Head & Face Medicine, 2006; 2: 4-4 (más artículos en esta revista)

Análisis cuantitativo de la arquitectura de revestimiento epitelial radicular y quistes odontogénicos keratocysts

BioMed Central
Gabriel Landini (G. Landini @ bham.ac.uk) [1]
[1] Unidad de Patología Oral. Facultad de Odontología, Universidad de Birmingham, del St Chad Queensway, Birmingham B4 6NN, UK

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

En este artículo se describe un análisis cuantitativo de la arquitectura de revestimiento en quiste radicular quistes (inflamatoria de etiología) y odontogénico keratocysts (que se consideran de desarrollo o neoplásicas), incluidas sus homólogos 2: solitario y asociado con el Síndrome de Nevo basocelular (BCNS).

Métodos

Epitelial forros de 150 imágenes (entre el 9 de quistes radiculares, 13 de incomunicación keratocysts y 8 BCNS keratocysts) fueron segmentados en teórico células por medio de semi-automatizado partición basada en la intensidad de la tinción de hematoxilina exclusivo de las zonas que se definen en relación con cada núcleo detectado. Varios parámetros morfométricos se extrajeron de estas "células" y la capa epitelial miembros se calculó utilizando una rutina sistemática de la agrupación.

Resultados

Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los 3 tipos de quiste, tanto en los planos arquitectónicos y morfológicos de la mucosa. Caso de discriminación entre los sabios y los quistes radiculares keratocyst fue sumamente preciso (con un error de sólo 3,3%). Sin embargo, la odontogénico keratocyst subtipos no podía ser fiable separados en el original de las clases, el logro de tasas de discriminación ligeramente superior al azar las asignaciones (60%).

Conclusión

La metodología que se presenta es capaz de proporcionar nuevas medidas de la arquitectura del epitelio y puede ayudar a caracterizar y comparar tejido organización espacial, así como proporcionar una serie de procedimientos para la automatización de ciertos aspectos del diagnóstico histopatológico.

Introducción

Quistes odontogénicos de las mandíbulas son diferentes patologías. Por definición, se trata de quistes (es decir patológicas cavidades con líquido o semi-líquido contenido, pero con exclusión de pus) con un revestimiento epitelial que se deriva de la formación de los dientes-órgano epitelios: los llamados glándulas de Serres (restos de la lámina dental), Los restos de Malassez (restos de la vaina de Hertwig raíz) y la reducción de esmalte epitelio (restos del esmalte dental corona de órganos después de la formación) - aunque para odontogénico keratocysts también se ha propuesto que el revestimiento de la mucosa pueden derivar de células basales [12 ]. La etiología de estas lesiones ha sido tradicionalmente clasificados en dos grupos diferentes: desarrollo (dentígero, keratocysts, gingival, quistes, etc) e inflamatorias (radicular, residual, paradental quistes). En cuanto a su incidencia, los quistes radiculares son las más comunes (en su mayoría asociados a los dientes con la pulpa de necrosis debido a la caries dental avanzada), seguido por dentígero y odontogénico keratocysts (OKs) [12].

Algunos tipos de quistes odontogénicos tienen carácter epitelial forros y difieren en su comportamiento. Si bien la mayoría de los quistes epiteliales se cree que pasivamente crecer impulsada por la presión hidrostática en el interior de la luz creada por el contenido líquido del quiste hipertónica (la mayoría de los desechos epiteliales desquamation), que es mantenida por el semi-permeable revestimiento epitelial, otros quistes muestran activa proliferación celular, por lo tanto, para El diagnóstico, es importante para caracterizar cuantitativamente las diferencias entre las distintas entidades.

