Journal of Nanobiotechnology, 2006; 4: 2-2 (más artículos en esta revista)

Parvovirus canino-como partículas, una novela nanomaterial tumor de la orientación

BioMed Central
Pratik Singh (prasingh@scripps.edu) [1], Giuseppe Destito (giuseppe@scripps.edu) [1], Anette Schneemann (aschneem@scripps.edu) [1], Marianne Manchester (marim@scripps.edu) [1 ]
[1] Center for Integrative Molecular Biosciences, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA 92037, USA
[2] Department of Cell Biology, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA 92037, USA
[3] Department of Molecular Biology, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA 92037, USA
[4] Dipartimento di Medicina Clínica e Sperimentale, Università degli Studi di Catanzaro Magna Grecia Campus Universitario di Germaneto, Catanzaro, ITALIA

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen

De grupos específicos de las células tumorales es un objetivo importante para el diseño de nanotherapeutics para el tratamiento del cáncer. Recientemente, los virus se han explorado como nano-contenedores específicos para la orientación aplicaciones, sin embargo estos sistemas suelen requerir la modificación de la superficie del virus utilizando medios químicos o genéticos para lograr tumor específicas de la entrega. Curiosamente, existe un subconjunto de los virus con afinidad por los receptores naturales de las células tumorales que podrían ser explotados para aplicaciones de la nanotecnología. Por ejemplo, el parvovirus canino (CPV) utiliza receptores de transferrina (TfRs) por la unión y entrada en la célula canina, así como las células humanas. TfRs están sobre-expresadas por una variedad de células tumorales y son ampliamente siendo investigados por tumor orientada por la entrega de drogas. Hemos estudiado si el tropismo natural de CPV a TfRs podía aprovecharse de orientación células tumorales. Hacia este objetivo, CPV partículas similares al virus (VLP) producidos por expresión de la CPV-VP2 cápside proteínas en un sistema de baculovirus expresión se examinaron para el embargo de las pequeñas moléculas y la entrega a las células tumorales. Modelado estructural sugiere que seis lysines por VP2 subunidad son presumiblemente direccionable para bioconjugation CPV sobre la cápside exterior. Entre 45 y 100 de los posibles 360 lysines / partícula podría ser rutinaria derivatizado con las moléculas de colorante en función de la conjugación condiciones. Dye conjugación demostrado también que el CPV-VLPs podría soportar las condiciones de modificación química de lysines. El apego de los tintes fluorescentes ni alteración de la unión a TfRs ni estar afectado internalización de los 26 nm de tamaño VLPs en varias líneas de células tumorales humanas. CPV-VLP, por lo tanto, presentan características muy favorables para el desarrollo como nuevo nanomaterial tumor de la orientación.

Antecedentes

La quimioterapia convencional para el tratamiento de cáncer es no selectiva y, por lo tanto, asociados con efectos secundarios tóxicos, lo que limita un medicamento del índice terapéutico [1 - 4]. Distribución selectiva de medicamentos es ideal para aumentar beneficio terapéutico, así como reducir la toxicidad sistémica. Recientemente, el desarrollo de nuevos métodos para lograr la orientación específica de tumor ha recibido un importante foco [5, 6]. Estrategias investigado hacia este objetivo incluye "inteligentes" de tejidos específicos, como las partículas de liposomas [7], anticuerpos [8, 9], partículas virales [10 - 12] y dendrimers [13] que se componen de fracciones de orientación y fármacos citotóxicos.

