Listeria monocytogenes Invade el epitelial Salidas en Cell Sitios de Extrusión

Listeria monocytogenes, un Gram-positivas, de patógenos bacterianos intracelulares facultativas, es una fuente de enfermedades transmitidas por los alimentos humanos [1, 2]. Se descubrió por primera vez como agente causal de septicemia en conejos [3]. En el ser humano que provoca una serie de manifestaciones clínicas asintomáticas de transporte intestinal y gastroenteritis y difundido a la enfermedad invasiva. Septicemia, meningoencefalitis, y la infección del feto en mujeres embarazadas son las más graves manifestaciones de la listeriosis [1]. El tracto gastrointestinal es el principal sitio de entrada de patógenos Listeria especies, y alimentos contaminados es la principal fuente de la infección y la epidemia en ambos casos esporádicos [4, 5]. Después de la invasión del intestino delgado, L. monocytogenes Y se pueden propagar a infectar el hígado, bazo, sistema nervioso central, y, en mujeres embarazadas, la placenta [1].

Invasión de la no por ataque de las células fagocíticas L. monocytogenes Está mediada por al menos dos proteínas de la superficie bacteriana, Internalin A (InlA) y Internalin B (InlB) [6 - 8]. InlA une un dominio extracelular de E-cadherina, una transmembrana celular-a-molécula de adhesión de células [9 - 13]. InlA es necesario para la invasión de las células epiteliales y es suficiente para que se vuelva a la invasión cuando se expresa en la no patógeno y no las especies invasoras, Listeria innocua [6, 9, 11]. InlB une el dominio extracelular de c-Met, un receptor tirosina quinasa [14]. Aunque no guarda relación InlB por secuencia o estructura a la endógeno c-Met ligando, el factor de crecimiento de hepatocitos, que actúa como exógenos c-Met agonista y media L. monocytogenes Invasión de múltiples tipos de células [8, 14 - 23]. InlB actúa sinérgicamente con InlA cultivadas durante la invasión de las células epiteliales a través de un mecanismo desconocido [8, 17, 24].

La extensión y el mecanismo por el que L. monocytogenes Infracciones de la barrera epitelial intestinal son controvertidos. En ratones, L. monocytogenes Invasión y replicación en el tracto gastrointestinal es independiente de InlA y se limita a los parches de Peyer, lo que sugiere un papel predominante para la M-especializados de las células fagocíticas en la captación de bacterias [13, 25 - 28]. Asimismo, en ratas, translocación intestinal tasas son bajas e independiente de la inlAB locus, sugiriendo un proceso de pasivos que no implique InlA o InlB [29]. Sin embargo, los ratones y las ratas no son huéspedes naturales L. monocytogenes . Además, el ratón y la rata E-cadherina humanos difieren de E-cadherina en un importante de residuos de aminoácidos que hace que las células resistentes a la InlA mediada invasión [13]. En cambio, L. monocytogenes Puede invadir directamente enterocitos en conejillos de indias, que son naturalmente susceptibles a la listeriosis [27, 30]. En ratones transgénicos, enterocitos expresan E-cadherina humanos también son susceptibles a la invasión por L. monocytogenes [27].

¿Cómo L. monocytogenes Obtiene acceso a la E-cadherina en vivo y sigue siendo un importante problema no resuelto, ya que E-cadherina está presente principalmente en las membranas laterales, pero no en la superficie apical, de las células intestinales [31 - 33]. Varias líneas de evidencia sugieren que L. monocytogenes Polarizado invadir las células epiteliales de manera más eficiente desde el lado basolateral [34, 35]. En primer lugar, L. Monocytogenes preferentemente infectar a los bordes laterales de islotes de células epiteliales en cultivo [34, 35]. En segundo lugar, L. monocytogenes Disminuye con la invasión del epitelio monocapa madurez. En tercer lugar, L. monocytogenes Invasión de un confluente del epitelio monocapa se puede aumentar mediante la interrupción de las uniones intercelulares, que exponga a lateral membranas celulares [34]. Se ha propuesto que L. monocytogenes Tener acceso a E-cadherina durante una infección apical a través de la activación de c-Met por InlB [36]. Sin embargo, c-Met es también un basolateral del receptor y no se conoce de estar expuestos o activadas por el factor de crecimiento de hepatocitos la parte apical de los epitelios [37, 38].

Se utilizó Madin-Darby de riñón canino (MDCK) para investigar cómo las células L. monocytogenes Infracciones de la superficie apical de una barrera epitelial. Elegimos esta línea celular MDCK células porque forman un epitelio polarizado con estricto cuando se crece en los cruces permeable filtro apoya [39], y porque las células MDCK son permisivas para L. monocytogenes Invasión [40]. Además, la E-cadherina canina es idéntica a la E-cadherina en la región crítica InlA vinculante, y se activa InlB c-Met de señalización en las células MDCK [14]. Mostramos aquí que apical de una invasión por epitelio MDCK L. monocytogenes Sucede con frecuencia y es críticamente dependiente de la interacción entre InlA y E-cadherina. Microscópico análisis detallado de la adhesión y la entrada revelan que L. monocytogenes Tiene un tropismo por las células de extrusión cruces en los sitios donde E-cadherina es transitoriamente expuestos a la superficie apical. Este modo de entrada sugiere que L. monocytogenes Invasión y translocación del intestino delgado pueden ocurrir en el apical puntas de las vellosidades del intestino, donde enterocitos apoptose y son expulsados en el lumen intestinal por un mecanismo normal de las células de extrusión. Hemos confirmado esta hipótesis en un conejo ileal bucle modelo de la infección [41].