En relación a OKs, hay dos cuestiones importantes de diagnóstico. En primer lugar, que comúnmente muestran activas epiteliales crecer, que ha llevado a la convicción de que tal vez deberían ser considerados como los tumores en vez de los quistes. Este parece ser el apoyo de la observación de que las células epiteliales de la mucosa de las lesiones poseen anomalías genéticas en genes supresores de tumores específicos [1]. En segundo lugar, que se conoce su existencia en dos modas: solitario (o esporádicos) y como parte de la basocelular Nevo (o Gorlin-Goltz's) Síndrome (BCNS). Este síndrome es una enfermedad autosómica dominante con penetrancia completa y expresividad variable, caracterizado por la presencia de múltiples nevoid carcinomas basocelulares de la piel, múltiples (sincrónico o metacrónico) keratocysts odontogénicos de las mandíbulas, anormalidades esqueléticas, calcificaciones ectópico palmar y plantar o piscinas . El diagnóstico de un bien, por lo tanto, es un importante indicio de que debe bandera de la necesidad de un examen más detenido de otros signos BCNS. Esto ha dado lugar a preguntas acerca de si es posible diferenciar entre los dos subtipos de keratocyst histomorfológicos en el nivel. Opiniones de los expertos sobre este tema parecen contradictorios [2]. Si bien algunos autores han reportado diferencias significativas entre la incomunicación y BCNS OKs, la posibilidad de discriminación en una estadística a nivel de diagnóstico (clasificación) efectos no se ha dirigido a proporcionar una respuesta definitiva.

Por lo tanto, en este documento, el análisis se dirigió a dilucidar este problema mediante el estudio 1), la arquitectura diferencias entre dos tipos principales de los quistes odontogénicos: quistes y keratocysts radicular, y 2) la incomunicación entre el BCN y el síndrome de keratocyst subtipos.

Esto fue investigado por medio de técnicas de tratamiento de imágenes aplicado a las imágenes digitalizadas histológico de los quistes mediante una sistemática discretisation espacial de los elementos celulares en el revestimiento epitelial. Con este fin, un método teórico de la segmentación de células epiteliales en el compartimento se aplicó, seguido de un algorítmico resultante de la agrupación de células en "capas". Por último un análisis morfométrico de la segmentación de las células (indexados por la capa a la que pertenecen) se aplicó para permitir comparaciones estadísticas y la discriminación a través de los diferentes tipos de clases patológicas.

Materiales y métodos

El material de este estudio consistió en 5 μ m de espesor secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H & E) de parafina y fijado con formalina incrustados espécimen histológico de los archivos del Servicio de Diagnóstico Oral de la Universidad de Birmingham.

Las muestras incluyen 9 casos de quistes radiculares (Hombre: Mujer ratio de 5:4, con una edad media de 41 años ± 18 años), el 13 de la incomunicación keratocysts (sin infiltración inflamatoria) (Hombre: Mujer ratio de 5:1, con una edad media de 35 años ± 18 años) y 8 diferentes keratocysts de 5 pacientes con la BCNS (también sin infiltración inflamatoria) (Hombre: Mujer ratio de 2:3, con una edad media de 20 años ± 3). Para cada caso, el 5 de la no superposición de imágenes con revestimiento epitelial intacta y sin aparente dirección oblicua de la sección fueron capturadas (total: 150 imágenes). Las imágenes fueron digitalizadas mediante un microscopio Olympus BX50 (Olympus Optical Co Tokio, Japón) con el objetivo UPLanFl × 40 (de resolución: 0,45 μ m) a un tamaño de 768 × 572 píxeles (resolución: 0,31 μ m). Una cámara en color JVC KY-55 ° B. 3-CCD (JVC, Tokio, Japón) se adjuntó a una de 24 bits RGB frame grabber (Imaging Technologies IT4PCI, Bedford, MA, EE.UU.), y controlada por Optimas versión 6.51 (Medios de comunicación cibernética, Silver Spring, MD, EE.UU.) el software se ejecuta en un PC estándar. Las imágenes son la media de 32 disparos consecutivos (para reducir el ruido de la cámara) y fueron corregidos por la computación proporción de la imagen con un marco de 32-un promedio de la iluminación de fondo sobre el terreno (para compensar a los desiguales y de la iluminación de fondo de filamentos de temperatura de color) menos un 32 -- Marco en promedio no iluminado marco (para compensar el sesgo electrónico CCD). Ulteriores procedimientos de imágenes se realizaron con ImageJ versión 1.34 (a multiplataforma, libre y de código abierto de imágenes programa escrito por W. Rasband en el NIH, EE.UU.) [9]. Los procedimientos analíticos o bien fueron escritas en ImageJ internos de macro lenguaje de scripting o como "plugin" para ImageJ módulos escritos en el lenguaje Java (Sun Microsystems Inc, Santa Clara, EE.UU.).

