Journal of Experimental & Clinical Assisted Reproduction, 2006; 3: 1-1 (más artículos en esta revista)

Microdeleciones en el cromosoma Y los hombres infértiles con idiopática oligo o azoospermia

BioMed Central
Ali Hellani (hellani@kfshrc.edu.sa) [1], Saad Al-Hassan (saad@kfshrc.edu.sa) [2], Muhammed Iqbal A (iqbal@kfshrc.edu.sa) [1], Serdar Coskun (Serdar@kfshrc.edu.sa) [1]
[1] Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, el Rey Faisal Specialist Hospital y Centro de Investigación, Riad, Arabia Saudita
[2] Departamento de Obstetricia y Ginecología, Hospital King Faisal Specialist y Centro de Investigación, Riad, Arabia Saudita

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Resumen

Aproximadamente el 30-40% de la infertilidad masculina se debe a razones que se desconocen. Genéticos contribuciones a la alteración de la espermatogénesis y se sugieren entre los factores genéticos estudiados, el cromosoma Y microdeleciones representan la más común. La detección de microdeleciones en AZFa, byc región del cromosoma Y mostró una gran variación entre los diferentes estudios. El propósito de este estudio fue investigar la prevalencia de esas supresiones en hombres sauditas. Un total de 257 pacientes con idiopática oligo-azoospermia o se hacen pruebas de microdeleciones en el cromosoma Y 19 marcadores en la región AZF. Diez (3,9%) pacientes tuvieron reordenamientos cromosómicos, seis de ellos del sexo mostró anomalías cromosómicas y cuatro pacientes tenían aparentemente equilibrada autosómica rearrengements. Ocho de los 247 pacientes restantes (3,2%), con un cariotipo normal, no conoce las causas de la alteración de la espermatogénesis ha cromosoma Y microdeleciones. Entre ellos, seis pacientes tenían deleciones en la región AZFc, uno de los casos tenía una supresión en AZFb y otro tanto ha AZFa y AZFc tachaduras.

En conclusión, nuestro estudio muestra que el cromosoma Y microdeleciones son bajos en nuestra población. También informe por primera vez un caso único punto con deleciones de las regiones AZFa y AZFc. La menor frecuencia de deleciones en nuestro estudio sugieren que otros genéticos, epigenéticos, nutricionales y factores locales pueden ser responsables de idiopática oligo-azoospermia o en la población saudita.

Introducción

Aproximadamente el 10-15% de las parejas se ven afectadas por la infertilidad. El factor masculino puede ser diagnosticado en aproximadamente el 50% de ellos y cerca de 30-40% de la infertilidad masculina se debe al origen desconocido [1]. Poco se sabe acerca de los desórdenes genéticos que causan trastornos de la espermatogénesis. Los primeros estudios citogenéticos microscópico mostró que las supresiones en el brazo largo del cromosoma Y son responsables de azoospermia [2]. Con el avance de la biología molecular, tres regiones no superpuestas llamado "azoospermia factores" (AZFa, b, c de proximal a distal Yq región) se han definido como espermatogénesis loci [3]. Ahora es ampliamente aceptado que dentro de esas supresiones tres regiones gravemente disminuir la producción de esperma [4]. El poder de reacción de polimerasa en cadena (PCR) y la disponibilidad de la secuencia de etiquetado sitio de mapas (STB) hizo posible la detección de deleciones intersticiales en Yq11 región que fue invisible por cariotipo [5]. Tal microdeleciones se han comunicado con la prevalencia varía en diferentes poblaciones y estudios [6].

La introducción de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) en el tratamiento de la infertilidad masculina [7] permite el uso de esperma de oligo-o azoospérmico a los pacientes para lograr el éxito de fertilización y embarazos. Esta tecnología plantea tanto a la esperanza para los hombres infértiles a tener su propio niño, que de otro modo sería imposible y preocupaciones de los profesionales de la medicina acerca de la herencia del cromosoma Y supresiones y alteraciones genéticas a las próximas generaciones. Aunque estos pacientes tienen derecho a padre de un niño con la tecnología actual, sin embargo, deben ser asesorados acerca del riesgo que se transmite a su descendencia [8]. El objetivo de este estudio fue el de la pantalla de microdeleciones en el cromosoma Y los hombres infértiles que fueron candidatos para el tratamiento y la ICSI con idiopática o oligo-azoospermia.

