconvenientes, cuando no fusionados a otra proteína. La fusión de las buenas prácticas agrarias a proteínas de membrana, canales de K + en nuestro caso, puede ser una solución para la detección de ambos y el estudio de las células transformadas etiquetados, polipéptidos [21]. No puede excluirse, sin embargo, que, en algunos casos, la etiqueta-fusionados polipéptidos pantalla función alterada y / o con problemas de multímeros de reunión o de la interacción con la regulación de los factores [22]. Por lo tanto, los vectores se construyeron para que sea expresión de la proteína de interés fusionados a las buenas prácticas agrarias para la localización subcelular, o co-expresión de esta proteína y de las buenas prácticas agrarias para la caracterización funcional, como se detalla a continuación.

Cuatro plásmidos que contienen uno o dos casetes de expresión se construyeron. Cada expresión de cassette fue destacado EN50PMA con el promotor y el terminador nopaline sintasa de Agrobacterium tumefaciens (T observado en la Figura 1], una combinación que antes se utilizaban para la expresión transitoria de la mitocondria de orientación en buenas prácticas agrarias protoplasts tabaco [23]. El EN50PMA promotor consiste en la pma4 (membrana plasmática membrana plasmática H + - ATPasa ATPasa isoforma # 4 gen) en la que el promotor CaMV 35S potenciador se inserta en la posición -50 aguas arriba del inicio de la transcripción de genes pma4. Este promotor se ha demostrado que el rendimiento de los niveles de expresión por lo menos diez veces más elevado que el clásico promotor CaMV 35S [24].

En el primer plásmido, llamado pLoc, un corto polylinker (hecha de tres sitios de restricción) se insertó entre EN50PMA y la secuencia de codificación de las buenas prácticas agrarias (Figura 1A]. Este plásmido, que expresan el GFP-etiquetados polipéptido con el polipéptido cDNA (libre de codón STOP) clonado en el polylinker en el marco de las buenas prácticas agrarias, se utiliza para la localización subcelular.

El segundo plásmido, llamado pFunct Etiqueta + contiene dos casetes de expresión, por separado expresando el polipéptido cDNA clonados y las buenas prácticas agrarias (Figura 1B]. Se usa como expresión funcional del polipéptido fluo y el etiquetado de transformarse protoplasts.

El tercer plásmido, llamado pFunct, figura un solo cassette de expresión que permite la expresión de polipéptido clonados sin GFP-etiqueta (Figura 1C]. Se puede usar en experimentos de co-transformación. En esos experimentos, este vector, una recombinación cDNA, se puede co-expresada ya sea con la pLoc o pFunct + Etiqueta plásmidos, otro cDNA recombinación, lo que permite el estudio de las interacciones entre los dos polipéptidos codificados, en cuanto a su localización subcelular o propiedades funcionales, Respectivamente.

En los experimentos de control, vacía pLoc vector se utilizó para expresar GFP sola. Esto se hizo para electrofisiológicos protoplasts análisis de control que hayan realizado el proceso de transformación, sin expresión de cDNA extranjero (excepto GFP).

Preparación y transformación de tabaco protoplasts

Protoplasts hoja de tabaco se han obtenido y posteriormente transformado para GFP-habilitado desde fines de localización de una década [25, 26]. Hemos experimentado, sin embargo, que la obtención de protoplasts presta fácilmente a patch-clamp experimentos requiere la digestión, purificación y transformación de medidas para optimizar como se describe a continuación (véase el protocolo propuesto en el "Método"). La duración de la digestión que parecía ser fundamental para el éxito de patch-clamp experimentos. A pesar del hecho de que una alta eficiencia de transformación se obtuvo el 15 de horas del día digerido células, de 19 horas de la digestión tiempo dio lugar a un aumento de gigaseal tasa de éxito, probablemente debido a una mejora de la accesibilidad del parche pipeta a la membrana celular. Una solución de alta densidad (MLO6) se añadió al final de incubación medio (véase "Métodos") con el fin de aumentar la densidad de la solución y de separar, a 7 minutos después de la centrifugación a 110 g, la viva y protoplasts flotante de la sedimented Muertos. Realización de la digestión y la transformación en la oscuridad y luego de mantenimiento de la protoplasts en la oscuridad a 19 ° C hasta el pinzamiento de parches, también facilitó gigaseals probablemente debido a la oscuridad y temperatura moderada frenado nueva síntesis de la pared celular.