Estamos infectados polarizado MDCK monocapas sobre Transwell filtros de la parte apical o basal para determinar si L. monocytogenes Diferencialmente invadir estos dos dominios de la membrana. Después de 10 min, las monocapas fueron lavadas para eliminar las bacterias no adheridas, y la célula de asociados L. monocytogenes Se permitió que invaden el epitelio durante 1 h. Cualquier resto de las bacterias extracelulares fueron asesinados con gentamicina durante 20 min, y viable intracelular L. monocytogenes Fueron cuantificados. Infección bacteriana en estas condiciones no perturbar la integridad de la monocapa (Figura S1]. Basal invasión de un polarizado MDCK epitelio es 5 veces más eficaz que la invasión apical (Figura 1 A), a pesar de que el filtro de las máscaras de apoyo del 85% de la superficie basal. Hemos probado una serie de multiplicidad de las infecciones (MOIs) de 1 a 150 bacterias por célula y se encontró que el mayor grado de invasión basal es independiente de la dosis infecciosa (p <0,01). Sin embargo, en todos los inóculos probados, hubo un nivel detectable de la invasión apical.

Se analizaron los sitios de apical versus basal invasión por microscopía confocal de inmunofluorescencia. A varios tiempos después de la internalización, monocapas se fijaron y determinada con anticuerpos frente a L. monocytogenes . Las monocapas fueron infectados por el apretado counterstained cruces (anti-ZO-1). Se observó que los sitios de infección basal se distribuyeron en toda la monocapa (Figura 1 B). En contraste, se observó que después de la infección apical, L. monocytogenes Concentrarse en distintos sitios en los múltiples (cinco o más) las células alargadas unirse en una central multicelulares cruce (Figura 1 C-1 F). Por 3 h de la infección, los pequeños focos de reproducción de las bacterias se encuentran dentro de las células en la salida multicelulares sitios (Figura 1 D), y por 5 h, los grandes focos de bacterias se localizan en el original de los sitios de entrada (Figura 1 E). Estas bacterias son viables y replicativa, ya que habían adquirido actina basada en la motilidad intracelular como se indica en la cola asociada de polimerizado actina (Figura 1 D, inserción) [40, 42 - 44]. Prácticamente todos los L. monocytogenes Focos (97% ± 1,1%, media ± DS; 3 h post-infección) se centran en los cruces multicelulares realizados por cinco o más células MDCK. Sin embargo, los cruces son multicelulares sitios especializados de la invasión sólo de la parte apical. En contraste con la infección apical, menos del 1% de las células infectadas, basales se asociaron con una multicelulares unirse a la salida de cinco o más células (Figura 1 B).

Para confirmar que las células con multicelulares cruces son los principales sitios de invasión apical, utilizamos un mutante de L. monocytogenes Acogida que invade las células normalmente, pero no puede separarse a las células adyacentes, ya que carece de la actA gen, que es necesaria para la actina de la célula de base a la propagación de células (actA Δ Δ actA, F Figura 1] [43, 45]. A las 3 h después de la infección, actA Δ Δ actA L. monocytogenes las células infectadas son miembros de la salida multicelulares sitios con una frecuencia de 97% ± 0,8%.

Estamos infectados polarizado MDCK con monocapas de tipo salvaje (Wt) L. Monocytogenes, una supresión inlA-mutante (Δ inlA Δ inlA), o una supresión inlB-mutante (Δ inlB Δ inlB) para determinar que se necesitan para invasins apical invasión. Después de un período de internalización, el monocapas infectadas fueron tratadas con gentamicina y, a continuación, el número de bacterias intracelulares viables se determinó (Figura 2]. Apical invasión requiere InlA, desde inlA Δ Δ inlA L. monocytogenes invasión es casi eliminado (2% del peso, la figura 2 A). La invasión por inlB Δ Δ inlB L. monocytogenes también es reducido (43% de peso, la figura 2 A). Sin embargo, cuando inlB Δ Δ inlB invasión fue analizada por microscopía confocal, el tropismo por multicelulares cruce de los sitios se mantuvo (98% ± 1,4% de los focos, 3 h después de la infección).

Para determinar si los defectos en la invasión se deben a defectos en el archivo adjunto, polarizado MDCK monocapas infectadas durante 10 minutos, no eliminan las bacterias adheridas, y cuantificados apego por microscopía confocal de inmunofluorescencia. La gran mayoría de Wt L. monocytogenes (98% ± 1,5%) atribuyen a MDCK monocapas polarizado directamente encima de la tinción de ZO-1, el lugar de la apretada cruces (Figura 2 C, 2 D), y la adhesión, como la invasión, se concentra en sitios de cruce multicelulares (Figura 2 C , 2 D). La adhesión es totalmente dependiente de InlA, ya que no encontramos ninguna inlA Δ Δ inlA L. monocytogenes asociada con el epitelio utilizando un inóculo equivalente (Figura 2 B). En cambio, inlB Δ Δ inlB L. monocytogenes se adhiere a la polarización MDCK monocapas con la frecuencia (Figura 2 B), y específicamente como a los enlaces (98% ± 1,2%) como Wt. Estos resultados sugieren que es la principal InlA adhesina, que la adhesión se requiere para la entrada, y que contribuye a la internalización InlB pero no archivo adjunto.