Cell perfil segmentación

Con microscopía de luz, de H & E manchadas secciones que no es posible definir constantemente los límites entre las células epiteliales adyacentes. En lugar de ello, el perfil teórico de células medida aproximada se utiliza un espacio de partición de procedimiento. Esto ha sido descrito en detalle en otro lugar [6, 7]. En pocas palabras, la segmentación se realiza en dos pasos: 1) la localización nuclear basado en la densidad óptica de la tinción histológica, seguido de 2) una partición territorial de la epiteliales compartimento exclusivo en zonas de influencia de cada núcleo perfil. La localización nuclear (paso 1) se determinó por el aislamiento de las zonas teñidas con hematoxilina el color deconvolución algoritmo desarrollado por Ruifrok & Johnston [11]. El "deconvolved" imagen conserva sólo la localización espacial de los ácidos nucleicos y, por tanto, la nuclear puede ser extraído fácilmente. Dado que las células epiteliales son también ricos en ARN, sus citoplasmas también conservar algunos (aunque menos intensa), la tinción de hematoxilina y, por tanto, todo el compartimiento epitelial también puede ser aislado por la intensidad óptica thresholding (segmentado, por lo tanto, del tejido conectivo subyacente y el vacío lumen).

La partición territorial (paso 2) divide el compartimento epitelial en exclusiva "zonas de influencia" o "cuencas hidrográficas" a cada núcleo familiar (por lo que cada área está asociada con un solo núcleo) a través de un proceso de imagen denominado cálculo de la cuenca La transformación [13]. Estas áreas representan, en teoría, el perfil individual de células epiteliales medida y se basan en los lugares nucleares y se conocen como 'células' en el resto de este documento. Aquellos píxeles que no se pueden asignar a una única cuenca de captación se llaman "líneas de las cuencas hidrográficas", y representan los límites entre las células.

Figura 1 se presentan los pasos más relevantes en la secuencia de procedimientos que conduzcan a la propuesta de la segmentación de imagen. Figura 1a es la imagen original mientras 1b muestra la densidad óptica de la contribución Haematoxylin mancha de color por sí solo después de deconvolución. En la Figura 1c se muestra el compartimiento epitelial de 1b histograma obtenido por la igualación, binario thresholding, orificio de llenado y de limpieza de imagen (supresión de todos los objetos thresholded excepto el más grande). 1d Frame es un suavizado de la versión 1b después de los 4 pases de un filtro de promedio de tamaño del núcleo 5 píxeles para conservar únicamente a gran escala características de los núcleos. 1e imagen muestra la localización nuclear por la extracción de los llamados "morfológicos cuencas" (o domos, dependiendo si son brillantes u oscuros). Estas cuencas están conectadas regiones en la imagen de un elegido "a fondo" en función de la escala de grises, medida a partir de sus más profundas (más oscuro) parte hacia arriba, (o viceversa para domos). Este procedimiento lleva la imagen oscura zonas con diferentes densidades ópticas a cerca de la igualdad de niveles (tome en cuenta que no en todos los núcleos 1b no son igualmente oscuro). En la figura se muestran los 1f cuencas de captación (teórico perfiles de células) después de la aplicación de la cuenca 1e transformar a la imagen (utilizando la cuenca plugin escrito por D. Sage disponibles en http://bigwww.epfl.ch/sage/soft/watershed/] . Imagen 1f (la media de los negativos de 1e y 1f) muestra que cada "morfológicos cuenca" determina una "cuenca de captación". 1h imagen es la lógica y el funcionamiento de 1a a 1f y visualizar el resultado de la segmentación. 1i imagen muestra las distintas capas del tejido etiquetados como RGB trillizos intensidad en función de su distancia de 3 diferentes referencias (capa basal (rojo), la capa superficial (verde) y dos capas (azul)).

La Figura 2 muestra los perfiles de revestimiento epitelial y de los correspondientes conjuntos segmentados.