La transformación se realizó con una técnica de PEG-mediada. Varios polímeros de PEG se probaron diferentes concentraciones y en el mejor rendimiento de la transformación (con un promedio de 20%) se obtuvo con un 25% (w / v) de concentración de PEG-6000. La transformación técnica de la electroporación También se puso a prueba, pero una gran cantidad de células no resistir el impulso eléctrico y el rendimiento de la transformación fue de alrededor del 5%. Además, esta técnica requiere una gran cantidad de ADN (30 μ g) y células (1,5 10 6 células / transformación) [27] que, en nuestras condiciones, la técnica requiere PEG 5 μ g de ADN y alrededor de 5,10 5 células sólo por la transformación [28] . Un paso fundamental para la transformación es la pureza del ADN. En nuestros experimentos, Nucleobond ® AX afinidad columnas (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) fueron utilizados para la purificación de DNA y una drástica disminución en la eficiencia de transformación de edad se observó cuando los preparativos de ADN (> 1 mes) o AND preparado por lisis celular Y las precipitaciones se utilizaron etanol.

Tabaco mesófilo protoplasts muestran débiles hacia el interior de K + y Cl - corrientes

El nativo de la conductancia de la membrana plasmática del tabaco mesófilo protoplasts se investigó para probar si pueden ser utilizados como anfitriones para expresar K + (o catiónico) o / y Cl - (aniónicos) canales. La técnica de patch-clamp se aplicó a los no transformados y de las buenas prácticas agrarias de etiquetado (transformado con el vector vacío pLoc) protoplasts. En ambos casos, se obtuvieron grabaciones similares que se reveló que la conductancia de la membrana nativa fue modificada ni por el tratamiento ni por PEG expresión de las buenas prácticas agrarias, y que el tratamiento de PEG no alteró la membrana amenability parche para el pinzamiento (no se muestra).

Dos patrones de nativos dentro de la rectificación de las corrientes de K + se han observado durante hyperpolarising legumbres. Alrededor de un tercio de las células muestran prácticamente ningún curso de perfeccionamiento activo (Figura 2C]. Las otras células mostradas baja intensidad (9 ± 3 pA. Μ m -2 (n = 9) a -200 mV) corrientes, que activan instantáneamente a hyperpolarisation debajo de -140 mV (Figura 2B], y que son insensibles a C +, un Clásica bloqueador de canales de K + (no se muestra).

Large (45 ± 13 pA. Μ m -2 (n = 10) a +100 mV) hacia el exterior de la rectificación de las corrientes de K + se activan por depolarising legumbres (Figura 2C]. Estas corrientes se debe probablemente a la actividad de los canales Shaker, ya que muestran la cinética de activación y de potasio extracelular que recuerda la dependencia de las descritas para SKOR y GORK Arabidopsis hacia el exterior-la rectificación de los canales Shaker [29 - 31].

Un promedio actual relación de tensión de control protoplasts (transformado con el vector vacío pLoc) se muestra en la Figura 2D. La baja intensidad de la instantánea hacia dentro K + actual parece compatible con el uso del tabaco mesófilo protoplasto como expresión heteróloga sistema de los canales de K + hacia el interior.

Nativo aniónico corrientes en estos mesófilo protoplasts se registraron cuando Cl - iones fueron el único difusible aniones en ambos baño y soluciones pipeta (Cs + bloque que se va a añadir a las corrientes de K +). Se registraron las corrientes hacia el exterior (30 ± 9,6 pA. Μ m -2 (n = 10) a +100 mV, la Figura 2E-F], lo que indica que la despolarización de los canales activados anión dominado la conductancia aniónico.

En resumen, debido a su moderado conductances nativo, el tabaco mesófilo protoplasts parece utilizable para la caracterización de heterologously expresó K + (catión) - o Cl - (aniones) selectivo canales, preferentemente los canales de mediación de las corrientes hacia el interior y hacia el exterior, posiblemente, esas corrientes de mediación, siempre Que la alta expresión heteróloga nivel que se puede lograr.

Funcional expresión y localización de los dos canales de K + hacia el interior

En la siguiente, el uso de tabaco protoplasts para la expresión transitoria de los canales funcionales se evaluó con dos modelos dentro de la rectificación de los canales Shaker clonado de Arabidopsis: AKT1 [32] y KAT1 [33].

AKT1 tuvo que ser sometido a las pruebas que sólo se ha expresado en Sf9 funcionalmente Sf9 (insectos) [16] las células y células de levadura [32, 34], pero ni en ovocitos de Xenopus ni en células COS para que este canal ha sido mucho menos estudiado que KAT1. En cambio, la actividad de KAT1 ha sido registrado con éxito en un gran conjunto de sistemas de expresión heteróloga: ovocitos de Xenopus [35, 36], células COS [37], Sf9 Sf9 células [38], células de levadura [34, 39], el tabaco Mesófilo protoplasts [17] y Vicia faba guardia de células protoplasts [21]. Esta planta cumple sorprendentemente Shaker subunidad, por lo tanto, ha sido la más ampliamente descrito, convirtiéndose en el modelo de planta Shaker canal de la estructura-función de análisis. Fue aquí utilizado como control positivo de la usabilidad de la transitoriamente transformado tabaco protoplasts.