Actualmente virus basados en nanopartículas (VBNPs) están siendo ampliamente investigados por la nanobiotecnología aplicaciones [12, 14]. Muchas partículas virales están en el rango de tamaño nanométrico y son uniformes en tamaño natural, a causa de las limitaciones estructurales de la cápside de reunión. Un número cada vez mayor de las tres dimensiones conocidas por el virus de estructuras atómicas resolución allanó el camino para VBNPs de derivatización con tintes, metales, péptidos, proteínas y pequeñas moléculas y se está estudiando para la generación de nuevos nanomateriales. En la última década varios VBNPs han sido examinados para diversas aplicaciones, tales como plantillas para la síntesis de material, plataformas polivalentes para mostrar, componentes electrónicos, y la orientación de drogas [14 - 19]. Características típicas de una plataforma VBNP calificación incluyen conocimientos acerca de su estructura cristalina, la capacidad para producir en cantidades importantes, la estabilidad en una amplia gama de pH, y la idoneidad para la manipulación genética, así como los productos químicos bioconjugation. Los virus y partículas similares al virus (VLP) que se han desarrollado a favor de las nanotecnologías propósitos incluyen bacteriófagos (M13 y MS2 [16, 20]], la planta de los virus (el virus del mosaico del caupí (CPMV), el garbanzo virus del moteado clorótico (CCMV) y el virus del mosaico del tabaco (TMV) [15, 18, 21, 22]], un insecto virus (el virus de la bandada casa [23]], y de los animales virus (adenovirus, virus polyoma [24, 25]]. Si bien la planta de partículas virales infecciosas se pueden producir en grandes cantidades, lo que genera importantes cantidades de la mayoría de los virus animales en sistemas de cultivos de células no es económico. Sin embargo, la producción de VLPs en cantidades adecuadas se ha logrado por la expresión de la cápside del virus de proteínas heterólogas en sistemas (células de insectos, levaduras, y bacterias). VLPs general, se considera ser estructuralmente idéntica a la nativa y de las partículas de virus que es más importante no son infecciosas. Partículas virales también se están estudiando como tumor agentes de la orientación. Como la mayoría de los establecido VBNPs no tienen ninguna especificidad de las células tumorales y, por tanto, necesidad de ser tanto o genéticamente modificado químicamente con el fin de lograr la ejecución selectiva. Estas estrategias de orientación general no son tan eficientes en comparación con las células del receptor de la orientación natural potencial de un virus.

En este estudio se ha caracterizado parvovirus canino (CPV)-VLP como un posible tumor nanomaterial para fines de orientación. CPV, un patógeno viral de los cánidos (perros) pertenece a la familia parvoviridae [26]. El agente infeccioso es un icosahedral (T = 1), sin envoltura del virus de una sola encapsidating varados ADN de unos 5 kb y muestra un promedio de 26,4 nm de diámetro. El ADN viral codifica tres polipéptidos VP1, VP2 y VP3 que se generan por splicing alternativo del mRNA viral. La estructura cristalina del virión reveló que un pleno (que contienen ADN) cápside está compuesta por 60 subunidades, principalmente de la VP2 subunidades (64 kDa), y algunos VP1 y VP3 subunidades. Si bien vacía capsids contienen principalmente VP2 subunidades junto con una menor cantidad de VP1 subunidades, pero falta VP3 subunidades [26]. Cada subunidad se compone de una central de 'jalea rollo' anti-β-paralelo barril básico elaborar con bucles entre la β-capítulos (Figura 1A] [26]. Generación de CPV-VLP en células de mamíferos e insectos por las células que expresan sólo la VP2 gen que se ha descrito anteriormente [27]. El receptor de transferrina (TfR) en células caninas sirve como un receptor celular para el CPV nativa [28]. Curiosamente, infecciosas CPV También se encontraron partículas de obligar a entrar en las células humanas y de la utilización de TfRs, sin embargo, los pasos subsiguientes en el ciclo de replicación no parece ser el apoyo [28].

Transferrina es una proteína transportadora de hierro circulatorio que está en gran demanda en especial durante el crecimiento y la proliferación celular [29]. Dado que el hierro es también necesario en rápida división de las células cancerosas, una importante upregulation de la expresión del receptor de transferrina es vista en una amplia variedad de células tumorales. De hecho, el análisis de la expresión TfR reveló aproximadamente 10 5 o más receptores por célula en varias líneas celulares de cáncer de mama (incluyendo MDA-MB-231) [30], HeLa (carcinoma de cuello uterino humano) [31], HT-29 (carcinoma de colon humano Células) [32], K562 (erythroleukemia células humanas) [31, 33] y de células tumorales pancreáticas [34], frente a unos pocos o TfR niveles indetectables a menudo en las células normales [35]. Por lo tanto marcado una droga o agente de contraste a la imagen de transferrina específicos para la entrega a las células tumorales surgido como una estrategia prometedora y está siendo ampliamente explorado para la ejecución selectiva de tumor [35, 36]. Así CPV-VLP que se unen a humanos TfRs podrá celebrar una ventaja sobre otros viral nanopartículas de tumor específico de entrega.