Para definir cuantitativamente entre el tropismo L. monocytogenes Multicelulares y de los cruces, primero caracteriza la frecuencia y distribución de los cruces multicelulares en todo el monocapa, y luego a los sitios relacionados con esta bacteriana de archivo adjunto. Cada celda en un epitelio se une a más de una célula a través de una célula a célula cruce. Sin embargo, una fracción de los cruces de células se une a un grupo de células en un solo punto para formar un cruce multicelulares. El número de células que se reúnen para formar un cruce puede ser utilizado para definir un "cruce de tipo". En la figura 3 se representan gráficamente en la frecuencia de cada tipo de cruce en forma de gráfico de barras, tomando nota de que el cruce con el aumento de los tipos son menos multicellularity Común. Para determinar si hay un tipo de cruce preferido L. monocytogenes Adherencia, contamos el número de L. monocytogenes Asociados a cada tipo de cruce, y planearon estos, también, en la Figura 3. Nos encontramos con un número creciente de las bacterias con los cruces colocalize unirse a un número creciente de las células (Figura 3, el coeficiente de correlación de Pearson para Wt L. monocytogenes r = 0,95, p = 0,0001; inlB Δ Δ inlB L. monocytogenes r = 0,85, p = 0,0037). Esta correlación entre el aumento de multicellularity en un cruce y bacterianas adjunto es sorprendente, dado que la frecuencia de los cruces multicelulares disminuye rápidamente. En general, el 74% de L. monocytogenes Multicelulares que se respetaron en los cruces unirse a cinco o más células, que representan sólo el 2% de todas las uniones.

No se encontraron indicios de que L. monocytogenes Inducir estos sitios a través de las alteraciones de la morfología celular o de ocasiones, desde monocapas infectadas y no infectadas tienen las mismas frecuencias de los tipos de ocasiones, y desde L. monocytogenes Están asociados con estos sitios rápidamente, dentro de 5 a 10 min de la infección. Por lo tanto, llegó a la conclusión de que L. monocytogenes Aprovecharse de los cruces preexistentes multicelulares como una página especial en la superficie epitelial, que permite la adhesión y la invasión.

Desde los cruces son estructuras dinámicas, nos pregunta cuándo y dónde multicelulares cruces en una forma MDCK epitelio. Sitios con similar morfología, se mostró a desarrollar en apoptosis cuando son extruido de la monocapa epitelial apical en los medios de comunicación [46, 47]. Nos confirmó que multicelulares cruces forma durante la extrusión de células no infectadas en MDCK monomoleculares y analizaron la cinética de este proceso por el time-lapse video microscopia (Figura 4 A, vídeo S1]. Una célula dirigida por extrusión es inicialmente morfológicamente indistinguibles de las células vecinas (Figura 4 A, 0 h). Una vez que el proceso de extrusión se inicia, se produce rápidamente, en aproximadamente 40 minutos (Figura 4 A, 1 h), dejando una característica roseta-como la disposición de las células vecinas en una central multicelulares cruce. Este patrón de organización celular ocasiones y se mantiene durante varias horas más largo que el caso real de extrusión (Figura 4 A, 6 h). No se detectaron defectos de monocapa en esos lugares, ya que la reorganización de las células adyacentes para mantener la continuidad del epitelio.

Para examinar toda monocapas de células de los sitios de extrusión, extrusión células teñidas con Sytox verde y examinadas por microscopía confocal de inmunofluorescencia. Esta alta afinidad ácido nucleico manchas de tinte, los núcleos de las células muertas o muriendo, pero no pueden cruzar las membranas impermeables de las células vivas. Sytox tinción reveló células en diversas etapas del proceso de extrusión. Antes de que una célula de morir es extruido, la brevedad de los cruces que rodean a la célula basal buzamiento hacia el lado de la monocapa (Figura 4 B-4 D). Cuando una célula es casi extruido de la monocapa, las células que rodean forman un embudo-formado multicelulares cruce por debajo del plano de la Sytox-positivas núcleo celular (Figura 4 C). Incluso después de la pérdida de células Sytox-positiva, tinción de los núcleos epiteliales monocapa puedan localizar sitios de la extrusión, ya que hay siempre un núcleo conspicuamente faltan en los cruces multicelulares unirse a cinco o más células. Además, el embudo-como la reordenación de los cruces persiste después de la extrusión ha terminado (Figura 4 D).

Para determinar si L. monocytogenes Sitios de adherencia son equivalentes a los sitios de célula de extrusión, que volverá a estudiarse la adhesión bacteriana, los sitios con respecto a 1) la presencia de células de extrusión (Sytox), 2) que faltan núcleos (toto-3), y 3) el embudo-como reordenación de la Apretados nudos (anti-ZO-1). Figura 5 muestra que un L. monocytogenes Se adhiere a los cruces en los lugares donde las células están en el proceso de extrusión (véase también el vídeo S2]. Estos sitios representan un pequeño subconjunto de los cruces multicelulares ya que el proceso de extrusión se produce rápidamente. Todos L. monocytogenes Adhesión de sitios web en los cruces multicelulares unirse a cinco o más células tienen la característica ausencia de un núcleo (Figura 5 B) y embudo-como reordenación de los cruces apretado (Figura 5 A). Por lo tanto, estos también son sitios en los que las células de extrusión recientemente se han producido.

La hipótesis de que las bases moleculares de la adhesión apical podría ser expuestos E-cadherina en la célula de extrusión sitios, desde inlA Δ Δ inlA L. monocytogenes no se ajustan a la superficie apical de polarizado MDCK monocapas, mientras Wt y inlB Δ Δ inlB L. monocytogenes se adhieren principalmente a los multicelulares Cruces. No permeabilized polarizado MDCK monocapas fueron incubadas en la parte apical con un anticuerpo monoclonal que detecta el dominio extracelular de E-cadherina [48, 49]. Apical E-cadherina es fácilmente detectado en la multicelulares enlaces relacionados con células en el proceso de extrusión (Figura 6 A), así como en sitios de cruce multicelulares que un extruido de células ya se ha perdido (Figura 6 B). Adheridos L. monocytogenes Se encuentran las regiones más apical de E-cadherina en la célula de unión de la exposición (Figura 6 C). Además, incubando polarizado MDCK monocapas baja en calcio medio, que altera la uniones intercelulares, los aumentos L. Monocytogenes adhesión al epitelio específicamente en las regiones donde intercelular E-cadherina está expuesta (figura S2].