Cuando parche de piezas de sujeción, la GFP-etiquetados protoplasts transformado con el pFunct + Tag-AKT1 vector mostradas exógenos voltaje K + corrientes, la activación por debajo de un ca. -40 MV de tensión umbral, que muestran el tiempo de activación dependientes de la rectificación y de perfeccionamiento activo (Figura 3A] e invertir en un potencial de membrana de equilibrio cerca de la posibilidad de que los iones de K + (no se muestra). Estas corrientes son similares a los observados en las células Sf9 Sf9 infectadas por AKT1-recombinante bacculoviruses [16] o de las nativas registradas en la raíz de los pelos atkc1-1 knock-out plantas, que puedan expresar homomeric AKT1 canales [40]. Un promedio (media ± SE, n = 16), en estado actual / de tensión para el control y la curva de AKT1-expresando protoplasts se muestra (Figura 3B] para poner de relieve el notable cambio en las corrientes hacia el interior, las corrientes hacia el exterior están sin cambios.

Electrofisiológicos grabaciones en pFunct +-Tag-KAT1 transformado protoplasts reveló grandes exógenos hacia dentro-la rectificación de las corrientes de K +, que exhiben típicas características de las corrientes KAT1 [41], como una función del tiempo de activación por debajo de un umbral de voltaje negativo (aquí, ca. -- 120 mV; Figs. 3c y 3d].

Los valores de los parámetros de voltaje-gating (umbral de activación potencial y, cuando sea posible, los llamados "Boltzmann" parámetros, i e.. Medio y potencial de activación aparente gating cargo) previa, ya sea nativo o en contextos en heteróloga de AKT1 KAT1 canales y se comparan con los obtenidos por estos canales en el presente trabajo (Tabla 1]. Parece que los valores de estos parámetros dependen de la expresión, pero que el contexto actual en que se obtiene del tabaco están más cerca de los obtenidos en el contexto nativo (Arabidopsis) que los obtenidos en animales o en células de levadura.

Protoplastos transformado con el vector pLoc-AKT1 muestras de una distribución de fluorescencia verde (Figura 3E, a la izquierda fotografía) que sugiere la orientación de la AKT1:: GFP proteína de fusión a la membrana plasmática celular. Esto fue evaluado por la fluorescencia verde co-localización (Figura 3E, a la derecha la fotografía) con la fluorescencia de color rojo de la membrana de marcador FM4-64 (10 min de incubación, la figura 3E, media fotografía). Este patrón contrasta con el mostrado por protoplasts expresando GFP por sí solo (no se muestra aquí, pero véase la figura 4A, más abajo). La localización de la membrana GFP fluorescencia en pLoc-AKT1 transformado protoplasts fue bastante estable.

La situación es muy diferente con pLoc-KAT1 transformado protoplasts: la KAT1 inscritos GFP fluorescencia se encuentra esencialmente localizado a 1 a 4 μ m de diámetro estructuras (Figura 3F, a la izquierda). Estas estructuras se supone que endocítica vesículas [42]. Con el fin de comprobar esta hipótesis, el FM4-64 tinte se incubó durante 40 min con el protoplasts (Figura 3F, en el medio), una vez que permite endocítica vesículas que aparecen a vesicular internalización de la membrana plasmática que se etiqueten [43]. Muchos KAT1:: GFP estructuras que llevan la etiqueta roja que también está representada la FM4-64 de fluorescencia (Figura 3F, a la derecha), lo que sugiere que KAT1:: GFP ha sufrido endocitosis. GFP similares intracelulares que llevan la etiqueta estructuras ya observada en KAT1:: GFP-expresando Vicia guardia de las células y también se sugirió que pertenecen a la vía endocítica [21].

Co-expresión de dos polipéptidos

La posibilidad de obtener co-expresión de dos diferentes ubicados en dos polipéptidos diferentes plásmidos, que se informó anteriormente [28], también estuvo presente la prueba utilizando procedimientos experimentales. PEG-mediada transformación de tabaco mesófilo protoplasts se trató con una mezcla de vacío, ya sea pLoc vector y pFunct-AKT1 o pFunct-KAT1. Después de este paso, las células de haber integrado el segundo vector fueron avistados por fluorescencia verde. Cuando parche de piezas de sujeción, todas las buenas prácticas agrarias de etiquetado protoplasts (de 25 AKT1 co-protoplasts o transformado, de 23 KAT1 co-transformado queridos) que se muestran las corrientes exógenas (de AKT1-y KAT1 de tipo, respectivamente). Esto pone de manifiesto que ambos vectores presentes en la transformación de la mezcla se expresa en el 100% de los transformado protoplasts.

