Particle and Fibre Toxicology, 2006; 3: 2-2 (más artículos en esta revista)

Interleucina-12 no es esencial para la silicosis en ratones

BioMed Central
Gerald Davis S (gerald.davis @ uvm.edu) [1], Linda M Pfeiffer (linda.pfeiffer @ uvm.edu) [1], David R Hemenway (david.hemenway @ uvm.edu) [2], Mercedes Rincon (Mercedes.rincon @ uvm.edu) [3]
[1] Enfermedad Pulmonar y Cuidado Crítico de Medicina, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Vermont, Burlington, Vermont, EE.UU.
[2] Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental de la Facultad de Ingeniería y Ciencias Matemáticas de la Universidad de Vermont, Burlington, Vermont, EE.UU.
[3] Unidad de Inmunobiología, Departamento de Medicina, Facultad de Medicina de la Universidad de Vermont, Burlington, Vermont, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Silicosis características de los focos de inflamación donde los macrófagos y los linfocitos preceder y acompañar la proliferación de fibroblastos, hiperplasia epitelial alveolar, y el aumento de la deposición de material de la matriz del tejido conectivo. En el ratón después de la inhalación de sílice hay contratación de natural killer-, B-, CD4 + y CD8 + y linfocitos a los espacios alveolares, la ampliación de bronquial asociada a los tejidos linfoides (BALT), y la agregación de los linfocitos pequeños que rodean las vías respiratorias y de los vasos sanguíneos . Una fracción importante de la contratación de pulmón linfocitos producir interferón-γ (IFN-γ), y de IFN-γ-gen suprimido ratones desarrollar silicosis menos que los ratones de tipo salvaje. La interleucina-12 (IL-12) es una importante vía para la conducción de adaptación de la respuesta inmune hacia una TH1-como fenotipo. La hipótesis de que la IL-12 podría estimular la activación de linfocitos y la sobre regulación de IFN-γ, y, en consecuencia, ser un mediador esencial para la silicosis.

Resultados

C57Bl / 6, de tipo salvaje (WT) y la deficiencia de IL-12 (IL-12 KO) los ratones fueron expuestos a aire o simulado-cristobalita de sílice (61 mg / m 3) por inhalación de 5 horas / día durante 12 días y luego estudió De 1 a 112 días después de la exposición. Los ratones expuestos a la farsa-aire había histología pulmonar normal en todos los puntos. WT ratones expuestos al dióxido de titanio (72 mg / m 3) mostró macrófagos pulmonares contratación, pero no aumento de colágeno en los pulmones. Ambos WT y la IL-12 KO ratones expuestos a la sílice mostró similar progresivo de patología pulmonar, el aumento de peso húmedo del pulmón y el aumento total de pulmón colágeno (hidroxiprolina). IL-12 p35 mRNA no fue mayor en cualquiera de tensión después de la exposición de sílice; IL-12 p40 mRNA fue reglamentado hasta después de sílice en ratones WT y constitutivamente ausente en la IL-12 KO ratones. ARNm de la IL-18 no fue mayor después de la exposición de sílice. La expresión de la IL-15 (un impulsor importante para la inmunidad innata, de activación de las células Natural Killer, y la producción de IFN-γ) es abundante en el aire de ratones expuestos y se aumentó ligeramente en los pulmones de ratones con la silicosis.

Conclusión

El eje de la IL-12 de conducción producción de IFN-γ no es esencial para la plena manifestación de la silicosis en ratones expuestos a un aerosol cristobalita sílice.

Antecedentes

La silicosis es una crónica de la enfermedad difusa del parénquima pulmonar causada por la inhalación de partículas respirables de sílice cristalina. En el pulmón, los focos de inflamación con los macrófagos y los linfocitos preceder y acompañar la proliferación de fibroblastos, hiperplasia epitelial alveolar, y el aumento de la deposición de material de la matriz del tejido conectivo. Los mecanismos mediante los cuales la sílice provoca estas respuestas se han aclarado durante los últimos cuatro decenios, pero muchos siguen siendo los principales caminos desconocidos [1 - 7]. Hemos utilizado ratones expuestos a la inhalación de sílice como un sistema de prueba para dilucidar algunas de estas vías [8]. En particular, nos hemos centrado en las citoquinas producidas por los macrófagos que pueden reclutar y activar los linfocitos y los fibroblastos, y de las citoquinas producidas por los linfocitos que a su vez puede activar los macrófagos y fibroblastos modificar la función [9 - 14].

Los linfocitos son una característica destacada de las lesiones pulmonares de la silicosis, tanto en el hombre y experimental en roedores. En el ratón después de la inhalación de sílice es rápida y persistente de contratación de los linfocitos a los espacios alveolares, la ampliación de bronquial asociada a los tejidos linfoides (BALT), y la agregación de los linfocitos que rodean las vías respiratorias y los pequeños vasos sanguíneos [14]. Estos linfocitos son contratados pulmón natural killer (NK), las células, las células B, CD4 + T-células CD8 + y células T en mucho mayor número, pero en proporciones similares a los del ratón normal de pulmón [12, 15].

Una fracción importante de la contratación de pulmón en los linfocitos murinos silicosis producir interferón-γ (IFN-γ). El número de células que contienen proteínas IFN-γ, la abundancia de ARNm de IFN-γ, y la frecuencia de los sitios con las células que contienen ARNm de IFN-γ in situ son el aumento [11]. Por el contrario, la abundancia de interleuquina-4 (IL-4) parece ser relativamente reducido en este modelo de sistema de inhalación. Constitutivamente los ratones que carecen de la producción de IFN-γ (C57Bl/6- Ifng 1Ts) desarrollar patología pulmonar menos amplia y menos colágeno deposición pulmonar poco después de la inhalación de sílice [14]. Estas observaciones sugieren que la silicosis se asemeja a la T H 1 se describe el tipo de respuesta adaptativa de la respuesta inmune, o una similar T H 1-como respuesta que es importante para la respuesta innata. El papel exacto de IFN-γ siguen siendo inciertas, ya que esta citocina puede actuar a principios de la respuesta a la sílice para reclutar y activar los macrófagos y linfocitos [16, 17]. IFN-γ también podría actuar más tarde en la silicosis a down-regulación de las respuestas a fibroblastos factor de crecimiento transformante-β (TGF-β) y la disminución de la producción de colágeno [18 - 22].

La interleucina-12 (IL-12) es un importante macrófagos derivados de citoquinas que pueden llevar a la producción de IFN-γ [23]. El maduro biológicamente activa de la proteína IL-12 es un heterodimer compone de una subunidad p35 y p40 subunidad que se han reunido para producir la forma secretada p70. El aumento de la IL-12 es un primer factor determinante de que los prejuicios no comprometidos (T H 0) linfocitos T hacia una de tipo H 1 en respuesta antígeno impulsado por la inmunidad adaptativa, y la IL-12 es una citocina esencial para una acción eficaz contra patógenos microbianos intracelulares . Monómeros o dímeros (p80) de la IL-12 p40 péptido tienen distintas actividades. Interleucina-18 aumenta, pero no puede sustituir la acción de la IL-12 en la producción de IFN-γ [24 - 26].

La interleucina-15 (IL-15) se produce en la médula ósea y por una variedad de células mesenquimales linfoides y en órganos periféricos. IL-15 es esencial para la proliferación de la médula ósea y las células NK para el órgano periférico de activación de células NK [27 - 31]. IL-15 ofrece una alternativa de estímulo que puede regular hasta de la producción de IFN-γ en células NK y células T, y que parece ser una citoquina clave en la respuesta inmune innata.

