BMC Infectious Diseases, 2006; 6: 23-23 (más artículos en esta revista)

La detección de Chlamydia en la sangre periférica de células normales de los donantes mediante cultivo in vitro, inmunofluorescencia microscopía y técnicas de citometría de flujo

BioMed Central
Frances Cirino (fcirino@microbio.umass.edu) [1], Wilmore C Webley (wilmore@microbio.umass.edu) [1], Corrie Oeste (esstuart@microbio.umass.edu) [1], Nancy L Croteau ( Nancy.Croteau @ umassmed.edu), Chester Andrzejewski (chester.andrzejewski @ bhs.org) [2], S Elizabeth Stuart (esstuart@microbio.umass.edu) [1]
[1] Department of Microbiology, University of Massachusetts, Amherst Massachusetts, 01003, USA
[2] Department of Transfusion Medicine Baystate Medical Center, Springfield, Massachusetts, 01199, USA

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Resumen
Antecedentes

Chlamydia trachomatis (Ct) y Chlamydia pneumoniae (Cp) son médicamente importantes agentes infecciosos asociados a diversas patologías crónicas humanos. Sin embargo, funciones específicas en la progresión de la enfermedad o de iniciación se define incompleta. Ambos patógenos infectar establecido líneas celulares in vitro y la reacción en cadena de polimerasa (PCR) ha detectado Chlamydia ADN en diversas clínicas, así como en condiciones normales de los donantes monocitos de sangre periférica (PBMC). Sin embargo, la infección por Chlamydia sangre de otros tipos de células, la cuantificación de las células infectadas por Chlamydia en la sangre periférica y la transmisión de esta infección in vitro no han sido examinados.

Métodos

Cp títulos específicos fueron evaluados por 459 sueros de donantes de sangre humana normal (NBD) muestras. Aislado glóbulos blancos (WBC) se analizaron por cultivo in vitro para evaluar la transmisión de la infección de células de la sangre a cargo chlamydiae. Frotis de sangre fresca muestras (FP) fueron doble immunostained microscópico para la identificación de Chlamydia tipos de células infectadas y alícuotas también evaluó a través de Citometría de Flujo (CF).

Resultados

ELISA demostró que 219 (47,7%) NBD muestras de la elevada exposición anti-Cp los títulos de anticuerpos. Imunofluorescence microscopía de frotis demostrado 113 (24,6%) de muestras con intracelulares Chlamydia y anticuerpos monoclonales específicos para CD marcadores mostró que la infección in vivo de los neutrófilos y eosinófilos / basophil células, así como los monocitos se produce. Cultivo in vitro establecido glóbulos blancos de 114 (24,8%) De la NBD albergaba muestras infecciosas chlamydiae, clínicamente una posible fuente de transmisión, FC demostrado tanto Chlamydia células infectadas y no infectadas pueden ser fácilmente identificados y cuantificados.

Conclusión

NBD infectados pueden albergar neutrófilos, eosinófilos y monocitos y basófilos. El chlamydiae son infecciosas in vitro, y el total de ambas, y el tipo de células específicas Chlamydia transporte es cuantificable por FC.

Antecedentes

Clamidias, patógenos bacterianos intracelulares obligados, causa una serie de médicos y de las enfermedades infecciosas de importancia económica. Chlamydia trachomatis (Ct), la causa más común de enfermedad bacteriana de transmisión sexual, también es el líder mundial en la causa de ceguera infecciosa [1]. Chlamydophila pneumoniae ( Cp) es un patógeno ubicuo respiratorias responsables de la sinusitis, bronquitis, y el 10-15% de los casos de neumonía adquirida en la comunidad en todo el mundo [2]. A la edad de 20, ~ 50% de la población presenta evidencia de infección pasado por el C. Pneumoniae y la re-infección es común en toda la vida [3]. Cp ha atraído cada vez más interés debido a que está asociada a una variedad de enfermedades humanas crónicas que no se limitan a las mucosas. C. Pneumoniae ha sido implicado en el pathobiology de la aterosclerosis [4 - 7] esclerosis múltiple [8, 9], la enfermedad de Alzheimer (AD) [10], la artritis reactiva [11], y el asma [12].

Aunque C. Pneumoniae ha sido implicado como un factor en esta variada gama de enfermedades crónicas humanos, que aún se desconoce si es el agente causal o es simplemente importante en el agravamiento de estas patologías. Por PCR, la prueba de estos organismos se ha encontrado en las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de los donantes de sangre sanos y en pacientes con enfermedad arterial coronaria [13 - 16]. Sin embargo, las pruebas de infecciosidad organismo de información y se esbozan los anfitriones dentro de la propagación del organismo, ya sea desde un sitio de la infección inicial en el pulmón o el tracto genital de una amplia difusión a los sitios donde se produce la patología está aún por determinar. Utilizando un modelo de conejo, y el cultivo de células, los estudios han demostrado que los macrófagos alveolares servir como anfitrión de las células Cp [17], el transporte a través de la barrera de la mucosa al sistema linfático, entonces más allá de a la circulación sistémica [18]. Chlamydia macrófagos infectados se han Se encontraron en las placas de ateroma [19], y estudios recientes han revelado que, in vitro Cp pueden infectar a humanos granulocitos neutrófilos y, a continuación, iniciar los retrasos en su apoptosis espontánea [20]. Se han presentado pruebas de que in vitro Cp B, y pueden infectar a los linfocitos T líneas de células humanas, así como células mononucleares de sangre periférica y de inducir una respuesta de citoquinas [21, 22]. Como se ha demostrado por PCR, Ct difunde también en el de acogida tras la infección del tracto genital experimental en un modelo murino, pero los mecanismos involucrados aún no han sido plenamente aclarado [23 - 29].