En este estudio se ha examinado la idoneidad de CPV-VLPs de tumor de la orientación aplicaciones como modificación química con pequeñas moléculas y la capacidad de entregar esas moléculas de las células del tumor. CPV-VLPs producidos en un sistema de baculovirus expresión se analizó la accesibilidad y la reactividad química de la superficie expuesta cápside lysines de derivatización con las moléculas de tinte fluorescente. Encuadernación y la internalización de tinte derivatizado CPV-VLPs humanos en diversas células tumorales se investigó.

Resultados y discusión

Para la generación de CPV-VLP, un baculovirus recombinante, que expresa la longitud completa CPV-VP2 gen (codificación de 584 aminoácidos) bajo el control del promotor polyhedrin se utilizó para infectar las células de insectos, tal como se describe anteriormente [27]. En este estudio, sin embargo, en lugar de Sf -9 células que utilizan células de insectos T.ni para la producción de VLPs en que se conozcan para mejorar la producción de proteínas. T.ni células infectadas con el baculovirus recombinante fueron recolectadas en diferentes puntos de tiempo (todos los días de entre Uno a cinco días) para optimizar el rendimiento de CPV-VLP. Una duración de la incubación de 72-96 horas después de la infección se consideró óptima para aprovechar al máximo el rendimiento. La VLP los rendimientos oscilaron entre 0,5 a 2 mg / litro de cultivo de células infectadas T.ni. Cosecha de células antes de 48 horas o después de 5 días post-infección VLP reducido el rendimiento a menos del 50% de la cosecha a 3-4 días. Si bien la cosecha temprana sufrido ineficiente de la infección, presumiblemente finales de la cosecha conduce a la lisis celular liberar VLPs que parecen ser vulnerables a la celda-o baculovirus derivados de las proteasas (datos no presentados). Previamente se le indica que, si bien una gran cantidad de CPV-VP2 proteína podría expresarse Sf Sf -9 dentro de las células de insectos, una parte de VP2 no montamos en VLPs [27]. Durante una infección por parvovirus nativo, aproximadamente el 50% de la asamblea capsids se encontraron vacía (no infecciosa) y compuesta principalmente de VP2 subunidades con algunas VP1 subunidades [26]. Dado que la proteína VP2 solos se expresó en el estudio actual, una co-expresión de VP2 y VP1 en el sistema de baculovirus expresión puede mejorar el proceso de montaje y de ese modo mejorar el rendimiento del CPV-VLP. Muy relacionado parvovirus porcino-VLPs parecen reunir más eficientemente que los CPV en el sistema de baculovirus como expresión de sus rendimientos eran sustanciales, de aproximadamente 120 mg / litro de la cultura en un bioreactor [37]. VLPs de polyoma virus [38], virus de la hepatitis B antígeno de superficie [39], el virus de la hepatitis delta [40] y CCMV [41] También se han producido en grandes cantidades en un sistema de expresión de levadura que puede ser útil para la generación de CPV-VLP.

Para evaluar si CPV-VLP puede ser eficiente derivatizado por métodos químicos como se ha realizado durante varios viral nanopartículas [14], la posición de la superficie lysines sobre CPV-VLP fue identificado sobre la base de un modelo estructural de CPV utilizando la distancia radial y disolvente accesibilidad Superficie VIPER parámetros en la base de datos tal como se describe en los métodos. Sobre la base de los análisis, lysines en las posiciones 89 y 312 son muy accesibles, mientras que en las posiciones 163 y 387 son moderadamente accesibles y los que se encuentran en las posiciones 570 y 575 sobre la superficie de partículas son accesibles a menor medida (Figura 1B]. El uso de este modelo, dos (máximo de 6) lysines del vigésimo lysines por VP2 subunidad, o 120 (máximo de 360) lysines por CPV-VLP partículas podrían, teóricamente, se podrá acceder a la superficie para bioconjugation cápside. Sin embargo, la reactividad, se sabe que varían de sus predijo la accesibilidad basada en el ambiente químico de residuos de la lisina en la cápside de superficie [15]. Superficie accesible lysines sobre la cápside y en una sola subunidad de VP2 se representan en un espacio de relleno modelo en la Figura 2. Inmediatamente después de la purificación, el CPV-VLP fueron examinados para la reactividad y la conjugación a la lysines por la exposición a NHS-Oregon Green 488 (OG-488). En la mayoría de los casos, utilizando 100 molares equivalentes de OG-488 moléculas de colorante por VP2 subunidad en la VLP preparación, un promedio de 45 lysines / partícula se abordaron. La exposición a 200 equivalentes molar del colorante por VP2 subunidad dado lugar a un promedio de 100 derivatizado lysines / partícula. Nuevo aumento de los equivalentes de tinte no parece mejorar CPV-VLP etiquetado (datos no presentados). Inicialmente, el virus de etiquetado se llevó a cabo en un buffer fosfato (0,1 M de fosfato de potasio) similar al tinte de derivatización CPMV [15]. El CPV-VLP partículas, aunque estable en buffer fosfato, no podía soportar la presencia de más del 10% DMSO y un tinte, que causó el desmontaje de la VLP en subunidades. En contraste CPMV partículas se sabe que soportar tales etiquetado medio ambiente [15]. Realizando tinte etiquetado de CPV-VLP en PBSE de amortiguación, o en buffer fosfato con 150 mM de cloruro de sodio estabilizado las partículas (datos no presentados).