Para confirmar que el receptor de L. monocytogenes Multicelulares en los cruces es E-cadherina, y no una novela InlA receptor, bloqueado apical E-cadherina por pretreating vivir MDCK monocapas con el anti-E-cadherina de anticuerpos, o la cantidad equivalente de anticuerpos de la glicoproteína gp135 apical como control [50 ]. Con el fin de garantizar que la igualdad de las cantidades de anti-E-cadherina y de los anticuerpos anti-gp135 se utilizaron, se determinó la concentración relativa de anticuerpos mediante un análisis cuantitativo dot blot de las soluciones de anticuerpos (Figura 6 D). El anti-E-cadherina anticuerpo, que sólo manchas multicelulares cruces, bloques de adhesión en un 70%. En contraste, los anticuerpos anti-gp135, que adorna toda la superficie apical, no tiene ningún efecto en L. Monocytogenes adhesión (Figura 6 D y 6 E). Estos resultados sugieren que existe una ventana temporal de ocasiones durante la reorganización de células de extrusión que transitoriamente expone E-cadherina para la adhesión de L. monocytogenes .

En el intestino delgado, enterocitos se generan dentro de las criptas y migran hasta los lados laterales de las vellosidades [51]. El ápice de la vellosidad se define como la zona de extrusión, donde enterocitos someterse a la muerte celular programada y son expulsados en el lumen intestinal [51, 52]. Por lo tanto, en contraste a una MDCK epitelio, en donde se produce la extrusión de células en todo el monocapa, el volumen de negocios de células in vivo es temporal y espacial regulado.

Nuestro cultivo de células resultados predijo que L. Monocytogenes' invasión de epitelio intestinal se producirá preferentemente en las puntas de las vellosidades. Estamos infectados ileal de conejo con bucles L. monocytogenes Y examinó los sitios de archivo adjunto en vivo y la entrada a prueba esta hipótesis. Este sistema experimental se utilizó porque los conejos son huéspedes naturales L. Monocytogenes y conejos han InlA permisivo-E-cadherina [3, 13]. Figura 7 muestra tridimensional confocal reconstrucciones de las vellosidades de un conejo infectado con el lazo ileal 4 × 10 ⁷ UFC / ml de Wt-GFP L. monocytogenes Durante 4 h. Mediante imágenes de 40 × múltiples campos, se calcula que al menos el 50% de las vellosidades ha L. monocytogenes Asociados a la consejos de vellosidades (Figura 7 B y Video S3]. Aunque L. monocytogenes Fueron incrustados en la mucosa por encima y entre las vellosidades, no hemos encontrado L. monocytogenes Asociados con el epitelio a lo largo de los lados laterales de las vellosidades, o con células de las criptas intestinales (Figuras 7 y A S2A]. El mismo resultado se observó en los bucles ileal infectados con Wt L. monocytogenes Que no expresan GFP visualiza con anti - L. monocytogenes Anticuerpos (datos no publicados). No hemos encontrado L. monocytogenes Asociados con parches de Peyer (Figura S3], aunque hubo L. monocytogenes Asociados con las puntas de las vellosidades del rodean Peyer parches (Figura S3 C).

Se determinó que la L. monocytogenes Invasión se produce preferentemente en las puntas de las vellosidades intestinales, ya que las bacterias intracelulares sólo pueden ser encontrados en las vellosidades consejos después de las 4 h de la infección (Figura 7 A). Algunos intracelular L. monocytogenes Actina ya habían acumulado en sus superficies, lo que indica que son viables y que se había fugado de la internalización vacuola (Figura 7 C). Como un control adicional para la viabilidad de las bacterias interiorizado, un conejo infectado ileal bucle con una cepa de L. monocytogenes Llevar un transgén con monomérico proteína fluorescente roja fundida a ActA (ActA-RFP) [53]. Dado que la proteína ActA se expresa sólo después de las bacterias entrar en el citoplasma de células de acogida [54, 55], estas bacterias expresar ActA-RFP éxito sólo después de la invasión [53]. ActA-RFP-expresando L. monocytogenes Sólo se encuentran en las puntas de las vellosidades (Figura S3 D). InlA Δ Δ inlA L. monocytogenes en un inóculo de 4 × 10 ⁸ UFC / ml, no invaden el epitelio (Figura E S3 y S4 vídeo].

Estamos manchados los tejidos intestinales infectadas con anti-ZO-1 para determinar si los anticuerpos in vivo la adhesión y la invasión de L. monocytogenes También se produce en los cruces multicelulares asociados a la extrusión. Bacterias adheridas constantemente con colocalized ocasiones presentan manchas, y se encuentra comúnmente en los cruces multicelulares que se producen en la zona de extrusión de los consejos de vellosidades (Figura 7 E). Similar a nuestros resultados en cultivos de células MDCK, tinción de los núcleos en los enterocitos de las vellosidades reveló que L. monocytogenes Fácilmente asociados con los cruces en torno a la extrusión células (Figura 7 D). Estos resultados indican que los sitios de la apoptosis de células de extrusión de un epitelio son especialmente permisivo para L. monocytogenes Invasión in vivo, así como en el cultivo de tejidos.