Hemos iniciado un estudio de viabilidad, infecciosas Chlamydia transporte en las células sanguíneas. El actual estudio se dirigió a evaluar la prevalencia de infección por Chlamydia en muestras de una normal del Donante de Sangre (NBD) de población, así como la identificación de los diferentes tipos de glóbulos blancos que albergan este agente patógeno in vivo y cuantificar su número por citometría de flujo. Los resultados de nuestro estudio aleatorio examen de una cohorte de 459 muestras de donantes normales indica que (i) el promedio de transmisión hemática frecuencia de portadores de Chlamydia para esta cohorte es del 24,6%, (ii) Chlamydia puede estar presente en la sangre periférica NBD granulocítica neutrófilos y eosinófilos / basophil Células, así como los monocitos, chlamydiae (iii) en el 24,8% de la WBC NBD periféricas son infecciosas como se ha demostrado por cultivo in vitro y (iv) FC puede cuantificar tanto la carga total de células infectadas (ICL) y de células infectadas tipo específico de carga (ICSL) En la población periférica WBC.

Métodos
Recogida de muestras

La aprobación para el uso de material residual de forma rutinaria recogido muestras de sangre periférica de donadores de sangre sanos normales se obtuvo de la Junta de Revisión Institucional en el Baystate Medical Center. De-identificado NBD residuos recogidos en ethylenediaminetetraacetic ácido (EDTA) tubos se obtuvieron del Banco de Sangre en el Centro Médico Baystate de Springfield, MA entre noviembre de 2001 y octubre de 2002. Se obtuvieron muestras mensuales y almacenarse a 4 ° C hasta el momento de la prueba. Para otras evaluaciones, de-muestra de sangre fresca identificado residuos (FP), recogidos en tubos de EDTA, se obtuvieron sobre una base semanal de los pacientes vistos en la Universidad de Servicios de Salud (CHU) y se utiliza inmediatamente. Salvo indicación en contrario, conjugado secundaria de anticuerpos reactivos se obtuvieron de Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove PA, el nivel de incubación fue de 1 h a temperatura ambiente (RT) a menos que se especifique.

C. pneumoniae específicos péptido ELISA

A 14 aminoácidos C. Pneumoniae específicas derivadas de la secuencia peptídica el gen que codifica la principal proteína de membrana externa de C. porin Pneumoniae AR 39 [30] fue sintetizado (Sigma Genosys, The Woodlands, TX). Sirvió en el antígeno para pruebas de ELISA C. Pneumoniae NBD de anticuerpos específicos en las muestras de plasma. ELISA pozos (NUNC ™, Nunc A / S, Roskilde, Dinamarca) fueron recubiertos por 1 h con 100 ul contiene 1 μ g / ml péptido en buffer fosfato salino pH 7.2 (PBS). Plasma muestras fueron diluidas en serie ELISA pozos utilizando el 0,1% de BSA en PBS y protocolos estándar de bloqueo (3% de albúmina sérica bovina: BSA, Sigma, St Louis, MO), incubaciones, y se lava (X3 con 0,1% de BSA / PBS) . La detección de anticuerpos humanos vinculados utilizado la fosfatasa alcalina (AP)-cabra conjugado IgG anti-humano y después de 45 min de incubación y múltiples enjuagues, 100 μ l / así de P-Nitrophenyl sustrato fosfato (pNPP, Sigma, St Louis, MO) se añadió . Absorbancias a 405 nm se midió con un lector de microplacas VERSAmax (Molecular Devices Sunny Vale, CA). Títulos fueron determinados por comparación de las lecturas de absorbancia conocida controles positivos y negativos con las de las muestras de ensayo.