Protoplasts transformado puede ser utilizada durante al menos 24 horas en patch-clamp experimentos

Para determinar las mejores condiciones para patch-clamp grabaciones en el tabaco transformado protoplasts, la cinética de aparición de fluorescencia verde (donde se informa de la expresión de las proteínas exógenas) y la cinética de la reconstrucción de la pared (que limita el acceso a la membrana de la pipeta) fueron estudiados .

En una primera etapa, se verificó que cada una de las células GFP expresión de que la acogida fue parche-sujetos al suelo mostró una exógenos conductancia debido a la actividad de los canales estudiados (KAT1 y AKT1 canales que se utilizan como controles para la expresión funcional de polipéptidos heteróloga). Fluorescencia verde (Figura 4A, a la izquierda) fue detectable tan pronto como 4 horas después de la etapa de transformación y el número de células que llevan la etiqueta GFP posteriormente llegó a una meseta de 55 horas después de la operación de transformación (Figura 4B]. Una vez que este estado de equilibrio se alcanzó, el rendimiento de la transformación podría ser estimada: es un promedio de 20%. Curiosamente, en lo que respecta a esta última proporción de células GFP-etiquetados, el transcurso del tiempo-la proporción de células que muestran fluorescencia verde era bastante reproducible y mal depende de si un canal es co-expresa o en la que se utiliza para la construcción de esta co - Expresión (Figura 4B]. Operacionalmente, uno de etiquetado de células GFP entre quince es un umbral aceptable para tratar de parches de sujeción en un plato de cultivo celular. Por lo tanto, con una transformación de eficiencia del 20%, el número de células GFP-etiquetados en un plato es lo suficientemente amplio para tratar patch-clamp grabaciones de unas 12 horas después de que el proceso de transformación (Figura 4B].

En un segundo grupo de experimentos, la detección de la regeneración de la pared celular transformado protoplasts se vigila (Figura 4A, centro y derecha), utilizando el tinte calcofluor (fluorescentes blanqueadores 28; Sigma). Con excepción de la CA. 15% de las mis-digeridos protoplasts, que se tiñeron inmediatamente después de la transformación, el primer neo-sintetizado piezas de la pared celular puede ser detectado por 20 horas después de la transformación (Figura 4C]. Expresión de las buenas prácticas agrarias y las buenas prácticas agrarias o de ambos canales no se limita a cambiar la cinética de la síntesis de la pared (Figura 4C]. Sesenta y un 70% de la protoplasts ha sintetizado (piezas de) un nuevo muro por 40-45 horas después de la transformación (Figura 4C], a fin de que posteriormente se hizo difícil obtener un buen acceso a la membrana con el parche pipeta.

Estas observaciones significan que el patch-clamp grabaciones pueden comenzar 12 horas después de la transformación (expresión de tiempo) y las corrientes se pueden medir hasta 40 horas después de la transformación. La ventana de tiempo para protoplasts usabilidad es, por lo tanto, al menos 24 horas de ancho (Figura 4D]. Curiosamente, en la actual intensidad de -200 mV (aquí canal de expresión relacionadas con el nivel) no aumentará notablemente con el tiempo después de la transformación (Figura 4E] y el nivel de expresión de los canales de la membrana es lo suficientemente elevado como para registrar las corrientes macroscópicas tan pronto como se GFP fluorescencia Detectable.

En un intento de ampliar el plazo para la revisión de sujeción-, la síntesis de la pared celular recientemente fue expuesto a las utilizadas anteriormente para digerir solución o una solución enriquecida en enzimas. Después de 1, 2 o 5 horas de la digestión, sin embargo, la calidad de la membrana celular obtenidos no permitió gigaseals. Podría suponerse que protoplasts aislados generados paredes con una composición diferente de la de hoja mesófilo de las paredes celulares, y que la enzima cóctel no podía permitir un nuevo digestión.

Discusión

In vitro de la cultura del tabaco y el tabaco es sencillo mesófilo células se pueden obtener en grandes cantidades a fin de que la eficiencia de la preparación de protoplastos no es limitante. El tamaño de estas células está bien adaptado a la técnica de patch-clamp, y observó que la síntesis de una nueva pared celular, lo que hace difícil el pinzamiento parche puede ser sensiblemente más lento si las células se mantienen en la oscuridad durante la digestión y después de la transformación. Nos muestran que, con el procedimiento experimental que hemos desarrollado, un alto rendimiento de transformación con éxito puede ser obtenido de rutina y que el plazo para patch-clamp investigaciones es por lo menos 20 horas de ancho (Figs. 1 y 4].