Para caracterizar el CPV-VLPs de los infectados T.ni cultivo celular, las partículas se centrifuga en un gradiente de 10-40% de sacarosa. La VLP formado dos bandas visibles alrededor de la mitad del tubo (datos no presentados). Una bruma untado banda superior presumiblemente representaban una mezcla de partículas de vacío (que carecen de ácidos nucleicos) y de partículas con cantidades variables de ácidos nucleicos. La banda inferior débil hipótesis de que se componía de partículas con un monto definitivo de azar envasados material celular de ácidos nucleicos. Las proporciones de estas bandas varía mucho en cada preparación. El envasado de los celulares no específicas de ácidos nucleicos en las VLP durante baculovirus expresión ha sido descrito [42]. La VLP bandas untado en el gradiente también sugirió VLP preparación ha envasados cantidades variables de ácidos nucleicos que son mayores las posibilidades de azar ARN celular desde las partículas montamos en el citoplasma (datos no presentados). Gradiente purificada VLP preparación se recolectaron y analizaron por SDS-PAGE para la presencia de la proteína viral y la capa de muestra para evaluar la pureza. El gel reveló una proteína de 62 kDa que corresponde a la conocida peso molecular de la proteína VP2-CPV (Figura 3B], sin evidente impurezas o productos de degradación. La diferencia en el gen VP2 producto a un esperado 64 kDa se presume que se debe la variación en gel de movilidades de las proteínas. Similar a la etiqueta de partículas, CPV-VLP partículas marcadas con el tinte OG-488 cuando separados en el gradiente untado reveló una banda arriba y otra banda sobre el medio de la gradiente, similar a la de un nativo CPV-VLP preparación (Figura 3A izquierda Panel). La banda apareció fluorescente cuando se expone a una fuente de luz UV-(Figura 3A, panel derecho). Dye derivatizado CPV-VLP, cuando se analizaron en SDS-PAGE mostraron una banda fluorescente a la exposición a una fuente de luz UV-que emigraron a 62 kDa. No se observó diferencia en la movilidad de los tintes derivatizado CPV-VP2 subunidades de proteínas en comparación a los nativos de CPV-subunidad de la proteína VP2 en el marco del SDS-PAGE condiciones de utilizarse, como se esperaba, ya que hay un estimado de 1 a 2 moléculas de tinte OG-488 por VP2 subunidad (con incremento aproximado de alrededor de 0,6 a 1,2 kDa; Figura 3B].