La hipótesis de que la sílice podría estimular los macrófagos para producir IL-12, y, posiblemente, IL-18, y que estas citoquinas serían factores esenciales en la generación de IFN-γ. Postulamos que, cuando los ratones que carecen de la capacidad de producción de IL-12 fueron expuestos a la sílice que se desarrolle menos la producción de IFN-γ, menos inflamación de células mononucleares, de pulmón y menos salvaje que la acumulación de colágeno de tipo IL-12-suficiente ratones. Pusimos a prueba esta hipótesis expone a la sílice por una cepa de ratones modificados genéticamente en la que la IL-12 gen p40 se ha suprimido (IL-12 KO; B6.129S1-Il12b tm1jm) [32, 33]. La hipótesis resultó ser incorrecto. La IL-12 y los ratones KO C57Bl / 6 ratones de tipo salvaje expuestos a la sílice desarrollado comparable patología pulmonar, pulmón de la acumulación de colágeno, y sobre regulación de IFN-γ mRNA expresión. Los ratones expuestos a la farsa-aire o de partículas inertes a la del dióxido de titanio (TiO 2) normal de los pulmones y había servido como comparaciones de los ratones expuestos al sílice. Así, la IL-12 de señalización no era esencial en la silicosis y las vías alternativas a un T-H 1 como respuesta innata puede ser más importante.

Resultados
Crecimiento y salud en general

Todos los ratones de ambos C57Bl / 6 y IL-12 KO cepas parece ser saludable y mostró un comportamiento normal, independientemente de la exposición a la farsa-aire o cristobalita inhalación de sílice o dióxido de titanio durante 5 horas al día por 12 días. No se produjeron muertes imprevistas entre los ratones. Todos los ratones ganado peso normalmente y de manera similar; ratones al 1 día después de la exposición promedio de 22,4 g ± 2,2 g (media ± DE) y ratones a 112 días pesaba 31,4 g ± 2,3 g, un 40% de aumento de peso, sin diferencias entre los Grupos en cualquier momento.

Patología de pulmón

De tipo salvaje C57Bl / 6 ratones expuestos a la farsa-pulmones de aire ha demostrado que la histología normal en todos los puntos a lo largo de 16 semanas de estudio, un representante de pulmón sección se muestra en la Figura 1A. Tricrómico mancha azul brillante reveló fibras colágenas en la adventicia más grandes que rodean los vasos sanguíneos y las vías respiratorias, delicadas bandas de colágeno por debajo del epitelio bronquial (ver Figura 1E], y en la pleura, la delgada y, en ocasiones, dentro de los capítulos de paredes alveolares. La IL-12 KO ratones expuestos a la farsa-aire también tiene la histología pulmonar normal en todos los puntos. Las muestras del bazo y el timo se obtuvieron de todos los ratones, y parece histológicamente normal en todos los casos. El mediastínicos / derecho paratracheal ganglios linfáticos de ratones expuestos a la farsa-aire parecía normal en tamaño y estructura.

Los efectos de la exposición a TiO 2 fueron mínimos, pero detectables en todos los puntos. Macrófagos alveolares cargados de partículas fueron notables en el día 1 y parece estar aumentado en número. Estas células eran evidentes a los 14, 42, y 112 días también. Aparte de aumentar el número de macrófagos en los espacios aéreos, los pulmones de TiO 2-ratones expuestos parecía ser normal. Las paredes alveolares no fueron engrosadas, colecciones de linfocitos no se encontraron, y los focos de fibroblastos o hipertrófica tipo II las células del epitelio alveolar no eran evidentes. Un representante de la sección de pulmón de un ratón expuestos a TiO 2112 días antes se muestra en la Figura 1B.

La inhalación de sílice cristobalita patológico causado respuestas que se pusieron de manifiesto por 14 días, pero no aparente tan pronto como el día 1 en tanto la de tipo salvaje y la IL-12 KO ratones. En contraste con el TiO 2 de exposición, el aumento del número de macrófagos no se encontró 1 día después de poner fin a los 12 días de exposición. La cristobalita partículas birefringent o no son visibles por microscopía de luz polarizada (como es el cuarzo), por lo que no puede ser visto fácilmente con microscopia de luz. Por 14 días después de la exposición a la sílice ratones de tipo salvaje demostrado colecciones de células inflamatorias, dispersos exudados alveolares, y las zonas de hiperplasia de las células epiteliales de tipo II. A los 42 días después de la exposición más extensa del tejido pulmonar cambios, colecciones de linfocitos que rodean las vías respiratorias pequeñas y arteriolas, sueltos y agregados de células de fibroblastos-al igual que se hicieron evidentes. Estas características patológicas fueron más pronunciadas por 112 días después de la exposición, y los pequeños focos de aumento de la matriz del tejido conectivo material también podría ser encontrados (ver Figura 1F]. La patología pulmonar a 112 días se ilustra en las figuras 1C y 1D. Tricrómico mancha azul brillante reveló bandas de fibras de colágeno en las paredes alveolares en silicotic lesiones (Figura 1F]. El sílice expuestos IL-12 KO ratones en todos los puntos demostrado cambios patológicos que son similares en calidad y extensión a las que se encuentran en el C57Bl / 6 ratones de tipo salvaje. La patología fue, en todo caso, más extensa en la IL-12 KO que en los ratones de tipo salvaje animales, tal como se muestra en las figuras 1G y 1H.

El mediastínicos / derecho paratracheal ganglios linfáticos de ratones expuestos a la sílice se vieron muy ampliada a los 42 y 112 días después de la exposición, en tanto la de tipo salvaje y la IL-12 KO ratones. La patología microscópica mostró la ampliación de los centros germinales y la corteza, y el aumento del número de centros germinales, como hemos informado anteriormente en roedores [10, 13].

Las secciones de tejido pulmonar de todos los ratones (n = 40) se calificaron en la medida de la silicosis, tal como se describe en la Tabla 1. Diecisiete diapositivas clasificado dos veces con el fin de evaluar la reproducibilidad de observador en la puntuación. No especímenes en esta prueba una puntuación por encima de un promedio de 3,0, mientras estudios previos han mostrado ocasionales muestras de puntuación tan alta como 4,0. La mayoría de las diapositivas anotó dos veces había una diferencia de 0,5 o menos entre la primera y la segunda puntuación (r = 0,62). Los resultados de la patología de tipo salvaje y de la IL-12 KO ratones se muestra en la Figura 2. Todas las secciones de pulmón de C57Bl / 6 ratones expuestos al aire simulado fue evaluado como 0,6 o menos, y el aire-expuestos IL-12 KO ratones fue evaluado como 0,3 o menos. Los ratones expuestos a TiO 2 anotó 0,9 o menos, a pesar de que eran reconocibles por macrófagos cargados de partículas. Hasta el 1 º día posterior a la exposición de tipo salvaje ratones expuestos a la sílice anotó normalmente (0,3) y se puede distinguir de la farsa-aire especímenes. Partituras mayor que 1,0 se registraron para todos sílice expuestos muestras después de 1 día. La IL-12 KO ratones expuestos a la sílice fue evaluado como normal en 1 día, pero tuvo resultados anormales en todos los puntos de tiempo posteriores. El tipo salvaje C57Bl / 6 ratones expuestos a la sílice obtuvo resultados significativamente (ANOVA p <0,05) mayor que el dióxido de titanio o el aire-2-ratones expuestos a los 14, 42, y 112 días. El sílice expuestos IL-12 KO ratones obtuvo resultados significativamente superiores a su aire expuestos hojarasca mates a los 14 días, y las diferencias se acercó importancia (0,050 <p <0,070) los días 42 y 112. El tipo salvaje y de la IL-12 KO ratones expuestos a la sílice seguimiento de cerca en todos los puntos, y no hubo diferencias significativas entre ellos.