Immunostain normal de la sangre de donantes frotis

~ Frotis preparado con 20 μ l / diapositivas de sangre total recogida en EDTA se seca el aire, donde se fijarán 10 minutos en el 70% de metanol frío (MEOH). Tras PBS enjuagues, diapositivas fueron incubadas en cámara húmeda con un conejo o cuy anti-Chlamydia EB suero (Biomeda Corp Foster City, CA) luego multiplica lavarse con PBS. Encuadernación de anticuerpos anti-Chlamydia se detectó con fluoresein isothiocynate (FITC)-conjugado de cabra anti-conejo o burro anti-cobaya IgG. Primaria y secundaria de anticuerpos incubaciones utiliza el protocolo estándar se ha señalado anteriormente. Después de lavado PBS X3, coverslips fueron montadas usando Fluoromount G (BioWhittaker, Walkersville, MD), selladas, y luego examinó y fotografió utilizando una Nikon Eclipse E600 epifluorescence SPOT microscopio y una cámara digital (Digital Instruments Inc) o un Zeiss LSM 510 Meta confocal Sistema

Cultura de la normal de las muestras de donantes de sangre

La capa leucocitaria (BC), que contiene WBC, se retiró de cada 5 ml NBD muestra, enjuagados X4 con PBS estéril, tratan de liberar EBs y cultivadas sobre monocapas J774A.1 como se describe anteriormente [30]. A las 96 h post infección (pi) sobre monocapas coverslips fueron lavadas con PBS, el 70% fijo con MEOH, immunostained y enjuagarse de nuevo con un conejo anti-Chlamydia EB, y luego montadas como se señaló anteriormente.

La detección de Chlamydia infectados Monocyte, Eosinophil / Basophil y neutrófilos

Frotis de BC "pellets" de cada celda de 5 ml de sangre fresca de las muestras (FP), el promedio de edad del donante de 28 años, se fija con un 70% MEOH. Salvo que se especifique lo contrario, inmunoticción utilizado conejo policlonal anti-Chlamydia EB seguido de un anticuerpo conjugado TRITC cabra anti-conejo de anticuerpos. Tipo de células específicas de detección de anticuerpos monoclonales de ratón utilizados: anti-CD14 Humanos (0,2 μ g/10 6 células) (Sigma, Saint Louis, MO), o anti-CD16b Humanos (1,0 μ g/10 6 células) (BD Biosciences Pharmigen, San Diego, CA.). Encuadernación se detectó con FITC-conjugado de cabra anti-ratón IgG. Para muestras incubadas con PE-conjugadas anti-CDw125 Humanos (1,0 μ g/10 6 células), obligado anti-Chlamydia detección de anticuerpos utilizados FITC conjugado de anticuerpos anti-conejo. Las láminas fueron incubadas, enjuagarse, montados y sellados como se ha descrito anteriormente y las imágenes digitales a través de secciones de óptica de estas muestras fueron adquiridas con un Zeiss LSM 510 Meta Sistema confocal.

Citometría de Flujo de evaluación de una serie de dilución WBC

Citometría de flujo (FC) cuantificación de los infectados por Chlamydia sangre periférica WBC utilizado PBS enjuagarse BC células de muestras de frotis positivo NBD. El WBC se fijó piscina y permeabilized (1% paraformaldehído y 1% Tritón X-100, 10 min. En RT; Aldrich Chemical Company, Inc, Milwaukee, WI). PBS enjuagarse eritrocitos de las mismas muestras fueron también agrupados. RBC aC y fueron incubadas por separado con pre-diluidos conejillo de indias anti-Chlamydia anticuerpo primario seguido de incubación con conjugados PE-F (ab ') 2 burro anti-cobaya IgG, PBS enjuagarse X3, y los mono-dispersa usando un filtro de malla de nylon (Lab-Line Instruments Inc, Melrose Park, IL). Una serie de dilución WBC se preparó en tubos separados de la siguiente manera: 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1% , 0,5% y 0%, WBC / tubo. Suficientes eritrocitos fueron agregados para obtener un total de 50000 células / tubo y la serie analizada por FACScan (Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ).

Citometría de Flujo de doble FB glóbulos blancos manchados de monocitos, Eosinophil / Basophil y neutrófilos

BC FB aisladas de muestras se pre-seleccionados para las células infectadas por Chlamydia anti-Chlamydia inmunoticción como se ha descrito anteriormente. BC de cuatro muestras de frotis positivo y por separado, BC de cuatro muestras de frotis negativas se combinaron. Cada grupo fue lavada, permeabilized fija y como se ha descrito anteriormente. Después de contar, alícuotas de las piscinas de células fueron incubadas con el conejillo de indias policlonal anti-Chlamydia primaria de anticuerpos y uno de los tres anticuerpos monoclonales, a las concentraciones que se señaló anteriormente. Para detectar Chlamydia o CD14 y CD16b, BC fueron incubadas con el conjugado PE-F (ab ') 2 burro anti-conejillo de indias y FITC-IgG de conejo conjugado IgG anti-ratón. Chlamydia en BC immunostained con PE-conjugados anti-CDw125, se Detectado conjugado con FITC F (ab ') 2 burro anti-cobaya IgG. Después de incubaciones y lavado estándar, las muestras se dispersa mono-, contó, diluido para obtener 1 × 10 6 células / ml de muestra y analizados utilizando el instrumento FACScan.