Endógeno la actividad de mediación de los canales de K + hacia el interior corrientes es baja en el PEG-tabaco transformado protoplasts mesófilo (Figura 2]. Esta propiedad es favorable para la caracterización funcional de los canales de K + hacia el interior expresadas en este sistema. De hecho, nuestros datos demuestran la expresión funcional en estos protoplasts de AKT1, un canal hasta ahora refractario a la expresión clásica en sistemas de expresión heteróloga. AKT1 la que se había caracterizado sólo en el insecto-baculovirus de células del sistema [16], y en células de levadura [34]. Hasta el momento, poco se ha informado sobre las propiedades funcionales de este canal, uno de la primera planta de los canales de K + Shaker a ser clonados [32], fundamentalmente porque el pinzamiento parche levadura es difícil y funcional de los estudios en células Sf9 Sf9 anteriores requieren de purificación Baculoviruses de recombinante, un tiempo de paso, lo que hace este sistema poco adecuado para la investigación de las relaciones estructura-función utilizando un número de canales de mutantes. En el presente informe se abre el camino hacia este tipo de investigaciones, ya que los vectores de expresión descritos aquí permiten la clonación con fines de cDNA y fácil transformación.

Un gran número de genes de plantas comparten similitudes con la secuencia de los genes de animales sabe que codifican subunidades de canales de iones han sido identificados, por ejemplo, en silico análisis del genoma de la Arabidopsis http://aramemnon.botanik.uni-koeln.de/. La mayoría de ellos son aún uncharacterised en el plano funcional a pesar de los intentos de hacerlo en sistemas de expresión clásica animal. Este es el caso, por ejemplo, de la planta "de receptores de glutamato" genes [14] y "CNGCs" (putativo de nucleótidos cíclicos gated ción canales [12]], dos familias de genes que se hubiera propuesto para codificar los canales de cationes [4 ], Y de la "CLC" los genes, las probabilidades de codificar los canales de aniones [15]. En este contexto, se puede especular con que los canales iónicos de otros tipos de K + rectificadores de corriente hacia el interior puede ser caracterizado en el tabaco mesófilo protoplasts. Canales de mediación de las corrientes de K + hacia el exterior (Figura 2C] o canales de mediación de Ca 2 + (Ba 2 +) hacia adentro y de las corrientes activadas por luz azul [44] o [45] cAMP se han descrito en Arabidopsis mesófilo células y, por tanto, probable que se forma nativa Expresó también en el tabaco mesófilo células. Incluso para esos canales, los altos niveles de expresión heteróloga transformado en protoplasts podría abrir el camino para su análisis funcionales.

Un inconveniente en el uso de los sistemas heterólogos es el hecho de que la expresión contexto puede afectar las características funcionales de canales, que ofrece una visión distorsionada de la función del canal y regulación. Por ejemplo, los valores de la tensión-gating parámetros de activación de AKT1 y KAT1 claramente dependerá de la expresión contexto (Tabla 1]. En cuanto a KAT1, en comparación con el valor obtenido para el nativo hyperpolarisation activados los canales de K + de Arabidopsis guardia de células [46], el valor es más cercano al obtenido en el presente trabajo (Tabla 1]. Suponiendo que KAT1 canales de la base de hacer la guardia de células nativas Arabidopsis corrientes, esto sugiere que el tabaco mesófilo protoplasts representan un contexto más realista expresión de los canales iónicos de plantas que clásicamente utilizado células animales.

Entre los mecanismos de regulación que podrían ser estudiadas a través del tabaco mesófilo protoplasto sistema son los eventos que permitan canalizar la orientación a la membrana celular y / o modificaciones posteriores de traducción, tales como (de) la fosforilación. En cuanto a la ex mecanismos, vale la pena señalar que la misma está representada KAT1 localización subcelular perfil cuando se expresa en el consumo de tabaco mesófilo protoplasts como cuando se expresa en células Vicia faba de guardia [21].