Capa nivel de estimación

Después de la partición, la capa de nivel de cada célula se determinó con una distancia transformar método adecuado para no regular rejas [6, 7], donde la distancia (en capas) se puede calcular desde cualquier punto de referencia arbitrario. Aquí, el tejido conectivo subyacente se utilizó como referencia, por lo que la primera corresponde a la capa de células basales, la segunda capa a la capa parabasal y así para el resto de epitelio (es decir, "contar" a partir de la capa basal de la capa superficial) .

El análisis morfométrico

Un total de 27 parámetros morfológicos (11 nativas y 16 geométricas medidas derivadas de diversas combinaciones) se extrajeron de las células (que figuran en el cuadro 1]. Entre estos parámetros, el más largo del eje de la célula (llamado Féret diámetro) y su ángulo de orientación se extrajeron. Este ángulo es relativo a la medición de sistema de coordenadas (es decir, el ángulo es útil cuando se considera en relación con una referencia fija). Sin embargo, debido a las coordenadas de referencia en una imagen con respecto a los tejidos es un tanto arbitraria, una referencia interna en relación con el tejido se calculó la siguiente dirección de la capa de células en las que se encuentra la célula. De lo contrario, ondulado rete cordilleras y el posicionamiento de la muestra en la imagen hará mediciones de la orientación de sentido (que dependerá de la orientación de especímenes). La capa de la orientación local de referencia se calcula para cada celda en función de la dirección de su vecino más cercano dentro de la capa de células (la dirección del grupo de células que incluyen la actual célula de que se trate, sus vecinos más cercanos y los próximos a los vecinos más cercanos) . El ángulo de la máxima Féret diámetro de la célula en cuestión fue luego compensar a la orientación local de la capa. Todos los detalles de esta técnica con ejemplos han sido publicados en otra parte [6].

ImageJ plugins para desempeñar algunas de las medidas que se describen (análisis morfométricos, morfológicos cúpula de la extracción de color y deconvolución) están actualmente disponibles en: http://www.dentistry.bham.ac.uk/landinig/software/software.html.

El análisis estadístico de los datos se realizó mediante el SPSS versión 10 (SPSS Inc, Chicago, EE.UU.). Porque existe la posibilidad de correlación entre los parámetros (especialmente los que se derivan de las combinaciones de las nativas), de paso se realizaron análisis discriminante. Este tipo de análisis de los parámetros de los descartes que no mejoran las tasas de la clasificación (probablemente se correlaciona con otros parámetros). Al comparar los grupos, diferencias estadísticas con una probabilidad de valor inferior a 0,05 se consideró significativo.

Resultados

De las 150 imágenes, un total de 12853 celdas solitarias keratocyst, 7238 BCNS keratocysts células y 7715 quiste radicular células fueron segmentados (total 27.806).

Cell-sabia comparaciones

Un Modelo Lineal General Multivariante análisis reveló que los valores medios de los parámetros morfológicos fueron estadísticamente diferentes al considerar el tipo de quiste como un factor (p <0,001). Pairwise post-hoc de Tukey de comparaciones con los ensayos (revelar cualquier subconjuntos homogéneos) reveló que la media De la gran mayoría de los parámetros fueron estadísticamente diferentes (que se muestra en el Cuadro 2].

Un análisis discriminante por pasos jerárquica utilizando todos los parámetros morfológicos de células (sin tener en cuenta la posición de la capa de células en el epitelio) reveló que el 42% de las células podría ser clasificados correctamente en sus clases originales (solitario OK, OK síndrome radicular o quiste). Esta tasa es superior a la de asignación aleatoria (33%). Sin embargo, la tasa de clasificación entre los dos subtipos de OKs fue sólo del 53% y entre el grupo de OKs radicular y quistes fue del 66% (asignación aleatoria = 50%).

Inicialmente, esto parece indicar que hay poca o ninguna información proporcionada efectos de la discriminación por el análisis morfológico. Sin embargo, es posible que la posición (de arquitectura), la información asociada al puesto de manifiesto aún más las diferencias morfológicas. Para investigar esta posibilidad, el análisis se repitió, pero considerando cada capa del epitelio, como grupo, para permitir que la capa de sabios comparaciones entre las 3 clases (que se describe en la sección siguiente).