Muchos microbios patógenos preferentemente interactuar con los constituyentes de la membrana basolateral de células epiteliales de la invasión [33, 56]. Por ejemplo, el parásito Toxoplasma gondii De alguna manera viola el apretado uniones entre las células a migrar [57]. Los rotavirus obligar integrinas, una clase de moléculas de adhesión y de señalización encontrado únicamente en la basolateral de los enterocitos partes [58]. La bacteria Shigella flexneri , Como Listeria monocytogenes, preferentemente invade la membrana basolateral de las células epiteliales polarizadas [34, 59]. Paradójicamente, el aspecto basolateral de las células epiteliales no es fácilmente accesible para la mayoría de los microbios. Además de la mecánica y los mecanismos de defensas inmunológicas de la lumenal compartimiento, la brevedad de los cruces de epitelios restringir el acceso a la membrana basolateral de dominio. Algunos agentes patógenos han desarrollado mecanismos para socavar, modificar, o eludir las uniones epiteliales apretado. Por ejemplo, Vibrio cholerae Segrega una proteasa que puede degradar el apretado nudo de la proteína occludin [60]. Helicobacter pylori Y enteropatógenas E. coli Interrumpir los enlaces desde adentro hacia afuera efector mediante la inyección de proteínas en las células epiteliales [61, 62]. Yersinia burlar el estricto enterocitos por los cruces de acceso a los receptores de la integrina β1-expuestos en la superficie apical de las células-M [63 - 67]. En este estudio se preguntó cómo L. monocytogenes Obtiene acceso a los receptores de su basolaterales E-cadherina y c-Met en un epitelio intacto desde este patógeno bacteriano no se conoce activamente a perturbar el estricto uniones epiteliales.

Se encontró que el L. monocytogenes Es capaz de invadir polarizada epitelio de la parte apical esencialmente sólo en puntos vulnerables formadas por extrusión de las células senescentes. Como el primer paso de la invasión, L. monocytogenes Atenerse casi exclusivamente multicelulares más de los cruces, y la adhesión depende de la expresión de InlA, lo que sugiere que su receptor está disponible en estos cruces. De hecho, cuando premeditados, la parte apical de monocapas con un anti-E-cadherina bloqueo de anticuerpos, la adherencia se redujo significativamente, demostrando que L. monocytogenes Que el acceso E-cadherina en ocasiones presentan sitios.

¿Cómo funciona L. monocytogenes E-cadherina encuentro a través de los estrechos enlaces? Se ha planteado la hipótesis de que L. monocytogenes Podría violar las cruces a pesar de la activación de c-Met por InlB, ya que c-Met modula señalización de la salida de montaje [38, 68]. Sin embargo, hemos encontrado que la perturbación activa de los cruces no es necesario, puesto archivo adjunto se produce rápidamente, ya que un mutante inlB-no fue afectada por la adhesión y, desde E-cadherina es transitoriamente expuestos apically multicelulares que normalmente ocurre en el cruce de los sitios. Multicelulares cruces representan sólo el 2% de todos los enlaces en una monocapa, pero son los sitios de adhesión el 74% de todos los L. monocytogenes . Curiosamente, la invasión es aún más específico para estos centros de adherencia, ya que los focos de intracelular L. monocytogenes Están asociados con los cruces multicelulares 97% de las veces. Estos datos nos obliga a determinar la naturaleza de la multicelulares susceptibles a los cruces L. monocytogenes Invasión, como la identificación de sitios de extrusión de células apoptóticas. Durante este proceso, las células senescentes son puestos en libertad mientras que el apically adyacentes avanzar rápidamente en las células para sellar el defecto epitelial [46, 47], la formación de un cruce multicelulares que persiste por muchas horas.

Bioquímicas estudios han demostrado que tanto apretado nudo de proteínas y adherens cruce se degradan las proteínas en las células apoptóticas, lo que puede facilitar su desprendimiento de las células vecinas [69 - 72]. Remodelación ocasiones crea un transitorio incumplimiento de la barrera epitelial, como se ha demostrado que las células de extrusión produce defectos localizados en transepithelial resistencia eléctrica [73]. También documentó la remodelación de la salida y la desorganización, ya que la brevedad de los cruces en los sitios de extrusión se reorganizó basales en un embudo-como la forma y desde el E-cadherina está expuesta en esos lugares. Estos reajustes estructurales hacen que la multicelulares cruces susceptibles a la invasión por parte apical L. monocytogenes . Los sitios de L. monocytogenes Apego a la polarización monomoleculares son espacialmente estrechamente asociados con los cruces apretado, como marcado por el andamio de proteínas ZO-1. Anteriores trabajos utilizando congelación fractura y microscopía electrónica ha demostrado que el apretado nudo de extrusión líneas que rodean las células están en proceso de ser remodeladas [74]. Existen varias posibilidades para explicar la disponibilidad de E-cadherina a L. monocytogenes En estos lugares. Por ejemplo, el apretado nudo de la remodelación capítulo podría resultar en una pérdida local en función de valla, y la localización de E-cadherina por encima de los estrechos enlaces. Alternativamente, el proceso de formación y el apretado nudo de remodelación puede implicar apretado nudo de las interacciones entre las proteínas, los andamios proteína ZO-1, y la E-cadherina complejo que puede resultar en la exposición E-cadherina en la superficie apical [75].