Materiales y métodos
Los pacientes

Un total de 257 pacientes infértiles Saudita con azoospermia u oligozoospermia idiopática se matricularon en el estudio. Los pacientes fueron reclutados de la clínica de infertilidad en el Hospital King Faisal Specialist y Centro de Investigación. Todos los hombres fueron sometidos a examen físico completo, análisis de semen y endocrinos trabajos de puesta en marcha (FSH, LH, TSH, testosterona, prolactina). Los pacientes con dos muestras consecutivas con espermatozoides inferior a 10 × 10 6 / ml se han marcado como candidato para el estudio y se refirió a un andrólogo. Estos candidatos se revisaron para la historia médica de los trastornos por ejemplo, la diabetes, la anemia de células falciformes, la enfermedad hepática y renal, la radiación, alteración endocrina (por ejemplo, de prolactinomas, hipogonadismo hipogonadotrófico), la exposición a toxinas y / o medicamentos que afectan la espermatogénesis; bruto dismorphic anomalías; adquiridos Congénitas y defectos estructurales del sistema urogenital (fibrosis quística, síndrome de Young); historia de la intervención quirúrgica de la obstrucción del tracto genital / disfunción. Los pacientes con pruebas positivas de cualquiera de las condiciones mencionadas anteriormente fueron excluidos del estudio. Tras el diagnóstico de idiopática oligo o azoospermia, se aconsejó a los pacientes para el estudio y pedirá que firme un formulario de consentimiento informado para cariotipo y el cromosoma Y microdeleción análisis. ADN aislado de 53 hombres sauditas con análisis de semen normal se utilizó como control. Un IRB se obtuvo la aprobación para el estudio.

Cariotipo

Se realizó un análisis citogenético de fito-hemaglutinina de linfocitos estimulada por las culturas de protocolo de rutina de laboratorio. Por análisis microscópico, metafase los cromosomas se tiñeron con la técnica de Giemsa tripsina-[9]. Para el análisis de cromosomas, de 10 a 20 células fueron analizados, y dos a cinco de metafases fueron karyotyped. Para la definición de anomalías cromosómicas, el Sistema Internacional de Nomenclatura citogenética Humanos (ISCN) fue seguido [10].

Extracción de ADN y PCR

ADN genómico fue preparado a partir de muestras de sangre periférica utilizando DNAzol de acuerdo a las instrucciones del fabricante (InVitrogen, EE.UU.). Un total de 19 secuencias específicas (STS-3 marcadores en AZFa, 7 de marcadores en AZFb y 9 marcadores en AZFc) se han evaluado utilizando la reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Tabla 1]. Reacción en cadena de polimerasa se ha ejecutado a amplificar cada locus por separado sin usar multiplex PCR. Mujeres ADN y el agua se utilizaron como controles negativos. PCR se realizó en un volumen total de 20 μ l de la mezcla de reacción y de 40 ng de ADN de cada muestra, 1 × PCR buffer, 1,5 mmol / l MgCl2, 200 μ mol / l dNTP 1 μ mol / l de cada primer par y 1 U Taq ADN polimerasa (InVitrogene, EE.UU.). Las reacciones se llevaron a cabo en un termociclador (MJ Research, EE.UU.). Después de un primer paso de desnaturalización a 94 ° C durante 5 minutos, mediante amplificación por PCR de 35 ciclos se realizaron de la siguiente manera: 95 ° C durante 1 min de desnaturalización, 55-62 ° C durante 80 segundos ramping para el primer recocido y 72 ° C durante 60 SEC de prórroga. Los programas fueron seguidas por el paso de extensión final a 72 ° C por 7 min. Los productos de reacción fueron analizados por electroforesis a 100 V en geles de agarosa al 2% (Sigma, EE.UU.). En caso de que una supresión se observó, una segunda partida se realizó con el fin de confirmar la eliminación de la presencia de un control positivo para que se suprima.