Pulmón peso húmedo

El peso húmedo servido como un crudo indicador acumulado de la masa de tejido conectivo matriz material, estructural células, células inflamatorias, y el líquido en el edema pulmonar. El pulmón derecho de cada ratón fue extirpada de colágeno análisis, y se pesó inmediatamente después de sacarla del tórax. Los valores para el pulmón derecho peso húmedo para cada cepa y de la exposición del grupo en el estudio de tiempos se muestran en la Figura 3. El peso húmedo del pulmón derecho en el aire de farsa expuestos los ratones de tipo salvaje aumentado a lo largo de las 16 semanas de observación (92,8 mg a 106,2 mg), un aumento del 14% en comparación con un incremento del 40% en peso corporal total. El pulmón derecho pesos aumentado de manera similar en los ratones de tipo salvaje expuestos a aire o simulado-TiO 2 y la IL-12 en ratones KO expuestos a la farsa-aire. No se encontraron diferencias significativas entre el aire o TiO 2 grupos, en cualquier momento después de la exposición.

Los pulmones de los ratones fueron expuestos a la sílice aumento en el peso en todos los puntos. Un día después de la exposición que finalizó el pulmón húmedo de los dos pesos de tipo salvaje y la IL-12 KO ratones se aumentaron ligeramente, pero las diferencias no alcanzaron significación. En días 14, 42, y 112 de sílice ambos grupos mostraron expuestos pulmón pesos que se aumentaron significativamente, y fueron aproximadamente un 65% mayor que la farsa de los controles aéreos. No se encontraron diferencias significativas entre la sílice expuestos de tipo salvaje y de la IL-12 ratones KO en cualquier momento después de la exposición.

Pulmón colágeno

La extensión de la fibrosis pulmonar se refleja en la medición total de pulmón colágeno, evaluaron bioquímicamente como la cantidad de hidroxiprolina (OH-Pro) en el pulmón derecho. Los resultados del 5 de los ratones en cada grupo se muestran en la figura 4. La cantidad de OH-Pro fue mayor en los pulmones de ratones expuestos a sílice en todos los puntos después de la exposición, y las diferencias alcanzaron significación a los 14, 42, y 112 días. No hubo diferencias entre los salvajes de tipo aire-expuestos, de tipo salvaje TiO 2-expuestos, o de la IL-12 KO aire ratones expuestos en cualquier momento puntos. La IL-12 KO ratones expuestos a la sílice tiene más pulmón OH-Pro en los cuatro puntos de tiempo. Así, la exposición de sílice causado tanto o más la acumulación de exceso de colágeno en los pulmones de la IL-12 KO ratones como en el tipo de animales salvajes.

La expresión génica de citocinas

La intensidad de la expresión de genes de varias citocinas de interés se mide por la protección de ribonucleasas ensayo. Muestras de tejido pulmonar a partir del 3 de los ratones de cada cepa y de la exposición fueron analizados en el 1, 14, 42 y 112 días después de la exposición. Todas las muestras y los genes de cada día se midieron simultáneamente en una misma hibridación, la digestión, y gel de separación de ensayo, y los resultados se ajustaron por la abundancia de dos genes expresados constitutivamente (GAPDH, L32). Los resultados de la IL-12 p35 y IL-12 p40 la expresión de los genes se muestran en la Figura 5. IL-12 p35 se expresa en baja abundancia en todos los puntos por las dos cepas, independientemente de la exposición. No se encontraron diferencias significativas entre los distintos grupos.

La IL-12 p40 subunidad se expresó en baja y constante de los niveles de tipo salvaje C57Bl / 6 ratones expuestos al aire o simulada-de TiO 2 en todos los puntos, sin diferencias por falta de tiempo o de la exposición. Los ratones de tipo salvaje expuestos a la sílice mostraron elevación significativa de IL-12 p40 expresión (p <0,002) en los cuatro puntos de tiempo, con mayor abundancia en 112 días post-exposición. La IL-12 p40 subunidad ARNm es prácticamente indetectable en la IL-12 ratones KO, como era de esperar ya que este es el gen que se ha modificado para crear la tensión [33].

La abundancia de ARNm de interferón-γ (IFN-γ) se muestra en la Figura 6. En tanto de tipo salvaje y la IL-12 KO ratones la expresión de IFN-γ parece ser aumentado más allá de 14 días después de la exposición de sílice en comparación con el aire o el simulacro-TiO 2-ratones expuestos, y se acercó, pero no significativa (0,05 < P <0,070) a 112 días. No se encontraron diferencias significativas entre las dos cepas, la IL-12 ratones KO parecían hasta-IFN-γ regulan la expresión de genes a pesar de la ausencia constitutiva de la IL-12 de señalización.

Se examinó la expresión de la interleucina-18 (IL-18) de genes, ya que esta citocina se conoce para aumentar los efectos de la IL-12 en el fomento de la producción de IFN-γ [24, 26]. La abundancia de ARNm de la IL-18 se muestra en la Figura 7 para los de tipo salvaje y la IL-12 KO ratones. Mensaje para esta citocina era abundante en ambas cepas de ratones expuestos a aire o simulada-de TiO 2 en todos los puntos. La expresión de mRNA de IL-18 fue significativamente menor en los ratones expuestos a la sílice en el momento anterior de puntos (1 - 42 días), pero se normalizó en C57Bl / 6 ratones 112 días después de la exposición. No se encontraron diferencias significativas en la expresión de IL-18 entre sílice expuestos de tipo salvaje y la IL-12 ratones KO en cualquier momento.

IL-15 es una alternativa de citoquinas producidas en el pulmón que podría conducir activación de las células NK y hasta de regular la producción de IFN-γ. Expresión de IL-15 se puso a prueba en distintos experimentos similares en los que de tipo salvaje C57Bl / 6 fueron expuestos a aire o simulado-cristobalita sílice durante 5 horas al día por 12 días. Como se muestra en la Figura 8, la expresión mRNA de la IL-15 es abundante en el aire de ratones expuestos y se aumentó ligeramente en los pulmones de ratones expuestos a la sílice en los 14 y 42 días.

Discusión
La silicosis en ratones

El C57Bl / 6 ratones de tipo salvaje expuestos a sílice cristobalita desarrollado características patológicas de la silicosis y aumentado progresivamente colágeno total de pulmón que están estrechamente similares a los que hemos informado anteriormente en ratones C3H/HeN [8]. La IL-12 KO ratones, también criados en contra de un C57Bl / 6 antecedentes, desarrollado silicosis que no se distinguen de la que se encuentra en los animales de tipo salvaje. Las dos cepas de ratones que fueron expuestos a la farsa-aire parecía ser normal y ha histología normal de pulmón en todo el experimento. Se utilizó la exposición a rutilo TiO 2 como una comparación de sílice con un mineral de partículas que se espera relativamente biológicamente inactivo y no causar fibrosis pulmonar. Aunque el TiO 2 fuera la causa de un aumento en el número de macrófagos observó en el pulmón, y muchas partículas se podían encontrar en estas células, que no provocara la contratación de un número considerable de linfocitos, neutrófilos, o de otros tipos de células, y no Causa un aumento de colágeno en los pulmones. Estos resultados ponen de relieve la inflamación y fibrosis propiedades de la sílice en comparación con otras partículas minerales, y demostrar las características específicas de la respuesta a la inhalación de sílice.