Estadísticas

NBD muestra los datos fueron analizados mediante el paquete estadístico SPSS ® 11,5 estadísticas del programa de posgrado pack [SPSS Inc, Chicago, IL]. Las comparaciones de la cultura y de frotis positividad utilizados Cruz-pestañas con la prueba exacta de Fisher para descubrir asociaciones no aleatoria entre estas dos variables categóricas y la prueba de Chi-cuadrado y la medida de acuerdo Kappa para determinar significación. Para verificar la reproducibilidad de la cultura y todas las muestras de frotis cuotas inicialmente fueron probados por duplicado. Posteriormente, aproximadamente el 20% de las muestras fueron de nuevo a prueba por cada método. La SD y la CV se calcularon sobre la base de las diferencias en los porcentajes positivos y negativos determinados por el original frente a la repetición de las pruebas. Todas las pruebas fueron dos caras, y el nivel de significación fue de p ≤ 0,05.

Resultados

Observaciones preliminares de las células en frotis de sangre de donantes normales muestra nuestros residuos y estudios de residuos pediátrica muestra de sangre [30] demostraron que pueden contener las células que fueron infectadas con clamidia. A la pantalla normal de los donantes por Chlamydia transporte que circulan en PBMCs, y para evaluar la infectividad, que utilizó ELISA, inmunofluorescencia microscopía, cultivo in vitro y de citometría de flujo

Presencia de la lucha contra la C. Pneumoniae de anticuerpos en muestras NBD

Al azar una cohorte de donantes de sangre de muestras de residuos se obtuvo de la Unidad de Banco de Sangre del Centro Médico Baystate a lo largo de un período de 12 meses. Donantes demográficos se presentan en la Tabla 1. Como se muestra, la edad media de la cohorte fue de 44 años y consistía de 55% hombres y 45% mujeres donantes. El plasma fue retirado de las muestras, y una alícuota ensayadas por ELISA para anticuerpos anti-C. Pneumoniae anticuerpos. Como muestra el Cuadro 2, 219 (47,7%) de 459 muestras analizadas mostraron una positiva título contra los 14 aminoácidos C. Pneumoniae-péptido específico. Este nivel de sero-positivo es plenamente coherente con los informes publicados por este grupo de edad y se indica esta cohorte no es anómalo en ese sentido.

Microscópico muestra de las células de sangre periférica infectadas por Chlamydia

Las muestras, incluida la sangre, son evaluados sistemáticamente de Chlamydia por PCR y RT-PCR [5, 13 - 15], pero sí PCR no puede demostrar si este representa fragmentos de ADN o viable, organismos infecciosos [13 - 16] y inmunomarcación para detectar infectados es PBMCs No de uso habitual. Este estudio, por tanto, incluido immunofluorescent tinción como se ha descrito anteriormente para identificar Chlamydia NBD células infectadas. Como Figura 1A-C muestra, Chlamydia positivos material puede ser fácilmente detectado-al igual que dentro de los linfocitos y monocitos-como las células y el examen de todas las 459 muestras demostrado 113 (24,6%) fueron positivos para Chlamydia periférica dentro de los glóbulos blancos (Tabla 2]. Los residuos de sangre, normalmente ≥ 30 / mes, se obtuvieron más de un período de 12 meses (Tabla 3] y la comparación por meses indica que las muestras recogidas en diciembre expuesto claramente más elevado de transporte intracelular Chlamydia: 42% con baciloscopia positiva y el 33% positiva cultura. En cambio, para agosto y noviembre de transporte era notablemente inferior. Cultura y frotis positivos resultados para estos dos meses fueron del 15%, 15% y 17%, 12% respectivamente. Estos porcentajes divergentes puede reflejar una variable frecuencia de portadores en la cohorte durante el año transcurrido desde la muestra números de la prueba para cada uno de estos meses fueron similares: 34, 35 y 39, respectivamente.

Demostración in vitro de viable, infecciosas WBC Chlamydia en muestras de sangre periférica

Immunostain antígenos de Chlamydia demostrado su presencia en PBMC. Por lo tanto, evaluamos si la próxima organismos infecciosos de por sí están presentes. Clamidias se sabe que infectan a los macrófagos in vivo [17 - 19] in vitro y la J774A.1 monocapas de macrófagos son infectados fácilmente por Chlamydia y apoyar el crecimiento de ~ 120 h pi. El uso de un eficaz método de cultivo que se han desarrollado y descrito anteriormente [30 - 33], WBC lisados fueron preparados y probados por duplicado en J774A.1 monocapas. A las 96 h pi el monocapas fueron lavadas, fijo, y immunostained para detectar clamidia. Los resultados demostraron que de las 459 muestras, 114 (24,8%) fueron positivos para el crecimiento de Chlamydia (Tabla 2]. La Figura 2 muestra representativa immunostained monocapas incubadas con WBC derivados de inóculo Chlamydia baciloscopia positiva (Figura 2A] o muestras negativas (Figura 2B]. A las 96 h pi las culturas de muestras de frotis positivo contienen grandes, la fase tardía de inclusiones así como de las pequeñas, de reciente formación de inclusiones y puesto en libertad EBs extracelular. El cuadro 2 muestra que de las 459 muestras analizadas 76 fueron positivos por ambas pruebas de frotis y de la cultura. Del total de muestras positivas, 37 fueron positivas, pero por baciloscopia negativa de los organismos cultivables, potencialmente un indicador de la persistencia. A la 38 fueron negativos por baciloscopia positiva y por la cultura; este último hallazgo puede reflejar el pequeño tamaño de la muestra (20 μ l) utilizados en la preparación de frotis. Junto Sin embargo la baciloscopia y cultivo in vitro los resultados demostraron que no sólo las muestras NBD llevar PBMC infectadas por Chlamydia y visualmente identificables mediante microscopía de fluorescencia, pero con frecuencia estos WBC cargo chlamydiae son infecciosas.