El gradiente de sacarosa purificada partículas fueron analizadas por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) para el volumen de elución y absorbancia indicativo del tamaño de la partícula, la condición de intacto y envasado de ácido nucleico material. SEC de un recién purificada VLP preparación reveló que la absorbancia a 260 nm fue alto en comparación a la absorbancia a 280 nm (Figura 4A] sugestivo de los paquetes de los ácidos nucleicos. Con un caudal de 0,4 ml / min en PBSE buffer (pH 7.4), las partículas tenían el volumen de elución de 11-13 ml de la SEC columna. El virus del mosaico del caupí partículas (aproximadamente 31 nm de diámetro) que se utilizan habitualmente nuestro laboratorio mostraron una elución de 8 a 10 ml en PBSE de amortiguación (datos no presentados) en la misma columna sugiere que el CPV-VLP (26 nm de tamaño) Más pequeñas en tamaño y intacto. Desvinculado sin montar o subunidades de proteínas y otros contaminantes mostró elución volúmenes mayores de 15 ml. Sorprendentemente, la contención de ácido nucleico de material dentro de CPV-VLP fue transitoria, como las partículas se encontraron vacía después de uno a dos días de almacenamiento a 4 ° C. Después de una semana de almacenamiento a 4 ° C las partículas exhiben un menor de absorbancia a 260 nm, indicando la falta de material de ácidos nucleicos (Figura 4B]. Presumiblemente el envasado de ácido nucleico se hidrolizada. Encontrar totalmente vacía partículas inmediatamente después de la purificación también fue bastante común. Aunque vacío, el CPV-VLPs resultaron ser bastante estable en PBSE de amortiguación después de varios meses de almacenamiento a 4 ° C, sin mostrar ningún signo de desmontaje. Las partículas de intacto podría ser confirmado más de la SEC y de la columna por el microscopio electrónico de transmisión (TEM) (datos no presentados). Los análisis de las partículas de tinte marcado en la SEC en 496 nm reveló que el tinte moléculas conjugadas están asociados con la intacta VLPs (Figura 4B]. TEM análisis de las VLP purificada apoya la observación de que las partículas no se vacía inicialmente después de la purificación. Figura 4C muestra el CPV-VLP capsids con un electrón-densos básico que indica la presencia de ácido nucleico. En cambio, después de 7 días de almacenamiento de las partículas tienen un electrón-núcleo opaco coherente con capsids vacía (Figura 4D]. Curiosamente, la expresión de proteínas de la capa de ARN virus, FHV capa de proteína [42] o de tomate tupidas dobles de virus [43] en el sistema de baculovirus resultados en VLPs contienen cantidades variables de ARN celular. Sin embargo, esta envasados ARN celular no se pierda tras el almacenamiento. Presumiblemente, como el ADN que contienen virus, el CPV ha cápside interior afinidad natural para un solo varados viral de ADN y, por tanto, carece de la capacidad para conservar alguno de los no envasados específicamente ARN, lo que eventualmente partículas vacía.

Estudios previos han revelado que los nativos CPV utiliza canina, así como TfRs humanos a interiorizar y llegar a la endosomes en las células [28]. Los análisis detallados de CPV cápside reveló que los residuos de Asn en las posiciones 93 y 300 veces en los tres son importantes en la espiga vinculante a la TfRs canina. Además, varias de residuos en la región del hombro (Gly 299, Lys 387, Ala 300, Thr 301, y val 316) también parecen jugar un papel en vinculante [44]. Sobre la base de la CPV-cápside de modelado (Figura 1B], los residuos de Lys, en las posiciones 89 y 312 son los más accesibles y, por lo tanto, disolvente más probable que se derivatizado. En nuestra bioconjugation experimentos, el embargo de los tintes a la Lys 387 de residuos en algunas de las subunidades no se puede descartar. Sin embargo, el papel de estos residuos en los CPV vinculante TfRs específicamente a los humanos no se ha determinado.