IFN-γ regulación en la silicosis

El interferón-gamma (IFN-γ) es un potente pleomórfico de citoquinas producidas por los linfocitos T activados, células NK, macrófagos y posiblemente otros tipos de células [34, 35]. La producción de interferón-gamma (IFNgamma), en respuesta a la infección es un sello distintivo de la inmunidad innata y adaptativa, y su excesiva liberación se ha asociado con la patogénesis de la inflamación crónica y enfermedades autoinmunes. Alteraciones en la abundancia de IFN-γ, se han registrado en la silicosis por varios investigadores usando la inhalación o intra-traqueal (IT) instilación en ratones y ratas, y en sílice humanos expuestos los trabajadores.

A raíz de la exposición a la inhalación de C3H/HeN ratones machos se observó el aumento de mRNA de IFN-γ, la localización de IFN-γ mRNA silicotic transcripciones de las lesiones pulmonares y bronquiales de los tejidos linfoides asociados (BALT), y el aumento del número de linfocitos (natural killer (NK) Células CD4 + y CD8 +), la producción de IFN-γ proteínas [11, 12]. En el presente estudio se observó expresión de IFN-γ mRNA a los 14 y 112 días, pero no de inmediato (1 día), después de la exposición tanto de tipo salvaje y la IL-12 KO ratones (Figura 6]. Hubbard y colegas [36] realizó la instilación IT de 1 mg de cuarzo en NF-κ B luciferase reportero ratones, y estudió las respuestas, a veces hasta 3 días después de la exposición. NF κ B se incrementó en células epiteliales bronquiales y macrófagos; homogenado de pulmón mRNA análisis mostró aumento de IFN-γ e IL-12 (p40), en respuesta a la expresión de sílice. Brown et al no observar un aumento en suero de IFN-γ o IL-12 proteínas en ratones tratados por NZM dentro de la instilación nasal con cuarzo, pero no medida de pulmón o BAL niveles de citoquinas [37]. Garn y asociados examinaron los ganglios mediastínicos de ratas después de la inhalación de sílice y observó hipertrofia nodo con un gran aumento en el número de células NK, CD4 + y CD8 + linfocitos y macrófagos [10]. El nivel de IFN-γ e IL-12 mRNA se incrementaron, mientras que la IL-4 mRNA no fue mayor. Co-cultivo de macrófagos y linfocitos de los ganglios silicotic mostró aumento de la producción de IFN-γ [13]. Por el contrario, Huaux y colegas han observado sin cambios o disminución de los niveles de IFN-γ mRNA en ratones inculcado TI con cuarzo [15, 38 - 40]. El aumento de los niveles en suero y orina de neopterin (un compuesto producido por pteridine humanos monocitos / macrófagos a la estimulación con IFN-γ [7001]) se han detectado en los trabajadores expuestos a sílice [41], lo que implica la regulación de IFN-γ en humanos silicosis .

La derogación de IFN-γ señalización ha tenido diversos efectos sobre la silicosis en los ratones. Cuando B6 ratones expuestos a la inhalación de sílice cristobalita y los examinó 90 días más tarde, IFN-γ-gen suprimido (KO) ratones desarrollado significativamente menos extensos cambios patológicos y menos acumulación de colágeno tipo de ratones silvestres [14]. Desaki et al realizaron instilación IT de 2 mg de cuarzo en la naturaleza y el tipo de IFN-γ ratones KO [42]. A los 21 días después de la instilación, el reclutamiento de células inflamatorias similares, patología pulmonar, y el aumento de pulmón OH-prolina se encontraron en ambas cepas. Chen y sus colegas de TI por las ratas tratadas con la instilación de 20 mg de cuarzo y luego con el diario de inyecciones intramusculares humana recombinante IFN-γ [41]. En 1 o 2 meses después de la exposición al sílice IFN-γ-ratas tratadas mostraron patología pulmonar y de la acumulación de colágeno que es intermedia entre la solución salina expuestos y sílice-simulacro-de citoquinas expuestos los animales, lo que implica un anti-fibrótica efecto exógeno de IFN-γ tratamiento.

Interleucina-4 regulación en la silicosis

Cambios en la IL-4 se han observado por parte de algunos, pero no todos, los investigadores el estudio de la silicosis. Huaux y asociados observó una mayor abundancia de IL-4 de señalización tras la instilación IT de cuarzo [15, 38 - 40] y la modulación de la patología y la acumulación de colágeno en los animales, donde la abundancia de IL-4 fue aumentado o disminuido en asociación con la sobre expresión de IL-10 o IL-9, respectivamente. Por el contrario, no encontramos aumento de la IL-4 mRNA o un aumento en el porcentaje de linfocitos productores de IL-4 en ratones expuestos a la inhalación de cristobalita [11, 12]. Garn y colaboradores observaron disminución de la IL-4 mRNA en los ganglios linfáticos de las ratas con silicosis [10, 37]. Chen et al encontrar una mayor IL-4 mRNA in situ después de la instilación de sílice en ratas [43]. Desaki et al realizaron instilación IT de cuarzo en la naturaleza y tipo de animales genéticamente modificados que carecían de IL-4 (KO) [42]. En particular, la IL-4 ratones deficientes no mostraron ninguna reducción en el grado de patología pulmonar o de la acumulación de colágeno.

IL-12 Biología

Interleucina-12, inicialmente descrita como "factor de maduración de linfocitos citotóxicos" o "factor estimulante de células NK", heterodimeric es una citocina que puede actuar como un factor de crecimiento de células T activadas y células NK y puede estimular la producción de IFN - Γ por las células mononucleares de descanso [44, 45]. El maduro, biológicamente activos secretada 70-kD (p70) es de citoquinas producidas por los enlaces cruzados covalentes y glicosilación de dos precursores cadenas codificadas por los genes en los cromosomas separados, el p35 y p40 subunidades. En ratones, la subunidad p35 se expresa en muchos linfoides y no linfoides tejidos incluyendo el de pulmón, mientras que la subunidad p40 se expresa en células linfoides [44] y en el epitelio de la vía aérea [46]. La IL-12 constará de citoquinas relacionados con glicoproteínas codificadas por los genes 5 reglamentado de manera independiente, que combinan como hetero-homodimeros o para producir proteínas secretadas 7: IL-12 (el p40 y p35 heterodimer), p80 (p40 homodimer), la IL-23 ( Una p40 y p19 heterodimer), p40 monómero, y otros [47]. Así, la supresión del gen p40 afectará a todos de estas moléculas.

Biológicamente activos IL-12 es producida principalmente por macrófagos, monocitos y linfocitos B. Macrófagos alveolares humanos secretan IL-12 en respuesta a la estimulación por la endotoxina, IFN-γ, y de otras señales, con la represión por autocrina de IL-10 [48]. IL-12 se produce rápidamente durante la inducción de la adaptativa inmune mediada por células respuesta a los antígenos y en respuesta a patógenos intracelulares como la tuberculosis o la Myobacterium Listeria monocytogenes. Abundantes IL-12 es una importante señal de que los sesgos impulsado por el antígeno de adaptación hacia una respuesta inmune T H 1 (IFN-γ dominado) en lugar de un fenotipo T H 2 (IL-4 dominado) fenotipo [45, 49, 50]. IL-12 unidades de las células diana a través de un único receptor de alta afinidad compuesto por dos subunidades [23]. No comprometidos (T H 0) T-células NK y células parecen ser los principales objetivos de la IL-12.