Identificación de Chlamydia infectados monocitos, eosinófilos y neutrófilos Basophils y en el frotis

A pesar de la demostración de Chlamydia en PBMC de muestras de ADN, y las manifestaciones que in vitro numerosas líneas de células pueden ser infectados por las distintas especies de Chlamydia y serovares, los tipos específicos de glóbulos blancos infectados in vivo no han sido plenamente examinado. Hemos seleccionado a tres CD WBC marcadores para identificar los tipos y los usó en combinación con anticuerpos anti-Chlamydia a immunostain glóbulos blancos en la sangre periférica muestra de los residuos. Desde WBC exposición intrínsecamente diferentes de vida y puede exponer diferencial fragilidad, estas evaluaciones utilizaron muestra de sangre fresca de residuos. FB frotis de estas muestras se prepararon, fijos y de doble immunostained para detectar clamidia y bien CD14 (monocitos), CDw125 (eosinófilos y basófilos) o CD16b (neutrófilos). El uso de la microscopia confocal Meta, secciones ópticas a través de las células y se examinaron las imágenes digitales adquiridos. La Figura 3 muestra ejemplos representativos de los monocitos infectados por Chlamydia (CD14), eosinófilos / basophil (CDw125) y de neutrófilos (CD16b) células. Estos pueden presentar coloración fluorescente punctata (fila CD125w y CD14), que refleja la desigual distribución de espera antígenos. Esto es especialmente evidente en las células no adheridas y fácilmente detectable en una óptica de la sección a través de una inclusión clamidias. El anti-Chlamydia columna muestra la presencia y distribución de material Chlamydia positiva dentro de la óptica de cada sección, mientras que el CD marcador columna identifica el tipo de células marcador específico. El color amarillo o naranja / amarillo demuestra la fusión de co-localización de la immunoprobes en esa misma óptica de la sección. La última columna muestra el DIC imágenes y muestra la posición y la morfología general de las celdas individuales. Una comparación de la DIC y la fusión de imágenes de la misma fila muestra adicional de las células puede estar presente que no son immunostained por cualquiera de anticuerpos (Figura 3-CD14 y CDw125). Esta observación sirve para indicar la especificidad de la immunoprobes. La figura 4 presenta fusionado imágenes obtenidas en tres niveles diferentes de la misma Z-eje óptico de las secciones a través de las células se muestra en la Figura 3. Como la óptica de las secciones en el CD16b serie presenta, el co-CD16b proteína se asocia con la clamidias antígenos (6 μ), pero también está presente en la superficie celular (10 μ).

Citometría de Flujo de serie diluido capa leucocitaria piscina

Inmunofluorescencia permite la detección de antígenos por clamidias microscopía de frotis, pero son intrínsecamente susceptibles a la gran error de muestreo. Asimismo, no puede apoyar la cuantificación del total el número de células infectadas por Chlamydia en muestras de sangre periférica. Por lo tanto, utilizados para cuantificar FC potencialmente 'pegajoso' Chlamydia BC muestras infectadas. Después de la puesta en común WBC pre-seleccionadas por immunostain para intracelulares Chlamydia, una serie de dilución se preparó y FACScan cuotas para cada dilución analizados (Figura 5]. Los datos que muestra la serie es lineal en un amplio rango de número de células infectadas, y que las diferencias numéricas entre las diluciones de la serie son fácilmente evidentes. Como muestra la Figura 5 también, incluso en la mayoría de diluir la muestra que contiene sólo el 0,5% WBC, 3 ± 1,5 células por encima de Chlamydia positivos antecedentes fueron detectables en la muestra de células 10000. Además de la utilidad de la FC para la detección de clamidia en muestras periféricas WBC, la serie también sirve como un control para su posterior FC dirigido a la cuantificación de los tipos específicos WBC infectadas por Chlamydia in vivo.

Presencia de Chlamydia en monocitos, eosinófilos y neutrófilos y Basophils detectado por Citometría de Flujo

Dada la linealidad y la sensibilidad demostrada, de doble canal FC utilizado como una vía rápida, sensible herramienta para cuantificar la carga de células infectadas (ICL) y la WBC tipos específicos de infección in vivo. Usando muestras de sangre fresca, dos piscinas WBC se prepararon y immunostained. Una piscina que figura WBC positivo de las muestras de frotis de sangre anti-Chlamydia immunostain examen. El segundo grupo, denominado débilmente positivo, fue preparado a partir de las muestras negativas por Chlamydia immunostain pero positivo por FC evaluación inicial. Alícuotas de AC también se immunostained con un solo de anticuerpos y se utiliza para establecer la correspondiente indemnización señal de superposición entre los dos canales de fluorescencia y de medidas apropiadas, conservador demarcaciones de fluorescencia positiva.