El tropismo de L. monocytogenes Extrusión de los sitios no es exclusivo de las células cultivadas, pero también ocurre in vivo. Dentro de la producción de células de las criptas intestinales es equilibrada por derramamiento de células a partir de la extrusión en la zona de vellosidades consejos [51]. Por lo tanto, predijo este sitio anatómico sería el objetivo de la L. monocytogenes Invasión in vivo. Estudios a explorar el sitio inicial de Listeria entrada en ratones y ratas han sugerido que L. monocytogenes No puede invadir los enterocitos, sino que cruza a través de la M-epitelio de las células de los parches de Peyer [26, 28, 76]. Aunque esto puede representar un importante sitio de entrada a muy alta inóculos, es poco probable que el principal modo de invasión del epitelio porque ratones y ratas no son naturalmente susceptibles a la listeriosis debido a diferencias en la E-cadherina en la región InlA vinculante [13] . En contraste, un estudio de principios de la microscopía electrónica de tejido intestinal de cobayas inoculados oralmente encontrado intracelular L. monocytogenes Dentro de los enterocitos cerca de las puntas de las vellosidades intestinales [30]. En otro estudio utilizando cobayas y ratones transgénicos que expresan humanos de E-cadherina en enterocitos, de los focos L. monocytogenes Se encontraron dentro de las vellosidades intestinales, cerca de la apical consejos [27]. De acuerdo con estas observaciones, se determinó que L. monocytogenes Adherirse a invadir y exclusivamente a los consejos de vellosidades y no encontró bacterias invaden las partes laterales de las vellosidades, las criptas intestinales, o los parches de Peyer. Examinar los consejos de vellosidades más de cerca, se encuentra que la invasión de bacterias multicelulares estaban asociados con los cruces y las cruces que rodean las células protuberancias en la zona de extrusión. Nuestros resultados sugieren que la E-cadherina, y posiblemente otras proteínas basolaterales, convertido expuestos en la zona de extrusión. Creemos que la célula de extrusión sitios va a ser utilizada por otros agentes patógenos como mecanismo general para acceder a los receptores basolateral.

Célula de extrusión de los consejos de vellosidades es un rápido y continuo proceso [51]. Por lo tanto, además de proporcionar un medio para que L. monocytogenes Para evadir el sistema inmune [77], basada en la actina de la célula a célula de propagación en la punta de vellosidades puede ser beneficiosa para mantener un nicho intracelular replicativa de cara a una renovación de sistema dinámicamente. La capacidad de L. monocytogenes Para prosperar y propagación intracelularmente es claramente responsable de su capacidad de causar graves enfermedades invasoras y para difundir a los órganos distantes. Sin embargo, L. monocytogenes Causas de enfermedad invasiva en individuos inmunocompetentes sólo en raras ocasiones, después de la ingestión de muy alto número de bacterias [1], y en su lugar se derrama asymptomatically por al menos un 1% de individuos sanos [78, 79]. Los mecanismos de transporte de Listeria asintomáticos sólo han llegado recientemente objeto de la investigación. Un estudio en un modelo murino de infección encontró que L. monocytogenes Extracelular sobrevivir en el lumen de la vesícula [80]. Desde la colonización de este sitio anatómico no se recurra a ninguno de los conocidos L. monocytogenes Adaptaciones para la supervivencia intracelular, que especular que un mecanismo alternativo de transporte asintomática puede implicar la invasión local de los consejos de vellosidades, la replicación intracelular, y células, a la propagación de células de vellosidades equilibrado por la renovación celular.

MDCK G / II células fueron amablemente proporcionados por el Dr James W. Nelson (Universidad de Stanford, Stanford, California) y se mantuvieron a 37 ° C en 5% de CO ₂ en atmósfera Gibco MEDM (Invitrogen, San Diego, California, Estados Unidos) Complementado con 10% suero bovino fetal Gibco (Invitrogen). A la cultura polarizada MDCK monomoleculares, y trypsinized células fueron sembradas en 12 mm de policarbonato inserciones en el cultivo de tejidos (Transwell filtros; Costar, Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos) a una densidad de 10 ⁶ células / cm ^2, y complementada con frescos basal diario de los medios de comunicación 4 D. Verificación de apretado nudo de la función de barrera intacta monocapas se realizó tal como se describe en [81] y se muestra en la Figura S1. Por apical versus basal de comparación L. monocytogenes La infección, las células fueron cultivadas en un 3 - μ m de poro Transwell filtros. Para todos los demás experimentos, las células fueron cultivadas en 0,4-μ m de poro Transwell filtros. Para interrumpir calcio dependientes de uniones intercelulares, inmediatamente antes de la infección, MDCK monocapas fueron incubadas en los medios de comunicación de calcio baja (5 μ M Ca ^{2 +,} [81]] durante 30 minutos y, a continuación, cambió de nuevo a MEDM (1,8 mM Ca ^{2 +).}

10403S, un Wt L. monocytogenes Cepa, y las cepas mutantes isogénicas DP-L4405 (Δ inlA Δ inlA), el DP-L4406 (Δ inlB Δ inlB), y DP-L3078 (actA Δ Δ actA) fueron amablemente proporcionados por el Dr Daniel A. Portnoy (Universidad de California, Berkeley, California, Estados Unidos Estados) y se han descrito anteriormente [45, 82]. GFP-expresando 10403S cepa DH-L1039 (Wt-GFP) fue proporcionado amablemente por el Dr Darren E. Higgins (Universidad de Harvard, Boston, Massachusetts, Estados Unidos) y ha sido descrita en [83, 84]. JAT-395, 10403S que expresa la proteína fluorescente roja monomérico fundido a ActA (ActA-RFP) Recientemente se ha descrito [53]. L. monocytogenes Se cultiva en Difco BHI-agar o en caldo BHI-(BD Biosciences, San Jose, California). Culturas de la ActA-RFP y Wt-GFP se complementaron con cloranfenicol. Por la infección, L. monocytogenes Cepas fueron inoculadas con un bucle de una nueva placa en 3 ml de caldo BHI y crecido 13-15 horas a temperatura ambiente sin agitación.