Efectos de la modulación de la IL-12

Las funciones biológicas de la IL-12 se han probado en los sistemas donde la citoquina fue aumentada por inyección, bloqueado con anticuerpos, eliminado por la modificación de los genes p35 y p40, o bloqueada por la modificación de la IL-12 receptor complejo. En el tratamiento de ratones susceptibles con exógenos recombinante murino IL-12 redujo la mortalidad de tuberculosis [51], el retraso de aparición de tumores mamarios con la reducción de la carga tumoral [52], e inhibe la infección por virus de la hepatitis B [53], al parecer a través de las acciones de IFN-γ. La administración de IL-12 en el momento de un solo antígeno desafío abolido las vías respiratorias hiper-respuesta y la eosinofilia pulmonar, y promueve el aumento de IFN-γ e IL-4 disminuido y la expresión de IL-5, en el asma de ratones sensibilizados con ovoalbúmina [54].

Neutralización de IL-12 por parte de la administración de anticuerpos aumentado la susceptibilidad de los ratones a la infección primaria con L. Monocytogenes [55], protegida BCG-priming ratones contra un letal respuesta a la endotoxina [56], y la reducción de la colitis experimental inmune [57]. La IL-12 p40-gen suprimido cepa (IL-12 KO utilizado para este informe) desarrollado por Magram y colegas [33] mostró una mayor susceptibilidad a la infección con M. La tuberculosis [58], Cryptococcus neoformans [59], y Leishmania importante [60], y mostró disminución de la severidad de la artritis inducida por colágeno [61]. Wild-tipo C57BL / 6 ratones desarrollados libre la solución de Leishmania chagasi infección con abundante IFN-gamma, en cambio, L. Chagasi enfermedad se ve agravada y IFN-gamma fue baja en la IL-12KO ratones [62].

Discoordinated producción de IL-12 p40

La subunidad p40 gen de la IL-12 se puede expresar y el péptido producto traducido en altos niveles sin coordinar la expresión de la subunidad p35 o completa de la producción de citoquinas p70. Potencialmente, estos productos pueden funcionar como p40 o p80 homodimer monómero. En este informe, se observó un aumento de los niveles de p40 transcripciones sin que se produzcan cambios en la abundancia de los niveles de p35 en ratones expuestos a la sílice, como se muestra en la Figura 5.

Soluble péptido p40 y / o homodimer parece antagonizar los efectos biológicos de la IL-12. IL-12 p40 ratones transgénicos desarrollados séricos elevados niveles de p40 y el monómero homodimer p80 y exhibió una mayor susceptibilidad a patógenos intracelulares y la reducción de demora en las respuestas de hipersensibilidad de tipo [63]. La sobreexpresión de la p40 en ratones transgénicos disminuido carcinoma vesical de erradicación [64] por la IL-12. El exceso de producción de p40 redujo T H 1 mediada myoblast rechazo de aloinjertos [65], pero no impidió el desarrollo de una T H 1-como respuesta del ratón en el trasplante cardíaco [66]. IL-12 p40 fue intensamente sobre-expresadas por epitelio de la vía aérea en ratones durante paramyxoviral bronquitis [46]. Los pacientes con lupus Eritematoso sistémico activo muestran altos niveles séricos de IL-12 p40 monómero sin elevación de los niveles de p70 heterodimer [67]. Estos informes indican que p40 puede ser producido discoordinately completa de la IL-12 p70 con importantes consecuencias para el sistema inmunológico de respuestas inflamatorias.

La interleucina-23 (IL-23) es un dímero compuesto de la IL-12 p40 y una cadena única cadena p19 que se relaciona con, pero no idéntica a la IL-12 p35 [68]. IL-23 dímeras señales a través de un receptor integrado de la IL-12R-β1, se sumó a una cadena única IL23R subunidad, y actúa a través de Jak-STAT de señalización al igual que la IL-12 [69]. IL-23 induce la proliferación de determinadas poblaciones de células T y estimula la producción de IFN-γ [68]. IL-23 es producida por los macrófagos y las células dendríticas, y puede ser inducida por la infección viral [70]. Es posible que la sobre-expresión de la IL-12 p40 que tanto nosotros como Huaux [71] observaron en ratones expuestos a la sílice puede ser destinado para su uso como componente de la IL-23, IL-23, pero no se midió en ninguno de los estudios . Ni IL-12 IL-23 ni debe ser fundamental para el desarrollo de silicosis o para la inducción de IFN-γ la expresión de los genes en ratones expuestos a la sílice ya que la IL-12 KO ratones carecen de p40, pero los dos mostraron la silicosis y de IFN-γ mRNA niveles comparables A los ratones de tipo salvaje.

Interleucina-12 en la silicosis

Huaux y asociados informaron persistente exceso de producción tanto de IL-12 p40 mRNA y proteína, pero no IL-12 p70, en las mujeres tratadas con ratones NMRI de cuarzo de sílice por instilación IT [71]. Asimismo, en comparación con los ratones hembra B6 antecedentes B6-IL-12 p35 - / - ratones que sobre-expresado p40, y antecedentes B6-IL-12 p40 - / - ratones de la misma cepa que usemos para el presente informe y los ratones tratados Con tecnología de sílice a dosis de 1 mg o 5 mg por ratón o solución salina [40]. En la dosis más baja de sílice en la medida de la silicosis (patología, OH-prolina) fue similar en los de tipo salvaje y la IL-12 p40 - / - ratones, paralela a los resultados que en este informe. En la dosis más alta de sílice de la IL-12 p40 - / - ratones fibrosis menos desarrollados que los ratones de tipo silvestre, mientras que la IL-12 p35 - / - ratones desarrollado más la fibrosis que los ratones de tipo salvaje. Cuando exógenos recombinante de IL-12 p40 péptido se administró 30 días después de la instilación de sílice, la cantidad de aumento de la fibrosis en ambos de tipo salvaje y la IL-12 p40 - / - ratones. Propusieron que la IL-12 p40 excesiva abundancia aumento de la intensidad de los macrófagos en respuesta a la sílice y el grado de fibrosis.

Nuestros resultados y sus conclusiones con 1 mg de cuarzo son similares y de apoyo. Sus conclusiones con la dosis de 5 mg de cuarzo sugieren que la falta de IL-12 p40 puede disminuir la respuesta al sílice a dosis altas. Hay varias diferencias entre los dos sistemas de prueba, así como las similitudes señaló. Huaux et al utilizarse una única instilación IT de sílice, mientras que usamos 12 días de la exposición a la inhalación. La tecnología de la dosis puede resultar en menos uniforme distribución de las partículas, y puede permitir que las partículas más grandes para llegar a los espacios alveolares que es permitido por la aerodinámica de filtración de aire inhalado. La distribución de tamaño de partícula utilizado para la instilación de TI no se informó, al tiempo que utiliza partículas muy pequeñas (diámetro aerodinámico de masa mediana de 1,3 μ m). Huaux et al ratones expuestos a sílice de cuarzo, mientras que cristobalita utilizados para la inhalación de sílice. Hemos informado previamente el pulmón carga de sílice retenido de inmediato y en determinadas ocasiones después de la inhalación de cristobalita [8], mientras que la carga de pulmón siguientes intratraqueal de cuarzo no fue descrito. Nuestra última vez fue el punto 112 días, mientras que el suyo era de 60 días. Ellos utilizaron ratones hembra, en tanto que hemos utilizado ratones machos. Es probable que la diferencia entre nuestros resultados y los suyos (menos silicosis en IL-12 p40 - / - con altas dosis de sílice) se explica por estas diferencias de diseño experimental.