WBC poblaciones periféricas contienen neutrófilos (CD16b), monocitos (CD14) y de eosinófilos y basófilos (CDw125) normalmente presente en niveles de 60-70%, 3-8% y 1-4%, respectivamente. Alícuotas de cada piscina se WBC doble immunostained con anticuerpos anti-Chlamydia y el anticuerpo monoclonal específico para CD16b, CD14, o CDw125 como se ha descrito anteriormente. Los dos canales de datos FC (Figura 6] indican que en la población de 10000 células contados débilmente positivo de la piscina, el 10,4% fueron positivos para ambos Chlamydia y el recuento de neutrófilos marcador, CD16b, mientras que en la piscina positiva del 7,4% exhibió la doble fluorescencia positiva. En particular, el punto parcela de la piscina positivo también contiene una clara distribución ( 'nube'), de mentir células CD16b algo por encima de la línea de demarcación que está claramente ausente de la trama punto débilmente positivo de la muestra. En esta "nube" región, numerosas células en la muestra positiva exhiben un nivel más bajo de CD16b expresión, como lo indica su ubicación en relación con la línea de demarcación CD16b positivas. Este bajo nivel de expresión CD16b sería coherente con las células inmaduras que se neutrófilos. Doble inmunomarcación positiva de Chlamydia-monocitos (CD14) demostró que en la piscina débilmente positivo, el 2,3% de los 10000 células positivas fue doble, mientras que en la piscina positivo, el 4,1% de las células, de casi el doble, es doble positivo. Por último, en alícuotas immunostained para detectar Chlamydia infectados de eosinófilos y basófilos (CDw125), la doble positivos se identificaron en el 1,9% de las células (débilmente muestra positiva) y el 5,4% (muestra positiva), más del doble del número de células.

Este cuantitativos de doble canal FC indica que los datos in vivo de estos tres tipos de células pueden infectarse, y es coherente con nuestra identificación en el doble immunostained frotis. Los datos también muestran FC puede cuantificar cada tipo de células y que tanto el punto parcela pautas y tipo de células específicas se diferencian claramente de los números de la débilmente positivo vs muestras positivas. Por lo tanto, incluso en el nivel mínimo de células infectadas por Chlamydia transporte en estas muestras, de cada tipo de células infectadas in vivo, y tanto la carga total de células infectadas (ICL) y la célula infectada tipo específico de carga (ICSL) se puede cuantificar.

Discusión

Los estudios presentados aquí examinado la sangre residuos obtenidos a lo largo del año y ofrecer una evaluación de los glóbulos cargo Chlamydia transporte en forma aleatoria cohorte de donantes de sangre normal. Los objetivos fueron determinar el tipo medio de transporte, identificar los principales tipos de células infectadas in vivo, Chlamydia probar si las células infectadas pueden transmitir la infección a la célula huésped monomoleculares, y evaluar la cuantificación de la célula infectada carga de las muestras mediante citometría de flujo utilizando.

Nuestros resultados serológicos demostrado que en esta población de donantes, el 47,7% era sero-positivos para C. Pneumoniae. Dada la edad media de 44 años, este hallazgo es consistente con el informe del CDC evidencia serológica de una infección previa por C. Pneumoniae a la edad de 20 (50%) [3], y demuestra esta cohorte de donantes no es anómala con respecto a la sero-positividad. Nuestras evaluaciones también mostraron una tasa de transmisión hemática transporte de las células infectadas por Chlamydia 24,6% de positivos. Sin embargo, algunos notables se observaron diferencias en la tasa de infectados por Chlamydia WBC, dependiendo de la época del año (Tabla 3]. Aunque sólo un estudio multianual puede verificar la variación estacional, nuestro hallazgo sugiere que la temporada de la recogida podría ser un factor en la detección del ADN de Chlamydia tasas del 18,5% al 46,15% informado por otros para PBMC. PCR Estos estudios no han probado de forma concomitante organismos infecciosos, ni es la época del año conocido [15, 34 - 37]. No obstante, en vista de los informes publicados, la frecuencia de portadores se observó no fue sorprendente, aunque la detección inicial de transmisión hemática Chlamydia transporte en immunofluorescent manchadas de sangre frotis fue inesperada. Además, también hemos probado WBC de estas muestras de organismos infecciosos mediante un in vitro de macrófagos monocapa sistema, en lugar de la no-fagocíticas HEp-2 o células HeLa a menudo utilizada por otros. Como se ha informado anteriormente [30], este sistema es fácilmente macrófagos fagocíticas y, por lo tanto se ocupará de los raros clamidias EB de manera más eficiente. Además, utilizando la J774A.1 y IMEMZO monocapas de células, que habitualmente cultivadas a 96 h pi, un marco de tiempo que apoya una nueva infección en el monocapas. Como muestra la figura 2, estas células seguir buscando saludable y la amplificación logrado en 96 h pi permitió la rápida identificación de las muestras con chlamydiae infecciosas. Es importante destacar que, también se puso de manifiesto que la Chlamydia NBD en estas células pueden ser infecciosas (Tabla 2, 24,8%).