Células bacterianas fueron cosechadas en 10000 g durante 1 min y resuspendido al 0,5 OD ₆₀₀ (7 × 10 ⁸ UFC / ml) en la temperatura ambiente MEDM. Inmediatamente antes de la infección, las células MDCK se transfirieron a 37 ° C MEDM. L. monocytogenes Se añadieron a las células MDCK polarizada en una MOI de 140:1 bacterias por célula en 500 μ l de MEDM y se permitió que se adhieran durante 10 minutos a 37 ° C en 5% CO ₂ atmósfera. Monocapas de células fueron lavadas por pipeting con 3 cambios de nuevo a 37 ° C para eliminar MEDM no adhirieron L. monocytogenes . Este punto se consideró 0:00 tiempo para todos los análisis. Invasión de las células fue autorizado a proseguir durante 1 h en MEDM a 37 ° C en el 5% atmósfera de CO ₂ (1:00). El medio fue reemplazado con MEDM que contiene 50 μ g / ml y gentamicina incubadas durante 20 min a matar extracelular L. monocytogenes (1:20). Por último, el medio fue reemplazado con MEDM con 10 μ g / ml de gentamicina y se incuba a 37 ° C en 5% CO ₂ a la atmósfera hasta las 5:00. En su momento los puntos, por encima de la secuencia de la infección fue interrumpido a fin de ensayo para L. monocytogenes Adherencia, la invasión, o la replicación intracelular como se describe a continuación.

Para ensayo de adhesión celular, a las 0:00, monocapas, ya sea fijo y se analizaron por microscopía o dispersas y chapada de unidades formadoras de colonias (CFUs). La adhesión por análisis microscópico se determinó a partir de, al menos, tres campos de 40 × (~ 2000 MDCK células / campo) de cada uno de al menos tres monocapas infectadas por la cepa probada. Para la adhesión de UFC cuenta, la totalidad de Transwell-monocapa extirpados de la armazón fue dispersada por 15 s vórtice de la agitación en la de 500 μ l de buffer fosfato salino (PBS) 1% saponina. Diluciones apropiadas de la suspensión se chapada en BHI-agar. PBS a corto plazo de incubación y la presencia de saponina estaban decididos a no afectar L. monocytogenes Viabilidad (datos no publicados). Para ensayo para la invasión celular, a las 1:20, monocapas se lavaron por pipeting con tres cambios de agua a 37 ° C MEDM para eliminar la gentamicina. Intracelular L. monocytogenes Se recuperaron en un 15 s de agitación en el vórtice de 500 μ l de PBS 1% saponina. Diluciones apropiadas de la suspensión se chapada en BHI-agar para UFC determinación. Para el análisis de la replicación intracelular, en varios tiempos, monocapas de células fueron fijadas y analizada por microscopía de inmunofluorescencia. Para determinar el porcentaje de invasión de sitios web en los cruces multicelulares, monocapas se fijaron a las 3:00. Al menos 100 observó azar L. monocytogenes Focos (o actA Δ Δ actA las células infectadas) fueron analizados por cada uno de al menos tres monocapas infectadas por cada cepa probada. Los experimentos se realizaron al menos tres veces. Prisma de software (GraphPad, San Diego, California, Estados Unidos) se utilizó para la construcción de gráficos y análisis estadístico de los datos. La prueba t de Student se utilizó para comparar los datos de dos grupos de la muestra. ANOVA con Bonferroni después de los ensayos se utilizaron para el análisis de tres o más grupos de la muestra. Producto-momento de Pearson coeficiente de correlación se utilizó para el análisis de las distribuciones.

E-cadherina fue bloqueada con ratón mAb anti-E-cadherina de anticuerpos (rr1) [48, 49], fue bloqueado y gp135 ratón con mAb anti-gp135 (clon 3F2/DB) [50]. Ambos anticuerpos fueron amablemente proporcionados por el Dr James W. Nelson. Para normalizar la concentración de estos anticuerpos, una dilución de cada serie se borró de succión al vacío en nitrocelulosa 96-utilizando un aparato así biodot (Bio-Rad, Hercules, California, Estados Unidos). La mancha se deja secar completamente, y luego incubadas durante 1 h a temperatura ambiente en el bloqueo de la solución que contiene una mezcla de 1:1 Li-Cor amortiguador de bloqueo (Li-Cor Biosciences, Lincoln, Nebraska) y PBS. La mancha se incubó en cabra anti-ratón Alexafluor660 anticuerpos (Molecular Probes, Eugene, Oregon, Estados Unidos) diluido 1:5000 en solución de bloqueo durante 1 h. La mancha fue lavada 3 × 5 min en PBS 0,1% Tween-20, 3 × para 2 min en PBS, y luego con una imagen Li-Cor Odisea del sistema de formación de imágenes por infrarrojos. La intensidad de fluorescencia integrada para cada punto se cuantificarán mediante Li-Cor Odyssey software.

Polarizado células MDCK fueron bloqueados a 4 ° C por 30 minutos en 100 μ l de apically MEDM aplicado el 10% de SFB (Mock), gp135 de anticuerpos en estado puro hibridoma sobrenadante, o el ratón monoclonal anti-E-cadherina MEDM anticuerpo diluido en el 10% de SFB a la Misma concentración efectiva (equivalente dot-blot integrado de la intensidad de fluorescencia) como la gp135 de anticuerpos. Monocapas de células fueron lavadas por pipeting con dos cambios de MEDM. L. monocytogenes Se añadieron a las células MDCK polarizada en una MOI de 140:1 en 500 μ l de los medios de comunicación y se permitió que se adhieran durante 5 min a temperatura ambiente. Monocapas de células fueron lavadas por pipeting con tres cambios de la temperatura ambiente fresco MEDM para eliminar no adhirieron L. monocytogenes . Células y adherente L. monocytogenes Que se fijaron y se cuantificó la adhesión de análisis por microscopía de por lo menos tres campos de 40 × cada uno de los tres infectados por el bloqueo de monocapas condición.