Resultados

Un total de 257 pacientes fueron estudiados. De ellos, 113 eran hombres azoospérmico. Entre 144 oligozoospermic hombres, 110 fueron graves oligozoospermic (<1 × 10 6 / ml) y los 34 restantes tenían una espermatozoides entre 1 × 10 6 y 10 × 10 6 / ml. Diez (3,9%) pacientes tuvieron reordenamientos cromosómicos. Los resultados del análisis citogenético en 10 hombres infértiles se muestran en la Tabla 1. Tres casos mostraron 47, en consonancia con cariotipo XXY, síndrome de Klinefelter, uno de los casos con 47, XYY, uno de los casos con 45, X/46, XX mosaicismo, en dos casos con pericentric inversiones del cromosoma 1 y de Y, un caso de la t (X; Y ) La participación de la pseudo-autosómica región y el gen SRY confirmado por técnicas de citogenética molecular y dos de los casos aparentemente translocación equilibrada recíproca de autosomes. Los dos pacientes que habían 45, X/46, XX y mosaicismo t (X, Y) también mostró microdeleciones en el cromosoma Y PCR. Análisis de semen en todo el grupo con el cromosoma reordenamientos varió de azoospermia a oligozoospermia. Tres de cada 5 hombres habían azoospérmico biopsia testicular para la identificación de los espermatozoides en la preparación húmeda, sólo uno fue positivo para la presencia de los espermatozoides (Tabla 1].

Ocho pacientes (3,2%) de un total de 247 restantes con cariotipos normales y no conoce las causas de la alteración de la espermatogénesis ha cromosoma Y microdeleciones. Seis pacientes tenían deleciones en la región AZFc, uno tenía una supresión en AZFb y los otros dos habían AZFa y AZFc supresiones (Tabla 2]. Hubo grandes supresiones en seis pacientes que abarca muchos STS, entre estos, cinco fueron casi similares que cubren la mayor parte de la región AZFc y mostraron una ausencia total de AZFb marcadores utilizados en este estudio. En cuanto a las pequeñas correcciones, el STB en una AZFa y uno en la región AZFc habían desaparecido en un paciente (fig. 1], mientras que en otro, sólo una AZFc STS marcador se ha eliminado (Tabla 2]. Cincuenta y tres muestras de ADN extraídas de los pacientes con niveles normales de espermatozoides, motilidad y morfología mostró ausencia de deleciones utilizando los mismos marcadores STS.

Discusión

Cromosoma Y se han microdeleciones en el creciente interés de los médicos y los científicos después de ICSI se introdujo para ser la principal opción de tratamiento para el factor de infertilidad masculina severa. Algunos estudios muestran una alta incidencia de microdeleciones en el cromosoma Y idiopática oligo o azoospermia [11 - 13], que llevó a muchos investigadores a la pantalla de sus poblaciones. La frecuencia de deleciones se informó de que en el rango de 0.7-34.5%, con un promedio de 8,2% [6]. Los resultados se muestran en este estudio (8 de 247 y 3,2%) se encuentra en la parte inferior de este rango. La amplia gama de las supresiones en diferentes publicaciones se sugirió que se debe a la composición étnica de las poblaciones de estudio en diversos estudios. [14, 15]. Además, los criterios de inclusión podría también han desempeñado un papel importante en esta variable de la frecuencia de supresión. Por otra parte, diferentes protocolos y el número de marcadores utilizados en los estudios podrían haber contribuido a la variación. También se realizó cariotipo y la prevalencia de la anormalidad se estimó en 3,96% (10/257). Esto es ligeramente inferior a la de otros informes [16, 17].