La presencia y sobre todo la infecciosidad de la sangre de células chlamydiae cargo es de por sí significativo y potencialmente relevante en contextos médicos tan diversos como el trasplante de órganos y tejidos [38, 39], la medicina de transfusión y bancos de sangre. Como se ha demostrado previamente por PCR [5, 6, 25, 27] y de aquí por inmuno-detección y cultivo in vitro de organismos intracelulares de por sí, un nivel de transporte se produce claramente. La demostración de que estos organismos pueden ser infecciosas de que la eliminación de glóbulos blancos de sangre del Banco, por ejemplo, sería importante y simple pre-leukoreduction de almacenamiento es muy eficaz [32]. Además, siempre que sea posible una evaluación de la infección de células de carga en la sangre periférica de un donante de órganos puede ser de gran importancia para la cirugía de trasplantes.

Nuestros datos también muestran que no todas las muestras positivas para Chlamydia por examen de frotis immunofluorescent fueron positivos para Chlamydia infecciosos por cultivo in vitro (Cuadro 2]. Este resultado puede reflejar la presencia de la persistencia de las células infectadas. In vivo, este agente patógeno puede entrar en una etapa de persistentes, en respuesta a diversos micro-condiciones ambientales. En este estado sería detectado en immunofluorescent frotis teñidos, pero producen pocos o ningún EBs infecciosas. Aunque la reversión de este estado no se ha demostrado directamente in vivo, los estudios han demostrado que in vitro Chlamydia puede volver y dar lugar a EBs infecciosas [40 - 46]. Por el contrario, algunos immunostain negativo muestras fueron positivas por la cultura. Sin embargo, este resultado no es sorprendente, y probablemente refleja el 20 μ l tamaño de la muestra utilizada para la preparación de frotis frente a la mucho más grande BC alícuota (50% del total de BC aislado de un 5 ml de sangre venosa) que se utiliza para replicar los cultivos in vitro.

Recientes experimentos han demostrado in vitro de la infección primaria de neutrófilos humanos por Chlamydia, así como la consecuente demora de la apoptosis espontánea de los neutrófilos infectados, pero no los no infectados [20]. En contraste, el actual estudio trató de determinar transmisión hemática WBC que se habían infectado por Chlamydia in vivo. Ambos microscopio de inmunofluorescencia y citometría de flujo adicional de demostrar infecciosos capababilities stealth para este patógeno. Estos estudios utilizan comercialmente disponible CD anticuerpo monoclonal específico y ambas técnicas demostrado que no contienen muestras clínicas in vivo infectados neutrófilos y eosinófilos / basophil células, así como los monocitos. PCR para la detección de Chlamydia una parte de estas muestras de ADN verificado Chlamydia está presente y en dos casos en los que las especies se utilizaron cebadores específicos, C. Y C. trachomatis Pneumoniae estuvieron presentes en la misma muestra (datos no presentados).

En términos de cuantificación de células infectadas, estudios anteriores habían solicitado FC en diversos contextos relativos a la cuantificación de Chlamydia por ejemplo, EB vinculantes a nivel de acogida líneas celulares in vitro, el establecimiento de Chlamydia sensibilidad a los antibióticos o el examen de la función de receptores de estrógenos en infecciones por Chlamydia [47 - 51] . Sin embargo la cuantificación de WBC periférica infectadas por Chlamydia in vivo no se ha informado, muy probablemente porque el transporte en las células infectadas no clínicos de muestras de sangre ha sido objeto de reconocimiento. El FC cuantificación de los infectados por Chlamydia WBC (Figura 5] demostró tanto la sensibilidad y la linealidad y proporcionó una base para el tipo de células específicas cuantificaciones débilmente positivo y de la comparación de muestras positivas se muestra en la Figura 6. Para los neutrófilos (células CD16b +), el FC datos apoya la sugerencia de que supuestamente inusual número de neutrófilos inmaduros pueden estar presentes como un correlato de glóbulos cargo Chlamydia transporte. FC dot parcelas demostrado también que los patrones de distribución y el número de eosinófilos y monocitos / basophil células son claramente diferentes para estos dos piscinas. A los monocitos (células CD14 +), hubo un total de 149000 vs 60000 células positivas en el frente débilmente positivo de la piscina y detecta el nivel de monocitos Chlamydia positiva fue de 4,1% vs 2,3%, una diferencia de 1,8 veces. Curiosamente, el número total de CDw125 +, eosinófilos y células basophil cells/10000 fue mucho mayor para la muestra positiva, (1360) frente a los débilmente positiva (320), una diferencia de 4,25 veces, como en el porcentaje de cada grupo que se Infectados (5,4% vs.1.9%), una diferencia de 2,8 veces. Después de establecer parámetros para el uso habitual, un siguiente paso lógico sería evaluar WBC de muestras de los pacientes y se centran en las condiciones clínicas en las que una participación Chlamydia se sabe o se sospecha.