En efecto, si bien la localización periférica de (al menos algunos) KAT1 canales es evaluada por el exógenos corrientes registrados en protoplasts transformado por KAT1 portadora de pFunct + Etiqueta vectores (Figura 3B-D], KAT1:: GFP es apenas visible en la membrana (Figura 3F] sino que aparece, tanto en el consumo de tabaco y mesófilo protoplasts Vicia faba guardia de las células, como principalmente localizados en estructuras punctata (Figura 3F], supone que pertenecen a la vía endocitosis (Figura 3F, a la derecha una fotografía, y [21]]. Curiosamente en AKT1:: GFP-expresando protoplasts, la fluorescencia no se observó en esas estructuras puntiforme, pero como apareció uniformemente distribuido en la membrana plasmática (Figura 3E]. Esto indica que KAT1 y AKT1 canales no sean objeto de la misma regulación que afecte a su orientación y / o retirada de la membrana celular. Por lo tanto, se puede proponer que la regulación de los canales de K + Shaker actividad específica de control de volumen de negocios de las diferentes subunidades Shaker en la membrana celular.

Un reto actual en el canal de iones de investigación es la identificación de proteínas reguladoras y de la caracterización de la interacción de las redes que pertenecen. Los avances en este campo se podría lograr por la co-transformación de los candidatos participantes en los sistemas heterólogos [47]. La posibilidad de obtener co-expresión de dos diferentes ubicados en dos polipéptidos diferentes plásmidos es, por tanto, una característica fundamental de un sistema de expresión heteróloga. Este punto ya ha sido verificada por inmunoticción la nitrocelulosa-transferido proteoma de protoplasts expresando dos diferentes péptidos [28]. En este sentido, se ha evaluado in situ dentro de las células vivas y llegamos a la conclusión de que el PEG-transformación mediada protoplasts mesófilo de tabaco con una mezcla de dos vectores se puede utilizar para estudiar la interacción de dos polipéptidos. Estas podrían ser diferentes subunidades canal, o de un canal y una subunidad de la regulación de socio, o cualquier par de interactuar putativo polipéptidos. En función de los vectores utilizados, se podría estudiar el efecto de la interacción celular en la localización o en la función de los polipéptidos de interés.

Conclusión

En conclusión, nos muestran que la expresión transitoria en el tabaco mesófilo protoplasts pueden proporcionar una forma de caracterizar planta de los canales iónicos, por ejemplo, mediante el estudio de su localización subcelular, propiedades funcionales, las relaciones estructura-función, la interacción y la regulación socios, muy probablemente en un contexto más realista Que los sistemas de los animales utilizados clásicamente. Evidentemente, el sistema se ha adaptado bien a la caracterización de los canales de K + hacia el interior, y es de esperar que pueda ser usada también para la caracterización de los otros tipos de canales de iones, como el mal ción selectiva de canales [48, 49] o de los canales de aniones [15 ]. Además, la adaptación del procedimiento a protoplasts preparado a partir de Arabidopsis tejidos, el uso de plantas de diferentes genotipos, podría proporcionar incluso las rutas más directas a este tipo de análisis.

Métodos
Material vegetal

Nicotiana tabacum (cv. SR1) plantas cultivadas in vitro en una cámara de crecimiento a 22 ° C con un 16-h light/8-h oscuro con un régimen de densidad de flujo de fotones de 250 μ mol.m -2. S -1 en 0,8 % Agar soporte de MS / 2 sales [50], el 1% de sacarosa y 5 mM MES-KOH pH 5.5).

Material genético

Los vectores utilizados para la expresión transitoria en el tabaco mesófilo protoplasts figura ya sea una expresión de cassette o dos. Cada cassette está equipada con la mayor planta de promotor de la membrana plasmática H +-ATPasa isoforma 4 genes (pma4) de Nicotiana plumbaginifolia y el terminador nopaline sintasa de Agrobacterium tumefasciens (véase el texto y la Figura 1A-C]. El modificados pTZ-19U (Stratagene, LaJolla, CA, EE.UU.) plásmido utilizado para la expresión funcional del canal Shaker cDNA en protoplasts tabaco contiene dos casetes, que permite a los co-expresar la proteína marcadora que emite fluorescencia de las buenas prácticas agrarias y la secuencia de cDNA Shaker (pFunct + Etiqueta, Figura 1B]. XhoI y restricción SmaI sitios se utilizaban para clonar AKT1 y KAT1 cDNA en la expresión de cassette. El plásmido utilizado para el canal de orientación que figuran sólo un cassette de expresión que permite la expresión de un canal fusionados en su parte C-terminal de la proteína GFP (pLoc, Figura 1A]. BglII restricción KpnI y sitio o sitios BamHI se utilizaron para clonar aguas arriba de la GFP, la AKT1 cDNA privados de su codón STOP por PCR. Información complementaria sobre los vectores y sobre la clonación procedimiento utilizado en este estudio está disponible como archivo adicional 1.

Hojas de tabaco mesófilo protoplasto aislamiento

Un protocolo descrito anteriormente [27], fue adaptado para la obtención del mesófilo de hoja purificada protoplasts.