Una vez que se demostró que CPV-VLPs podría soportar conjugación química y permanecer intacto después de la purificación, el tinte-etiquetados CPV-VLP son investigados por su posible utilidad para orientar las células tumorales. En primer lugar se analizaron las vinculante y la internalización de los CPV-VLP en tumor de las células HeLa que sobre-expresan TfRs [31] (Figura 5]. La internalización de los CPV-partículas VLP fue bastante rápido, que se producen dentro de las dos horas como ya se observó con CPV nativa [28]. Co-localización de los anticuerpos reconociendo CPV-VLPs con Texas roja con etiqueta de transferrina confirmó que la VLP están localizados en endosomes después de la absorción. Análisis de imagen confocal mostraron aproximadamente 50-60% co-localización, y las diferencias observadas son probablemente debido a la Tfn hecho de que se recicla de manera eficiente mientras CPV partículas son desviadas de endosomes a lisosomas, en consonancia con los informes anteriores [28, 45]. La unión a TfRs y clathrin mediada tráfico vesicular de CPV a endosomes y lisosomas en las células se ha demostrado previamente en células HeLa y en la no NLFK células cancerosas [28, 45]. Seguidamente examinó si las VLP derivatizado CPV-OG-488 con moléculas de tinte mostrará una celda similares características vinculantes y la internalización. Para confirmar la especificidad TfR, la unión de OG-488-CPV-etiquetados a VLPs TRVb1 células (expresando TfR), y TRVb células (o no existen o que expresan niveles muy bajos de TfR) [46] se investigó. La unión y la internalización de marcado tinte-CPV-VLPs sólo se observó en el TRVb1 células, pero no en las células TRVb (Figura 6], confirmando que es de carácter vinculante y la internalización TfR mediada. Así, el TfR específicos de la internalización de los OG-488 etiquetada CPV-VLP es similar a la nativa CPV-viriones, de acuerdo con un informe anterior [28]. Desde CPV-VLPs podría entrar de manera eficiente tumor de las células HeLa y el marcado tinte CPV-VLPs demostrado TfR especificidad, y por la tarde se examinarán vinculante y la internalización de los OG-488-CPV-VLPs etiquetados en otras líneas de células tumorales humanas que se sabe que sobre-expresan TfRs como el HT-29 y MDA-MB231 células [30, 31]. El CPV-VLPs derivatizado con OG-488 fueron tomadas por las tres líneas celulares investigadas dentro de las 2 horas, similar a la etiqueta de partículas en células HeLa (Figura 7].

Por lo tanto hemos demostrado que CPV-VLP, derivatizado con pequeñas moléculas para el lysines sobre la superficie de la cápsula, para conservar su orientación TfRs. Por otra parte, CPV-VLP puede soportar las condiciones necesarias para la modificación química de utilidad para ampliar su conjugación con los fármacos quimioterapéuticos o de la imagen de contraste. Nuestro futuro esfuerzos están dirigidos a la orientación tumor con tinte y las drogas etiquetados VLPs en modelos de ratón de cáncer humano. Derivatización de CPV-VLPs con fármacos quimioterápicos conjugado a través de distintos tipos de enlaces endosomal cleavable [8, 47] se está investigando la liberación de la droga específicamente en el interior de las células tumorales. Aunque hay muchos tipos de nanopartículas en el desarrollo de tumor de orientación [6], VBNPs en comparación con sus pares, tienen una notable uniformidad y ofrecen un control preciso de visualización de moléculas. El logro de este nivel de control de la distribución espacial es incomparable con inorgánicos o lípidos nanomaterial. Sin embargo, dado que son las VLP proteínico en la composición, una respuesta inmune por la acogida es evidente, lo que limita su uso para repetir la administración. Utilizando múltiples VLP o el empleo de polímero capa de blindaje de las partículas [48, 49] o el uso de partículas alterado quimérico [50] podrá abordar las cuestiones de limpieza de inmune.

Conclusión

CPV-VLPs se pueden producir en cantidades importantes en el sistema de baculovirus expresión. Optimización de la expresión incluyendo la adición de otras regiones de las proteínas de la cápsida o truncado versiones del gen VP2 u otros sistemas de expresión de la proteína puede ser útil para mejorar aún más el rendimiento de partículas. Como nativo de CPV, marcado tinte-CPV-VLPs TfRs específicamente se unen a las que se sabe están upregulated en una variedad de células tumorales. Derivatización de los residuos de lisina sobre CPV-VLPs con pequeñas moléculas es factible bajo condiciones apropiadas y no interfiere con la unión y la internalización en las células tumorales. En conjunto, estos estudios demuestran el potencial para el desarrollo de CPV-VLP como una nueva plataforma basada en el virus de tumor de distribución selectiva de medicamentos y la imagen de agentes de contraste.

Materiales y métodos
Producción y purificación de VLPs CPV-de las células de insectos