Macrófagos responder a una variedad de señales quimiotaxis, tales complemento C5a, MCP-1 (CCL2), MIP-1 α (CCL3), p80, y otros mediadores. Estas señales parecen ser muy redundante, aunque cada uno de ellos puede actuar de una manera ligeramente diferente o en una fase diferente en el proceso de la migración de macrófagos. Un gran literatura apoya la importancia de que el bloqueo o la supresión de una o más de estas quimiocinas en enfermedades específicas. Russell y sus colaboradores muestra la importancia de la IL-12 p80 / R β1 señalización, pero no de IL-12 o p40 monómero de señalización, para la contratación de macrófagos pulmonares durante la infección por el virus de Sendai murino [72]. Huaux y asociados [40] mostraron disminución de la contratación de los macrófagos, neutrófilos y linfocitos después de la instilación IT de sílice en IL-12 p40 ratones KO, y el sentido atribuido a la ausencia de p80 homodimer. En el presente estudio, no observamos ninguna evidentes cambios en la abundancia de macrófagos en las lesiones pulmonares de la IL-12 KO ratones expuestos a la sílice, y el alcance general de la patología, el peso húmedo de pulmón, y el aumento de colágeno no se Reducido en comparación con los ratones de tipo salvaje. Lavado broncoalveolar no se realizó en estos estudios, y, por tanto, los macrófagos pulmonares no fueron cuantificados directamente. Nuestros resultados implican que p80 no es esencial para la expresión de la silicosis, pero no indican si esta o no de quimioquinas puede contribuir a la contratación de macrófagos en la silicosis en ratones normales.

IL-18 de biología

La interleucina-18 (IL-18) es un miembro de la familia de la IL-1 que aumenta la actividad de la IL-12 en la generación de T H 1 de la respuesta inmune tipo [73]. No puede actuar por sí solo para inducir la producción de IFN-γ, sino más bien actúa de concierto con IL-12 para producir este efecto. Se encuestó a esta citocina, ya que postula que podría contribuir al aumento de la producción de IFN-γ que se informó anteriormente [11, 12]. IL-18 mRNA abundancia disminuyó en ratones de tipo salvaje en los puntos siguientes principios de tiempo de exposición de sílice, y se encontraba en niveles normales, en 112 días. Al igual que la IL-15 o IL-12 p40, y en contraste con la IL-12 p35, IL-18 mRNA parecía ser constitutivamente producido en niveles moderados en los ratones expuestos al aire de ambas cepas. Examinamos la abundancia de IL-18, citocina este mensaje porque puede aumentar los efectos de la IL-12, y puede ser una señal importante al sesgo H 1 T o T H 2 polarización [74, 75]. Ha pleotrophic ya veces paradójica efectos [75]. Como se muestra en la Figura 7, no encontramos lo regulado en una transcripción del mRNA. IL-18 se produce como inactiva pro-péptido que se debe cleaved por caspace-1 para lograr una forma biológicamente activa. Así, la IL-18 está regulada en un nivel después de la traducción, así como a través de la transcripción. Los factores que aumente o inhibir la producción de IL-18 son en gran medida desconocidos. No tenemos una explicación de por qué la abundancia de ARNm se redujo después de la exposición de sílice. Estas observaciones sugieren que la IL-18 no podrá ser un estímulo importante hacia una T H 1-como respuesta o de la producción de IFN-γ en la silicosis. Experimentos de aumentar, el bloqueo, o la supresión de la IL-18 se activa la proteína necesaria para poner a prueba su papel directamente.

Mecanismos de la silicosis: la inmunidad innata frente de adaptación

Parece que existe una compleja red de citoquinas a través de la cual los macrófagos, los linfocitos, los fibroblastos, y de otros tipos de células interactúan para generar respuestas a las características patológicas de sílice en el pulmón. Si bien la función fundamental de los macrófagos en la silicosis se ha puesto de relieve, el papel que pueden desempeñar en este proceso los linfocitos están menos claras [1 - 7, 14]. Brown y colaboradores encontraron una mayor CD4 + T-células y un T-H 1 como fenotipo siguientes intranasal cuarzo en Nueva Zelandia Mezcla de ratones, una cepa propensos a la enfermedad autoinmune. Hubbard no informó de disminución de la silicosis en células T insuficientes "desnuda" (Balb / c nu / nu) los ratones [76], mientras que Barbarin y colegas observaron disminución de la silicosis en los ratones tratados con anticuerpos anti-CD4 [15].

La adaptación inicial de la respuesta inmune a la infección es por lo general o antígenos ya sea impulsada hacia un T-helper de tipo 1 (T H 1) o de un T-helper de tipo 2 (T H 2) fenotipo [77, 78]. El fenotipo T H 1 domina la respuesta a patógenos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis y características intensa producción de IFN-γ, cree que la motivación de la IL-12 y el aumento de IL-18 [24, 34, 79]. El fenotipo T H 2 se han utilizado en las respuestas a las infecciones parasitarias y es prominente en las respuestas alérgicas, con IL-4, IL-5, IL-13 y abundantes como las citoquinas. Estos dos tipos de respuestas se creía inicialmente que se excluyen mutuamente: IFN-γ suprime la producción de células T de IL-4 y unidades de células T hacia un fenotipo T H 1, mientras que la IL-4 tiene el efecto contrario. Lamentablemente, esta clasificación categórica es a menudo borrosa o en el complejo de las enfermedades crónicas, y las características de un T H 1 y un T H 2 respuesta se puede encontrar al mismo tiempo [80]. IFN-γ no comprometidos activa las células NK, células T, macrófagos y, pero inhibe la proliferación de fibroblastos y la capacidad de respuesta a factor de crecimiento transformante-beta (TGF-β). IL-4 también pueden activar los linfocitos no comprometidos, y la IL-13 aumenta la producción de colágeno fibroblastos impulsada por TGF-β. Actualidad teoría propone que en el pulmón T H 2-al igual que las respuestas parecen aumentar la proliferación de fibroblastos y la producción de colágeno, mientras que T-H 1 como respuestas son pro-inflamatorias, pero puede ser anti-fibrótica [81, 82]. El T H 1 / H 2 T paradigma se deriva de análisis de los linfocitos T que participan en una enfermedad infecciosa o alérgica. Ahora está claro que muchos tipos de células, además de células T pueden producir IL-4, IL-13, IFN-γ, y de otras citoquinas. Los macrófagos, células epiteliales bronquiales, y posiblemente alveolares tipo II pneumocytes pueden ser fuentes adicionales de estos mediadores. ¿Cómo podemos aplicar estas teorías a la patogenia de la silicosis y resolver algunos de los datos contradictorios en cuanto a la abundancia y el papel del IFN-γ, IL-4 o IL-12?

Una alternativa, rápida, y más primitivo itinerario reacción a sustancias tóxicas y agentes patógenos invasores es la respuesta inmune innata [83, 84]. No es antígeno-específica, y no requiere MHC-antígeno restringido presentación. La respuesta inmune innata probable sería una vía para la silicosis, ya que la sílice no es aparentemente un antígeno, y no hay pruebas de un inmunoespecífica respuesta a la misma. La respuesta inmune innata también puede implicar sobre regulación de la producción de IFN-γ por las células asesinas naturales y otros linfocitos gracias a la acción de la IL-15 [28, 85 - 87]. IL-15 es esencial para la proliferación de la médula ósea y de órganos periféricos función de las células NK [28, 87 - 90]. IL-15 participa en la inflamación pulmonar, y es esencial para el mantenimiento de locales pulmonar y la activación de las células NK [31, 85, 91]. Los ratones que son deficientes en IL-15 no generan células NK maduros, y la falta de acogida crítica innata defensa y las funciones de defensa del tumor [92]. IL-15 puede impulsar la producción de IFN-γ en las células NK y los linfocitos T, y proporciona una señal vía sesgo a la respuesta inmune innata hacia una T H-1-como fenotipo. Hemos observado importantes IL-15 mRNA en el pulmón de aire de los tejidos de ratones expuestos y ligera sobre regulación de la IL-15-expuestos en sílice, como se muestra en la Figura 8. Este hallazgo apoya la idea de que la IL-15 podría ser un mecanismo esencial de conducción en la activación de linfocitos y la producción de IFN-γ en la silicosis.