Cinco centímetros de largo de las hojas de tabaco 3 - a 4 semanas de edad, las plantas cultivadas in vitro fueron cosechadas en condiciones estériles y sus inferior de la cara se abrased con papel de lija n ° 1200. Las hojas fueron colocadas en cajas de Petri que contiene 10 ml de la digestión esterilizados EF mediano (0,125% macerozyme R-10 (Yakult Farmacéutica; Onozuka, Japón), el 0,2% celulasa R-10 (Yakult Farmacéutica; Onozuka, Japón), 5 mM CaCl 2, 0,5 M de sacarosa, 0,1% BSA, 2,5 MES-HCl, pH 5.2) durante 19 h en la oscuridad a 25 ° C. Después de la digestión, sin digerir trozos de hojas se eliminaron y 4 ml de medio flotante MLO6 se añadieron (15 mM CaCl 2, 600 mM de sacarosa, 7,5 mM MES-KOH pH 6,0). La suspensión de protoplastos se filtra a través de un 100 μ m filtro de nylon y se centrifuga a 110 g durante 7 min en un rotor de los movimientos de balanceo. El protoplasts localizadas en la banda de flotación se recolectaron y se diluye con 4 volúmenes de autoclave lavado W5 mediano (154 mM NaCl, 125 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 5 mM de glucosa y 1,5 mM MES-KOH, pH 5.6). Las células fueron entonces pildoradas (110 g durante 7 min en un rotor de los movimientos de balanceo) y lavada con 40 ml y, a continuación, en 20 ml de "Manitol / Mg" solución (15 mM MgCl 2, 400 mM manitol, 5 mM MES-KOH pH 5.6). Protoplastos fueron finalmente resuspendido en Manitol / Mg solución a una concentración de 10 6 células / ml.

Transformación de protoplastos

En un tubo Eppendorf, 150 μ l de la protoplasts concentrado y 150 μ l de solución de PEG (25% w / v PEG 6000, 0,45 M manitol, 0,1 M de Ca (NO 3) 2, pH 9,0) se han añadido a 5 μ g de ADN plasmídico De la construcción que deben someterse a prueba y incubados a temperatura ambiente durante 30 min. La muestra fue diluida con 8 ml de K3M suplementado con 0,45 M de glucosa [25] y los movimientos de balanceo pildoradas en un rotor (7 min a 110 g). El protoplasts finalmente se suspendió en 3 ml de K3M e incubadas durante 12 a 38 horas a 19 ° C en la oscuridad antes del análisis.

Localización subcelular de canales fundido a la detección de buenas prácticas agrarias y transformado protoplasts para mediciones electrofisiológicas

Localización subcelular de los canales fundido a la de las buenas prácticas agrarias y FM4-64 en el etiquetado del tabaco protoplasts se realizó con un microscopio confocal Zeiss (Zeiss LSM510 AX70, Göttingen, Alemania). Para la captura de la GFP fluorescencia, una longitud de onda de excitación de 488 nm y una detección de una entre 500 y 530 nm se utilizaron. Para la captura de la FM4-64 fluorescencia, en KAT1:: GFP expresando protoplasts, una longitud de onda de excitación de 515 nm y una detección de arriba se utilizaron 640 nm, con una intensidad de láser en el 60%. Las diferentes configuraciones para FM4-64 fueron utilizados en la detección de AKT1:: GFP expresando protoplasts: excitación a 543 nm, la detección por encima de 585 nm y láser intensidad en el 15% (mucho más bajo del cloroplasto autofluorescence se catched con esos ajustes, ver Figura 3E]. Las imágenes fueron tratados con LSM510 software (Zeiss). Membrana plasmática FM4-64 etiquetado fue realizado por el protoplasts incubando en hielo 10 minutos en el medio de cultivo suplementado con 50 μ M FM4-64. Por vesícula endocítica etiquetado, en la incubación de 50 μ M FM4-64 se prolongó hasta 40 min y se lleva a cabo a temperatura ambiente. Con el fin de medir las corrientes de sólo transformó protoplasts, un microscopio epifluorescent (IX 70, Olmpus, Hamburgo, Alemania), que permite la detección de las buenas prácticas agrarias se combinó con un patch-clamp set-up. Transformado células fueron seleccionadas para patch-clamp análisis de las buenas prácticas agrarias en función de su expresión. GFP se detectó señal entre 489 nm y 508 nm utilizando un filtro de emisión (pistón-GFP, Olympus) en el momento de excitación a una longitud de onda de 488 nm emitida por un monocromador (Optoscan C80x, Cairn Research Ltd, UK). Las imágenes fueron adquiridas con una cámara CCD (CoolSNAP HQ, la Ciencia Roper, EE.UU.) y tratados con MetaFluor software (Universal Imaging Corporation, EE.UU.).