Capa-sabia comparaciones

La media del número de capas de casos y sabio fue de 8,5 ± 1,7, 7,8 ± 3,1 y 11,4 ± 5,3 para el solitario OKs, síndrome radicular OKs y quistes, respectivamente; ANOVA mostró que estas diferencias no fueron estadísticamente significativas. Sin embargo, se encontraron diferencias significativas entre el grupo de OKs (agrupados media 8,2 ± 2,3) y quistes radicular (p = 0.024). La variabilidad del número de capas en estos dos grupos también fue estadísticamente significativa por lo que el quiste radicular imágenes son más variables en el número de capas de la OKs imágenes (prueba de Levene de homogeneidad de diferencias, p = 0,032).

La capa-sabia de las tasas de clasificación correcta de las células sobre la base de los descriptores morfológicos se muestran en la Figura 3. Estas tasas son ligeramente mejorado, sobre todo para los OKs vs radicular quistes. La distribución de los ángulos de la celda eje mayor longitud (Féret) por capa también proporcionó una ilustración precisa de las diferentes arquitecturas entre los OKs quistes y la radicular. La figura 4 muestra que estos ángulos tienden para acercarse a un ortogonales dirección en las dos primeras capas y desaparecen en las capas superiores. Tradicionalmente, esto se conoce como palisading de células de la capa de células basales (capa 1 de aquí) y es característica de OKs, sin embargo esta característica no se da en los quistes radiculares.

Ejemplo de caso-y sabia comparaciones

Ejemplos de los tipos de discriminación-sabia También se investigó sobre la base de la media de los valores morfológicos por muestra. El corregir la discriminación en 3 clases a través de las 150 muestras fue del 66% (cross-validada valores fueron 59, 60 y 82% para el solitario OK, OK y el síndrome de quistes radicular, respectivamente). Estas cifras demuestran que las diferencias entre los 2 subtipos de OK, aunque estadísticamente significativo, no eran suficientes para la clasificación, sin embargo, cuando los dos subtipos OK se agruparon, la tasa de clasificación correcta se aumentó a 95%.

Estudios de casos y sabia, de los 30 casos (con 5 imágenes por caso), sólo 1 caso de quiste radicular había una mayoría de las imágenes erróneamente clasificados como OK, correspondiente a una tasa de error del 3,3%.

Discusión

A pesar de las diferencias histológicas entre radicular y OKs suelen ser suficientes para permitir histopathologists para llegar a un diagnóstico definitivo, las diferencias entre los subtipos OK sigue siendo un tema no resuelto. Por esta razón, el propósito de este trabajo estuvo dirigido a cuantificar el histomorfológico de las diferencias en la arquitectura de revestimiento epitelial en todo el quiste tipos y para determinar el poder de la discriminación (en su caso) que se puede lograr utilizando esos marcadores cuantitativos.

En el presente estudio se encontró que hubo diferencias estadísticamente significativas en la arquitectura de OKs epitelial radicular y quistes y entre los subtipos de OKs. Radicular quistes tienen en promedio más capas y su número varía en más de OKs. Además, la tasa de discriminación alcanzado entre OKs radicular y muestras de los quistes (95%) resultó ser mayor que el de otros informes publicados anteriormente [3]. Al mismo tiempo, las tasas para la discriminación entre las dos subtipos OKs, no fueron tan altos (en torno al 60%), lo que las hace no aptas para la detección de un caso BCNS basa en la arquitectura de quistes epiteliales solo. Esto plantea una pregunta interesante sobre la posibilidad de diagnosticar BCNS casos a la luz de otros datos publicados. Por ejemplo, Günhan et al [3] en comparación nuclear forma, el tamaño y el ADN nuclear contenido de los núcleos de OKs (sin tener en cuenta si eran o solitario BCNS quistes) frente a otros quistes odontogénicos (radicular y dentígero) e informó diferencias estadísticamente significativas en la Basales y de células intermediario. Un análisis más profundo de la geometría nuclear de la incomunicación y BCNS OKs fue realizada por Giardina et al. [2], quienes indicaron que la forma nuclear características (tamaño, pero no nuclear) puede ser de valor diagnóstico (los tipos de discriminación, sin embargo, no se informó). Otro estudio de 328 quistes (sitio emparejados) encontró que una serie de características histológicas (es decir, el número de quistes por satélite, proliferaciones epiteliales sólido, ameloblastoma-como proliferaciones y odontogénico descansa) fueron más frecuentes en el síndrome de los casos [10]. Estas características son indicativas de las tasas de aumento de la proliferación de las células que más tarde se confirmó por el uso de los cargos de Ki-67 positivos células [5]. Sin embargo, parece que todas las diferencias estadísticas se informó útil para diferenciar entre la población, pero no garantiza un clasificador de observaciones individuales (obviamente se trata de dos problemas diferentes).