La silicosis no es impulsado por un antígeno de adaptación respuesta inmune a un antígeno específico, el agente patógeno, o alergeno. No parece ser una crónica de la respuesta inmune innata en la que el agente dañino, sílice, es persistente indefinidamente, pero no es antigénica. T-linfocitos no son esenciales, o desempeñar un papel menor amplificar [76]. Kunkel [81], ha propuesto que la crónica inmune mediada por enfermedades pulmonares seguimiento secuencial de las etapas: (1) una primera respuesta inmune innata desafío a los extranjeros, (2) una de inmunodeficiencia adquirida con la primera etapa de un T-H 1 como respuesta seguido de un T H 2-como respuesta, y, finalmente, (3) una fase de reparación con proliferación de fibroblastos y la deposición de colágeno. Strieter y Keane [82] han invocado el concepto de que un T-H 1 como la respuesta puede favorecer la resolución de la lesión y la inflamación, mientras que un T-H 2 como respuesta progresiva puede conducir a la fibrosis. Silicosis pueden adecuarse perfectamente a este paradigma. Aunque no hay pruebas de verdadera T antígeno-específicos H 1 T H 2 o respuesta en la silicosis, el aumento de los niveles de IFN-γ, IL-4, y otras citocinas puede crear una T-H 1 como H 2 o T-como local Milieu. Porque biológicamente activos IL-12 p70 proteína no parece ser incrementado o esencial (este informe, Huaux y colegas), otros mecanismos deben ser invocada para impulsar la producción de IFN-γ, de activación de las células NK, y los aspectos del proceso que se asemejan La respuesta T H 1. Proponemos IL-15 como candidato para este puesto. Las señales que principalmente podría inducir a la IL-4 o IL-13 en la silicosis no han sido identificados.

Sugerimos que la respuesta inmune innata de las partículas de sílice persiste y evoluciona con el tiempo. Con la exposición en más de una vida laboral, de reciente inhalado partículas pueden iniciar varias veces el ciclo, al tiempo que los mayores secuestrado material puede conducir fibrosis progresiva. Es probable que la más alta es la dosis más amplia de la lesión inicial y el más rápidamente las respuestas a través de las fases del ciclo descrito anteriormente. Con la instilación IT de sílice de las fases iniciales de los macrófagos y la respuesta T H 1-como citocinas pueden pasar muy rápidamente, y sólo podrán ser capturados a principios de puntos de tiempo (la nota sobre regulación de IFN-γ mRNA encontrado por Hubbard et al [36 ] A las 4 y 24 horas). La crónica fibrótica T H 2-como fase dominada por IL-4 e IL-13 puede estar en ascenso muy poco después de la exposición de TI, y la T-H 1 como respuesta ya no puede ser aparente. Cuando los roedores están expuestos a la inhalación de una dosis más baja de sílice se aplica. Esto puede prolongar la fase inicial de la respuesta de los macrófagos residentes, y puede permitir la pronta T H 1-como respuesta a IFN-γ a continuar durante al menos 4 meses, como hemos observado. Postulamos que en ambos sistemas, el modelo de transición se produciría a partir de la T H 1 - a la T-H 2 como respuesta, la más alta es la dosis de sílice, antes de la transición. Las respuestas podrían ser muy localizados en el pulmón, de manera que algunos de los primeros silicotic lesiones con muchos contratados disponen de abundantes células mononucleares de IFN-γ mientras fibrótica lesiones más avanzadas están dominadas por la IL-4. Como se señaló anteriormente, los linfocitos T y células NK pueden no ser las únicas fuentes de estas citoquinas, las células pulmonares y estructurales pueden contribuir a la señalización también.

Consideramos que el IFN-γ como teniendo un papel en la amplificación de células inflamatorias en las fases iniciales de la silicosis. Macrófagos en respuesta a la sílice y de contratación células NK y células T en respuesta a los macrófagos chemotactins puede producir IFN-γ, dando lugar a una ulterior activación de los macrófagos y linfocitos. De esta manera abundante IFN-γ temprana en la respuesta a la sílice puede exacerbar la inflamación y causa un aumento neto en la primera deposición de colágeno, mientras que la ausencia de IFN-γ puede reducir la magnitud de la patología inicial y conducir a menos principios de la deposición del colágeno como Observada [14]. IFN-γ también podría tener una modulación de anti-fibrótica papel en la posterior represión de las respuestas por la proliferación de fibroblastos y la inhibición de la producción de IL-4. Si la dosis inicial de la sílice es alta, entonces T H 2-al igual que las respuestas pueden llegar a dominar desde el principio [42].

Dado que el IFN-γ es abundante en ratones expuestos a la sílice [11 - 13], y los ratones con el IFN-γ gen suprimido desarrollar silicosis menos que el IFN-γ-suficiente ratones [14], creemos que el IFN-γ es un importante mecanicista En la vía de la silicosis. Los caminos conducen a la producción de IFN-γ durante la infección por patógenos intracelulares y después de la exposición a los antígenos que inducen un T H 1 respuesta favor de tipo IL-12 e IL-18 producidas por los macrófagos y otros tipos celulares [24, 34, 79]. Esta secuencia es una importante vía en la respuesta inmune adaptativa.

Conclusión

Llegamos a la conclusión de que el eje de la IL-12 y la activación de linfocitos conducción IFN-γ producción, la principal vía de la respuesta inmune adaptativa hacia un fenotipo T H -1, no es esencial para la plena manifestación de la silicosis en ratones expuestos a un aerosol cristobalita sílice. Es probable que la IL-18 no es un contribuyente importante a esta respuesta, ya sea, desde el ARNm de IL-18 no fue mayor después de la exposición de sílice y la IL-18 no es suficiente para provocar la producción de IFN-γ [73]. Vías distintas de la IL-12 y IL-18 parecen ser de conducción de activación de linfocitos y la contratación y la producción de IFN-γ en la silicosis, la IL-15 con un probable candidato. Este concepto implica que la silicosis es una crónica inmune innato de la respuesta inflamatoria que no convierte a las vías de la respuesta inmune de adaptación en el tiempo. Se requieren más investigaciones con el fin de explorar estos mecanismos.

Métodos
La exposición a la inhalación de ratones

De tipo salvaje C57Bl / 6 (WT) y la interleucina-12 deficientes (IL-12 KO) se compraron ratones machos de la Jackson Laboratory, Bar Harbor. ME a las 6 semanas de edad, y fueron alojados en la presión positiva de la presión de barrera unidades de vivienda (Thoren, Hazelton, PA) con el ratón chow y el agua proporcionó ad libitum. La IL-12 KO ratones fueron desarrollados por Jeanne Magram [33] y estaban disponibles comercialmente (Jackson Stock N º 002693; B6.129S1-Il12b tm1jm). Los ratones fueron expuestos por inhalación en cámaras separadas por 5 horas por día durante 12 días para simulacro de aire, rutilo dióxido de titanio (TiO 2, MMAD = 0,5 μ m) en 72 mg / m 3 ± 30 mg / m 3 (media ± SD ) O cristobalita sílice (MMAD = 1,3 μ m) a 61 mg / m 3 ± 16 mg / m 3. Las cámaras utilizadas flujo horizontal de la temperatura y la humedad acondicionado-aire filtrado HEPA continua con la vigilancia del medio ambiente y gravimétrico mediciones diarias de las concentraciones de polvo en el ambiente. El WT ratones fueron expuestos a aire o TiO 2 o sílice y, simultáneamente, la IL-12 KO ratones fueron expuestos a aire o de sílice. Las características del sistema de exposición y las características de la silicosis en ratones expuestos en estas condiciones se han descrito en detalle [8, 93, 94].