Producción de baculovirus recombinante CPV-VLP se ha descrito previamente [27]. El virus recombinante fue un regalo del doctor C. Parrish (Universidad de Cornell, Ithaca, Nueva York). Existencias iniciales de preparación, la placa de purificación y determinación de unidades formadoras de placa (ufp) se realizó en Spodoptera frugiperda (Sf-21) las células. Para los preparativos a gran escala, Trichoplusia ni (T.ni) las células se propagan a los 27 ° C en la EX-CELL 401serum sin soporte (JRH Biosciences, Lenexa, KS) suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina por Ml, y 100 μ g / ml de estreptomicina. Cada litro de la cultura que contiene 1 × 10 6 células / ml fue infectado con 15 a 20 ml de virus recombinante a un título, de 5 a 8 × 10 6 ufp / ml. Tras la incubación de las células infectadas a los 28 ° C y 100 rpm en agitador matraz (por lo general durante 72 horas), las células fueron cosechadas por centrifugación a 1500 g durante 10 minutos. Las células se re-suspendió en 100 ml de buffer fosfato salino (PBS) que contenía 10 mM etilendiamina tetra acético (PBSE, pH 7.4). Las células fueron lisadas por adición de Triton X-100 a una concentración final de 1% junto con 2 mM phenylmethyl sulfonyl fluoruro en hielo por 10 minutos. La célula de los desechos se pildoradas por centrifugación a 10000 g durante 30 minutos. Para el sobrenadante un volumen igual de cloroformo / butanol mezcla (1:1) fue agregado y agita durante 15 minutos a 4 ° C. La solución se centrifuga a 10000 g durante 20 minutos. El acuosa sobrenadante se recogió con cuidado y polietileno glicol 8000 y cloruro de sodio se añadieron a una concentración final de 8% y 400 mM, respectivamente. La mezcla se agita para después de 20 minutos a 4 ° C, se centrifuga a 15000 g durante 20 minutos. La pastilla que contiene el CPV-VLPs se volvió a suspenderse en 10 ml de PBSE. Después de 30 minutos de la mezcla en una coctelera a temperatura ambiente, la suspensión se centrifuga a 9000 g para eliminar los residuos insolubles. El sobrenadante que comprende de la CPV-VLPs se transfirió a un tubo que contiene 4 ml de sacarosa al 20% en PBSE cojín y centrifugada en un 50,2 Ti rotor (Beckman, Fullerton, CA) a 145000 g durante 3 horas a 4 ° C. El pellet se resuspendió en 1 ml de PBSE capas y luego en un 10-40% de sacarosa en PBSE gradiente, y se centrifuga a 207000 g durante 2 horas en un rotor SW41 (Beckman) a 4 ° C. Bandas visible sobre la mitad del tubo se recolectaron y se centrifuga en 50.2Ti rotor a 145000 g durante 3 horas a 4 ° C. El pellet recogido compuesto purificado de CPV-VLPs se resuspendió en PBSE y almacenadas a 4 ° C. Purificada VLP muestras fueron analizadas por sodio-dodecil-sulfato de electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), el tamaño de la cromatografía de exclusión y microscopía electrónica de transmisión. El rendimiento de las VLP se cuantificaron utilizando un kit de ensayo proteínas Lowry (Pierce, Rockford, IL).

CPV-VLPs desnaturalizado en SDS-PAGE buffer de muestras se separaron en un 4-12% bis-tris gel de poliacrilamida (Invitrogen, Carlsbad, CA) empleando a 200 V de corriente constante durante 35 minutos. Las bandas de proteínas se visualizaron por tinción con Azul Simplemente (Invitrogen). Por tinte-virus de la etiqueta (ver más abajo), después de la electroforesis en gel se coloca en una caja de luz UV-para visualizar las bandas fluorescentes. SEC se llevó a cabo en una columna Superose6 utilizando un explorador AKTA (Amersham-Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) con un caudal de 0,4 ml / minuto en PBSE de amortiguación (pH7.4).

CPV-VLP de modelado

El CPV-VLP cápside estructura (Figura 1A, B] se obtuvo de la base de datos de virus de explorador de partículas (VIPER) [51]. El modelo se dictó con CHIMERA software [52]. La inserción en la figura 1A muestra un diagrama de la cinta de una sola proteína VP2 subunidad. El lysines accesibles en la superficie de la cápsula se determinaron sobre la base de la distancia radial de los residuos, eficaz y solvente Radio accesible superficie de CPV-VLPs VIPER en la base de datos que originalmente se determinó a través de CHARMM software [53]. La superficie accesible lysines identificados fueron representados en un espacio de relleno de modelo CPV-VLPs diseñada utilizando el software Visual Molecular Dynamics (VMD) [54].