Wall detección

Para medir la cinética de la síntesis de la pared, el calcofluor blanco marquer (fluorescentes blanqueadores 28, Sigma) fue solubilizado en 0,25 M Tris solución en el 0,005% wv -1. El calcofluor se entusiasma con un 360-370 nm wavelenght y detectado por encima de 420 nm con un alto filtro de paso de emisión (U-MNU2, Olympus) en un microscopio epifluorescent (BX61, Olympus).

Electrofisiológicos de grabación

Patch clamp pipetas fueron tirados (P97, Sutter Instruments, Novato, CA) de borosilicato capilares (Kimax-51, Kimble). Sellos con resistencias superiores a los 1 G Ω se utilizaron para los análisis electrofisiológicos. Plenario de células grabaciones fueron obtenidas utilizando un amplificador Axopatch 200A (Axon Instruments, Foster City, CA). PCLAMP 8 software (Axon Instruments) se utiliza para la estimulación de impulsos de tensión, en línea de adquisición de datos y análisis de datos. El pulso de tensión protocolos se han incluido leyendas en la figura.

Electrofisiológicos soluciones

Para las grabaciones actuales de potasio, solución de la pipeta que equilibrates con el citosol de mesófilo protoplasts figura 1 mM CaCl 2, 5 mM EGTA, 2 mM de MgCl 2, 100 mM K-glutamato, 2 mM MgATP, 10 mM Hepes-NaOH, pH 7,5, Osmolaridad ajustado a 520 mOsM con D-manitol. Mesófilo protoplasts se extracellulary perfundidos con una solución que contenga 10 mM CaCl 2, 2 mM de MgCl 2, 50 mM K-glutamato, 10 mM MES-HCl, pH 5,5, osmolaridad ajustado a 500 mOsM con D-manitol. En estas condiciones, pipeta resistencias fueron alrededor de 12 M Ω.

La pipeta de solución de cloruro de utilizarse para grabaciones actual se compone de 30 mM CsCl, 2 mM de MgCl 2, 1 mM CaCl 2 (Ca 2 + libre cerca de 50 nM), 5 mM EGTA, 2 mM MgATP, 10 mM Hepes / Tris (pH 7,2 ) Y 410 mM de D-manitol. El baño de solución que figuran 50 mM CsCl, 15 mM CaCl 2, 2 mM de MgCl 2, 10 mM Mes / Tris (pH 5,7) y 345 mM de D-manitol. En estas condiciones, había resistencias pipetas parche de alrededor de 15 M Ω.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

EH realizado el patch-clamp grabaciones, a excepción de las relativas a las corrientes de aniones endógeno, participó en la transformación de protoplastos y redactó el manuscrito. GD diseñado y obtenido los vectores de expresión utilizados en este trabajo, logró la transformación de protoplastos, realizó la microscopía confocal y redactó el manuscrito. AAV realizado el patch-clamp grabaciones de la endógena anión corrientes y experimentos de detección de la pared celular. AC participó en la transformación de protoplastos y obtainig de vectores de expresión. HS participado en el diseño y la coordinación del estudio y ayudó a redactar el manuscrito. JBT participado en el diseño y la coordinación del estudio y gestionó la escritura del manuscrito.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Información complementaria sobre los vectores y sobre la clonación procedimiento utilizado en este estudio
Este archivo de la página 2 (formato pdf) 2 muestra las cifras (y leyendas) (i) muestra una representación esquemática de los vectores utilizados en este trabajo y (ii) el procedimiento de la clonación con fines de ADNc en estos vectores.
Agradecimientos

Eric Hosy fue concedida por Région Languedoc-Roussillon y el INRA. Geoffrey Duby fue apoyada por la Unión Europea (becas Marie Curie). Région Languedoc-Roussillon financiado la adquisición de la puesta en marcha experimental de patch-clamp junto y las buenas prácticas agrarias de imágenes ( "arrêté distributif n ° 00 61 67"). Este trabajo fue apoyado en parte por el "Programa inter-organismes (CEA-CNRS-INRA-INSERM) de Toxicologie de energía nuclear". KAT1 intentos preliminares de expresión funcional se realizaron con un KAT1:: GFP construir proporcionado amablemente por el Dr Ulrike Homann, la Universidad Técnica de Darmstadt, Alemania. Agradecemos profundamente a la Dra Françoise Bex (Laboratorio de Microbiología de la Universidad de Bruselas, Bélgica) por su ayuda en microscopía confocal. Estamos en deuda con la Dra Isabel A. Lefèvre útil para los debates y los comentarios sobre el manuscrito.