De estudios y calendario de la cosecha de órganos

Grupos de 5 ratones fueron estudiados para cada cepa, la exposición condición, el punto y la hora. Los ratones estudiados fueron 1, 14, 42, y 112 días después de la exposición se completó. Los ratones fueron asesinados por inyección intra-peritoneal de pentobarbital de sodio (200 mg / kg). Dos animales de cada grupo tenía la tráquea cannulated, el tórax abierto, la vena cava inferior y aorta transected, el pulmón derecho transversal sujetar el hilo y en el pulmón izquierdo inflados con paraformaldehído al 4% en 10 cm H 2 O de presión, y celebró Por 3 minutos. El aislado pulmón derecho fue removido, pesadas, y congelados inmediatamente para OH Pro-análisis (total de pulmón colágeno). El inflado pulmón izquierdo fue retirado, fijo por 24 horas en paraformaldehído 4% a temperatura ambiente, y luego transferido a un 70% de etanol y que se celebró en 5 ° C. El fijo de pulmón especímenes fueron incluidas en parafina, seccionadas a 4 μ m, y teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) para el examen microscópico. Tres ratones en cada grupo había abierto inmediatamente el tórax, el pulmón derecho eliminado, pesadas, y congelados de hidroxiprolina análisis, y el pulmón izquierdo eliminado, pesadas, y de inmediato se hundió en nitrógeno líquido. El pulmón izquierdo especímenes congelados se celebraron en -80 ° C hasta el ARNm se extrajo y analizó. Así, en cada grupo hay 5 muestras de pulmón de colágeno, 3 muestras de mRNA abundancia, y 2 muestras para histopatología.

Histopatología

Tejido pulmonar secciones teñidas con H & E se examinaron por microscopía de luz en el 40 - a 400 veces de aumento. Un semi-cuantitativos nivel 5-Resultado patología pulmonar fue utilizado para la medida de grado de anormalidades en cada campo microscópico a 200 ×. La escala de clasificación se muestra en la Tabla 1. Las etiquetas de las diapositivas de las secciones de pulmón y enmascarados se presentan en orden aleatorio de puntuación por un investigador (GSD). Diez campos microscópicos con parénquima pulmonar fue evaluado y para generar un promedio de calificación de cada ratón. Aproximadamente 1 de cada 10 de las diapositivas fue reciclado para repetir de puntuación para evaluar la variación intra-observador. El promedio de estos dos resultados se utilizó para ratones que se anotó dos veces. Tejido pulmonar fueron teñidos con Masson Trichome a revelar colágeno fibrilar y proteínas de la matriz del tejido conectivo, y fueron fotografiados por microscopía de luz a 400 × magnificación original.

Pulmón colágeno

Total de pulmón colágeno para el pulmón derecho de cada ratón se calcula midiendo el contenido de OH-Pro por ensayo colorimétrico, que se describió anteriormente [8]. En breve, el pulmón derecho se seca durante 24 horas a 60 ° C, con pestle en polvo, y pesado. La mitad del polvo fue digerida en 6N HCl a 110 ° C durante 18 horas, neutralizados con NaOH 6N, reaccionó con cloramina-T solución de ácido perclórico y el reactivo de Ehrlich, y la densidad óptica de la solución medido a 560 nm. Diluciones seriadas de trans-hidroxi-L-prolina se utilizaron para preparar una curva estándar de comparación. Los resultados se expresaron como μ g OH-Pro por pulmón derecho.

La expresión génica de citocinas

La abundancia de ARNm de citoquinas de los genes de interés se evaluó a través de un ensayo de protección comercial ribonucleasas (Riboquant conjuntos de genes mCK-1b y mCK-2b, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). El ARNm de la izquierda se extrajeron muestras de pulmón en Trizol (Life Technologies, Grand Island, NY) y purificada a través de un 100% de etanol frío. El juego mezcla de cDNA oligómeros se transcribe como anti-sentido ARNm con radiolabeling con 32 P-UTP. Alliquots de pulmón RNA total se reaccionó con la etiqueta mezcla de sentimiento anti-ARNm's, digeridos con RNasa, que se aplica a las vías de un gel de poliacrilamida vertical, a través de electrophoresed tris-borato-EDTA buffer para separar los fragmentos sin digerir protegidas, y el gel para el secado 1 hora. Una hoja de película (Kodak, Biomax MR) se aplicó a la gelatina y expuestos durante 18 horas a -80 ° C durante la visualización de las bandas. El gel se aplica luego a la impresión de imágenes de pantalla y la densidad de cada banda de leer en un phosphoimager (Bio-Rad, Hercules, CA). La expresión de la IL-12 p40, p35 IL-12, IL-15, IL-18, y el interferón gamma (IFN-γ) se examinaron para el presente informe. Sondas para L32 y glyceraldehyde-3-fosfato dehyrogenase (GAPDH) se incluyeron en la mezcla como normas de referencia para los genes expresados constitutivamente no se espera que el cambio en la abundancia. El phosphoimager densidad para cada banda de citoquinas fue ajustada por la abundancia de GAPH y L32 en el mismo carril por un promedio de los dos últimos valores, dividiendo el valor de citoquinas por el medio, y multiplicando el resultado por 100. Los 3 valores de los ratones en cada cepa / exposición / tiempo promedio del grupo fueron el punto de expresar un valor medio para cada uno de citoquinas de interés.

Estadísticas

Los datos de todas las variables se expresaron como media ± desviación estándar. Las diferencias entre los grupos debido a la cepa, la exposición, o el tiempo después de la exposición fueron evaluadas por un solo sentido el análisis de la varianza (ANOVA) con la prueba post-hoc por el método de Bonferroni (Systat v10, SPSS Inc, Chicago, IL).

Abreviaturas

BALT bronquial asociada a tejido linfoide

GAPDH Glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa

H & E Hematoxylene y eosina mancha

IFN-γ interferón-γ

IL-interleucina-# #

IL-12 IL-12 KO ratones deficientes (B6.129S1-Il12b tm1jm)

Intratracheal instilación IT

NK-celular de células asesinas naturales

OH-Pro hidroxiprolina

TGF-β Transformación de factor de crecimiento-β

TiO 2 Dióxido de titanio

Conflicto de intereses

Los autores no tienen ningún interés económico, académico, o de otros intereses personales que influyen o competir con los resultados y opiniones presentadas en este informe.

Contribuciones de los autores

GSD dirigió la investigación, se examinó la patología, analizó los datos y es el principal responsable de la redacción del manuscrito. La LMP diseñado experimentos de laboratorio, los métodos desarrollados, y realizó el análisis de laboratorio. MR ayudó en el diseño de los experimentos, el análisis de los datos, y la preparación del manuscrito. DRH realizó la toxicología de inhalación y supervisado el cuidado de los animales. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Los autores Justin Robbins gracias por su asistencia técnica con la exposición a la inhalación procedimientos. Este trabajo recibió el apoyo de subvención R01-HL-62323 de los Estados Unidos Nacional del Corazón, Pulmones y Sangre.