Una posible explicación de la falta de marcadores morfológicos definitivo para BCNS OKs puede referirse a su etiología: se ha observado que anomalías genéticas (mutaciones y la pérdida de heterozigosidad) comunes de los genes supresores de tumores, incluyendo la drosófila-gen homólogo actualizados (PTCH) Asociados a la BCNS (así como algunos otros tumores epiteliales, como los carcinomas de células basales). Estas anomalías suelen ser también presente en los dos subtipos de OKs [1, 8] y parece ser esencial para la formación de la lesión. Por lo tanto, es posible que el síndrome de la incomunicación y OKs son sólo dos aspectos de un único mecanismo que actúan en diferentes niveles. Las diferencias observadas entre OKs puede deberse al grado y tipo de anomalía genética (varias mutaciones se había informado anteriormente [1, 8]] en lugar de ser dos entidades morfológicas. Esto puede eventualmente ser aclarados por el análisis genético de las células no quística en pacientes con OKs solitario. Una posibilidad es que mientras que los pacientes han generalizado BCNS anomalías genéticas de los genes en todo el PTC tejidos (por lo tanto, las múltiples afecciones del síndrome), la solitaria pacientes pueden tener anomalías similares distribuidos en una escala mucho menor (de manera similar a la de células se encuentran en las pautas de distribución desequilibrada Mosaicos genéticos y chimaeras [4]], o incluso limitada a solo clonal líneas acogida mutaciones que se produjo con retraso en el desarrollo. La identificación de los tejidos que se ven afectados por las anomalías genéticas, y en qué grado, puede proporcionar una mayor comprensión de la enfermedad en desarrollo no síndrome de los pacientes.

A pesar del gran número de células analizadas en este trabajo (27806), un número limitado de casos fueron estudiados. El análisis de las muestras más, incluyendo otros tipos de quistes, y que es más importante OKs secundaria con infiltración inflamatoria, puede aclarar en qué medida la discriminación se mantienen las tasas (ya que es un hecho bien establecido que en segundo lugar inflamado OKs pierden su característico revestimiento y puede parecerse Otros quistes inflamatorios).

Finalmente, la caracterización adecuada de la mucosa en lesiones quísticas también puede ayudar a entender mejor su crecimiento. Es sólo recientemente que el comportamiento de los quistes epiteliales ha sido matemáticamente el modelo [14]. Obviamente estos modelos son abstracciones de los procesos naturales que se basan en la caracterización cuantitativa de las características que, a su vez, se traducen en constantes numéricas utilizadas por el modelo. Precisa información cuantitativa como la que aquí se presenta es probable que esos modelos sean más precisos en términos de resultados de predicción y la validación.

Conclusión

Las medidas de la arquitectura del epitelio presentan pueden cuantificar de forma imparcial las características morfológicas de quistes epiteliales forros. Estas medidas proporcionan un extra de nivel jerárquico descripción de los tejidos que conforman la morfología de células individuales por sí sola no puede proporcionar. Tal enfoque analítico permite un alto (caso de sabios corregir el 97%) y la discriminación entre radicular odontogénico keratocyst forros. Sin embargo las diferencias entre solitario y sindrómico keratocysts no permiten el síndrome de la discriminación basada únicamente en la apariencia histológica de los tejidos.

Lista de abreviaturas

ANOVA: análisis de la varianza

BCNS: el síndrome de nevus basocelular

H & E: hematoxilina y eosina

OK: odontogénico keratocyst

PTCH: parcheado (gen)

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.