De los 247 pacientes con niveles normales de karyptypes y sin una causa conocida de infertilidad, 3 / 108 (2,8%) azoospérmico y 5 / 139 (3,6%) del cromosoma Y ha oligozoospermic microdeleciones, respectivamente. Si bien la tasa de eliminación fue similar en estos dos grupos en nuestro estudio, microdeleciones en el cromosoma Y azoospérmico a los pacientes es de aproximadamente dos veces más de oligozoospermic los de estudios anteriores [6]. Esta discrepancia puede deberse de nuevo a nuestra población de pacientes o el umbral de la concentración de espermatozoides seleccionados para el cromosoma Y microdeleción análisis. Nuestros criterios de inclusión fueron menores, porque todos los casos idiopáticos con menos de 10 × 10 6 / ml de espermatozoides se incluyeron en el estudio. Todas las supresiones se observó en los pacientes graves oligozoospermic (<1 × 10 6 / ml, 5 / 106, 4,7%), mientras que ninguno de los 33 pacientes con espermatozoides entre 1 y 10 × 10 6 / ml tenía tachaduras. Del mismo modo, ninguno de los 53 hombres normozoospermic incluido como normal el control de cualquier supresiones en nuestra población. Esto indica que ninguna de las supresiones observada en nuestro estudio se debe a polimorfismos. Además, la supresión en general fértil ha informado de los controles a ser inferior al 0,5% publicado anteriormente en los informes [6, 18].

Cinco de los 8 pacientes con cromosoma Y microdeleciones tienen casi toda la región AZFc eliminado. La infertilidad fenotipo de los pacientes con deleciones grandes AZFc varía de azoospermia (2 pacientes) a severa oligozoospermia (3 pacientes). Se ha demostrado que la reducción del número de espermatozoides que conduzca a la azoospermia puede ser secundario a la vez dependiente de células germinales de regresión [3, 19]. En este informe, sin embargo, no hemos visto ninguna tendencia de fenotipo cambia de acuerdo a las edades.

Uno de los pacientes portaba una supresión de toda AZFb. Esta supresión es mayor que el publicado por Ferlin et al. [20]. El paciente con AZFb supresión azoospérmico mostró un fenotipo que está de acuerdo con las sugerencias que se indica que AZFb supresión tiene un pronóstico desfavorable para la búsqueda de espermatozoides en la biopsia testicular [21, 22].

Un paciente con oligozoospermia grave en este estudio ha supresiones, de 2 de STS (una AZFa y otros AZFc). Estas supresiones son únicas y lo mejor que sabemos, éste es el primer informe que muestra AZFa y AZFc punto supresiones en la misma persona. Repetir las pruebas con diferentes controles constantemente confirmó la supresión en este paciente. A pesar de las supresiones que se forman en la AZFa son en su mayoría asociados con el síndrome de sólo células de Sertoli [23], oligozoospermia grave en nuestro paciente con AZFa y AZFc supresiones no era sorprendente porque Kamp et al. [23] Asimismo, informó de que sólo AZFa completa supresión se asocia con la ausencia de espermatozoides que se han producido casos de los espermatozoides con la recuperación parcial AZFa tachaduras.

La mayoría de las supresiones se de novo en el origen y la transmisión de estas supresiones a la descendencia masculina es del 100% [24 - 27]. El porcentaje microdeleciones del cromosoma Y es más baja en nuestra población, sin embargo, el uso común de ICSI por factor masculino severo infertilidad requiere una adecuada consejería.

En conclusión, el cromosoma Y microdeleciones cromosómicas rearrengements y se baja en nuestra población, lo que contribuye a un pequeño por ciento de idiopática y oligo-azoospermia. Esto garantiza que otros adicionales genéticos, epigenéticos, nutricional y de los factores locales que se han de investigar en la etiología idiopática de oligo-o azoospermia.

Agradecimientos

Este estudio cuenta con el apoyo de una subvención del Rey Abdel Aziz de la Ciudad de la Ciencia y la Tecnología.