El protocolo experimental animal fue examinado y aprobado por las instituciones de cuidado de los animales y el uso comité de la Universidad de Stanford. Métodos de preparación de lazo ileal y la inoculación se modificaron las descripciones de las anteriores [41, 85]. A Nueva Zelanda Blanco de conejo 2 kg de peso fue en ayunas de 36 h antes de la cirugía. Después de la premedicación con un intramuscular (IM) de inyección de glycopyrrolate (0,02 mg / kg), se indujo la anestesia con ketamina (40 mg / kg IM) y xylazina (5 mg / kg IM). Un catéter fue colocado para permitir la administración de líquidos durante la cirugía (20 ml / kg / hora solución de Ringer lactato), un tubo endotraqueal fue colocado, y la anestesia se mantuvo utilizando gas isoflurano. Una línea media celiotomy se realizó para exponer el intestino. El cruce fue identificado ileocecal, y el íleon es doble ligated con lazos de seda justo proximal a la sacculus rotundus. Una serie de bucles ligated se preparó a partir de íleon terminal y de trabajo a lo largo de la retrógrada intestino delgado, con especial cuidado de preservar la vasculatura y mantener húmedo el intestino. Infectados osciló bucles de longitud de 4.5-5 cm de longitud. A no inoculadas "spacer" bucle de 2-3 cm se dejó entre todos los bucles inoculadas. Bucles se estira y se midió después de la preparación y luego inoculados con 4 × 10 ⁷ UFC / ml, peso de las buenas prácticas agrarias o de 4 × 10 ⁸ UFC / ml, peso de las buenas prácticas agrarias, Wt, inlA Δ Δ inlA, ActA-RFP L. monocytogenes En BHI caldo usando una aguja de calibre 25-a un volumen de 0,1 ml por cm de bucle para proporcionar un uniforme inicial de distensión. Después de la inoculación, el intestino delgado fue devuelto a su posición anatómica normal y de la piel del abdomen y las incisiones son suturadas cerrado. Isoflurano administración se suspendió y el animal fue trasladado a una zona de recuperación y se coloca en un sistema de calefacción de agua caliente-pad. El tubo endotraqueal fue eliminado cuando el animal recuperó el conocimiento, y el control del dolor fue proporcionada por la administración de hidromorfona después de la intervención a una dosis de 0,2 mg / kg IM, que se repite cada 2 h, según sea necesario. En el punto final previsto de 4 h después de la inoculación, el animal fue sacrificado con una sobredosis de pentobarbital por vía intravenosa. Individual bucles fueron cosechadas a través de incisiones por spacer bucles, y luego abrió, lavarse suavemente por inmersión en solución salina estéril, y fija plana (lumenal hacia arriba).

Time-lapse microscopía se realizó esencialmente tal como se describe en [86]. Por inmunofluorescencia microscopía, muestras fueron fijadas con paraformaldehído al 2% en buffer fosfato 100 mM (pH 7,4) (15 min de monocapas de células, y 1 h para los tejidos), y se permeabilized en PBS 1% saponina 3% de la albúmina sérica bovina o izquierda unpermeabilized Mediante el bloqueo de muestras y dilución de los anticuerpos / sondas en PBS 3% BSA. Después de la incubación con los anticuerpos adecuados / sondas, las muestras fueron montadas con Vectashield medio de montaje (Vector Laboratories, Burlingame, California, Estados Unidos) y de imagen con un microscopio confocal (Bio-Rad). Para la visualización de las vellosidades intestinales, que montamos bloques intactos los tejidos y las imágenes de los tejidos teñidos, sin previo y la incrustación de secciones. Las muestras fueron imágenes de microscopía confocal óptica de las secciones donde se tomaron en el 0,5 μ m de resolución-tanto a través de la celda y la monomoleculares vellosidades intestinales. Z-pilas fueron reconstruidas en tres dimensiones utilizando Volocity software (Improvisación, Lexington, Massachusetts, Estados Unidos). Las cifras fueron montadas con Photoshop de software (Adobe, San Jose, California, Estados Unidos).

L. monocytogenes Fueron detectados por la incubación de las muestras con Listeria O antisueros (conejo) poli tipos 1 y 4, Difco, dilución 1:600 (BD Biosciences, San Jose, California, Estados Unidos). Tight cruces fueron detectados por incubando las muestras con ratón anti-ZO-1 anticuerpos (Zymed, South San Francisco, California, Estados Unidos) en la dilución 1:300, y ver [81]. E-cadherina fue detectado por incubando las muestras con rr1 ratón mAb, un anticuerpo que reconoce un epitopo extracelular de E-cadherina en la dilución de 1:50 a 1:100 [48, 49]. Gp135 se detectó con el ratón mAb anti-gp135 (clon 3F2/DB, puro hibridoma sobrenadante) [50]. Anti-IgG Alexa-flúor conjugado de anticuerpos de la especie y reactividad espectros de fluorescencia se utiliza para la detección de secundaria (Molecular Probes). Un inmunofluorescencia dentro / fuera de tinción que distingue extracelular del intracelular L. monocytogenes Se modificó a partir de [87] con anticuerpos adecuados para este estudio. Actina fue visualizado por incubando las muestras con Alexa-flúor phalloidins conjugado (Molecular Probes). Para visualizar todos los núcleos, permeabilized muestras fueron incubadas con toto-3 (Molecular Probes). Para visualizar las células senescentes, en directo muestras fueron incubadas con Sytox verde (Molecular Probes).