Nuestras pruebas de la sangre frotis de los estudios, así como la anterior PCR datos de los demás que se indica Chlamydia ADN transporte en la población normal, subrayar la importancia potencial de estos y otros estudios de cuantificación FC. La demostración de que estos pueden ser infecciosas chlamydiae tiene consecuencias para diagnósticos específicos, así como la atención de la salud en general. Es evidente que incluso los niveles bajos transporte de las células infectadas por Chlamydia pueden ser cuantificados por FC (Figura 5] el apoyo a la determinación de la carga total de células infectadas en la circulación periférica. Además, el FC immunostain doble de datos (Figura 6], muestra que para determinados tipos de células, tanto el total de las poblaciones de células infectadas y son fácilmente cuantificables y, al mismo tiempo. Esta información apoyaría el establecimiento de cada tipo de células específicas de carga y potencialmente identificar cualquier sesgados infectados tipos de células que puedan estar asociados con parámetros tales como los niveles de infectados por Chlamydia WBC transporte o presentaciones clínicas específicas.

La importancia de estos hallazgos y de los patrones de punto parcela aún no se han establecido y se necesitará más amplia basada en las evaluaciones. Sin embargo, FC ya es una herramienta de diagnóstico de rutina empleadas para enumerar los linfocitos T CD4 + y CD34 + y células progenitoras para la detección de antígeno HLA-B27 y la leucemia / linfoma de inmuno-fenotipificación [52]. Así, una vez optimizado para esta aplicación, FC podría ser habitualmente disponibles para proporcionar una no invasiva de los medios de detección y vigilancia de la infección por Chlamydia WBC y puede ser de gran valor diagnóstico y pronóstico, así como una herramienta para el cribado de rutina de evaluación de la salud.

Conclusión

Dentro de la población de donantes de sangre normal de la prueba, existe una frecuencia de portadores de Chlamydia 24,6%, que figura en el recuento de leucocitos de la circulación periférica. Como se ha demostrado por inmunoticción fluorescentes combinados con microscopía confocal y las técnicas de citometría de flujo, este patógeno está presente dentro de los neutrófilos y eosinófilos / basophil células, así como en los monocitos / macrófagos células previamente implicados. Además, el cultivo in vitro demostraron Chlamydia en lisados de estas clínicas periféricas no pueden ser infecciosas WBC y la Chlamydia transmite fácilmente a la célula hospedadora monocapas. Por lo tanto el transporte de Chlamydia en las circulaciones periféricas puedan tener un efecto apreciable en el contexto de la transfusión o de los receptores de trasplante, así como evaluaciones de salud de rutina.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

ESS supervisado FC y NLC, dirigió el diseño y la ejecución de los experimentos y el proyecto manuscrito y las cifras, y preparó la versión final del manuscrito. CMM lleva a cabo la selección y el análisis estadístico de la normalidad de donantes de sangre y las muestras de los ensayos in vitro con aislados BC preparativos para detectar la infecciosidad como parte de su trabajo de doctorado con ESS. CMM también proporcionó capacitación a NLC en la cultura y la infección in vitro de las líneas celulares, la generación de las poblaciones de patógenos, y han contribuido a escribir el manuscrito final.

FC CW y llevó a cabo la citometría de flujo, preparado y immunostained el frotis de sangre periférica de células humanas para identificar los tipos WBC albergar intracelulares Chlamydia y contribuyó a la preparación manuscrito. FC llevó a cabo la microscopía confocal, y la cifra de adquisición de imágenes preparación.

NLC llevó a cabo compañero de estudios in vitro bajo condiciones controladas y presentó pruebas de apoyo a las observaciones de los receptores inicialmente detectada en estudios de células de donantes de las muestras de sangre (manuscrito en preparación).

CA coordinada NBD muestra adquisición, aportó su experiencia en Bancos de Sangre y de las cuestiones relacionadas con inmunológicos, así como la caracterización de muestras de sangre, y proporcionó un asesoramiento valioso manuscrito en preparación.

Historia previa a la publicación

La historia previa a la publicación de este documento puede accederse en:

Agradecimientos

Damos las gracias al personal del Banco de Sangre del Centro en Baystate Medical Center por su ayuda en este estudio. También damos las gracias a Dale A. Callaham y Alenka Lovy-Wheeler de la Central de Microscopía Massachusetts Facilidad para la capacitación y la asistencia con el Sistema Metaconfocal Zeiss. El Servicio de Microscopía cuenta con el apoyo de una donación de la Fundación Nacional para la Ciencia (NSF 8714235 BBS). Este trabajo fue apoyado en parte por un premio de la CVIP Fondo de Desarrollo (ESS), de la Universidad de Massachusetts, Amherst. También damos las gracias al Dr Lisa Minter, Veterinaria y Animales del Departamento de Ciencias de la Universidad de Massachusetts, por su orientación y especialización en estudios de la FACS. Revisión preliminar de PBMC utilizado Pel-Congelación de los reactivos, un regalo de William R. y Lynda R. McDonald, Biotech Inc Origen 1 Inland Farm Drive Windham ME 04062 http://www.thebiotechsource.com.