Dye etiquetado de CPV-VLP

Sobre la base de los métodos publicados anteriormente tinte para el etiquetado de la planta virus CPMV [15], en el CPV PBSE fue etiquetada con varios molares equivalentes de los tintes, Oregon verde-488 succinimidyl ester (OG-488, Invitrogen). En pocas palabras, OG-488 tinte (r = 662,5 MW) se añadió to100 o 200 molar equilvalents por VP2 subunidad (r = 64,000 MW) de la siguiente manera. En primer lugar, el colorante fue disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO) y luego mezclarse con el virus de la PBSE de contener no más de 10% de DMSO concentración final. Un virus de la concentración de 2 mg / ml en PBSE se utilizó para todas las reacciones de tinte etiquetado. Después de la noche a la mañana de incubación a temperatura ambiente, hydroxalamine (pH 8.5) se añadió a una concentración final de 1,5 M para inactivar el tinte éster. El tinte marcado gradiente de sacarosa virus fue purificado como se ha descrito anteriormente. El virus de la banda fue recogido más dializados con 3 intercambios contra PBSE. La cantidad de tinte conjugado en la VLP calcula como absorbancia medidos a 496 nm veces el peso molecular de los virus (64000 × 60) dividido por el producto del coeficiente de extinción de OG-488 tinte (70000) y la concentración de virus en mg / ml. VLPs derivatizado con el tinte se analizaron por SDS-PAGE, SEC y TEM. La unión y la internalización de marcado tinte-CPV-VLP en TRVb, TRVb1 y de las células tumorales fue examinado por microscopía confocal.

Líneas celulares

Líneas celulares de tumores humanos, HT-29, HeLa y MDA-MB231 fueron obtenidos de American Type Culture Collection (Manassas, VA). HT-29 se mantuvo en medio Leibovitz (Invitrogen), mientras que HeLa y MDA-MB231 fueron cultivadas en MEDM modificados (Invitrogen). Células de ovario de hámster chino TRVb (negativo de la expresión del receptor de transferrina) y TRVb1 (TRVb derivados de las células que contiene un plásmido para la expresión del receptor de transferrina humano) han sido descritas previamente (regalo del doctor T. Mc Graw, la Universidad de Cornell) [46] y se Ham mantiene en la F-10 medianas (Invitrogen), sin o con 0,2 mg / ml de geneticin (Invitrogen), respectivamente. Cada uno de los medios de cultivo que contienen L-glutamina antes descrito ha sido complementada con 10% suero bovino fetal, la penicilina y los antibióticos (100 U / ml) y estreptomicina (100 μ g / ml).

Microscopía electrónica y confocal

Aproximadamente 10000 células / así de células HeLa fueron chapada en un 12 y placa de cultivo de tejidos que contienen hojas de la cubierta de vidrio circular. Después de un día de incubación, las células fueron expuestas a cualquiera de 10 μ g / ml de Texas roja con etiqueta de transferrina (Invitrogen) o 20 μ g / ml de CPV-VLP o ambos (de co-localización de los estudios) durante 2 horas a 37 ° C en los medios de comunicación Sin suero. Tras la incubación de las células se lavaron 3 veces con los medios de comunicación, donde se fijarán con helado paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7.4) durante 10 minutos. Tras la fijación, las células fueron lavadas 3 veces con PBS y luego tratados durante 10 minutos en PBS que contenía 0,1% Tritón X-100 y 1% de albúmina sérica bovina (permeabilización de amortiguación). Las células fueron expuestas a conejo anticuerpos anti-CPV (1:500) diluido en permeabilización de amortiguación de 1 hora a temperatura ambiente. Las células fueron lavadas tres veces en PBS y expuestos a Alexa-488 etiquetada cabra anti-conejo anticuerpos (Invitrogen) en la dilución de 1:2000 en la permeabilización de amortiguación durante 30 minutos a temperatura ambiente. La cubierta se desliza lavar tres veces con PBS entonces rápidamente con agua antes de su montaje con Vectashield difícil establecer medianas (Vector Laboratories, Burlingame, CA) diapositivas sobre vidrio. Las células fueron examinados con un microscopio confocal Zeiss Axiovert. Para experimentos con TRVb, TRVb1 y diversas células tumorales, cada uno de la línea celular fue expuesto a OG488-CPV-VLP en condiciones similares, tal como se describe más arriba. Además, TRVb células fueron tratadas con TOTO-3 (Invitrogen) para la tinción nuclear. Tras la fijación de las células fueron lavadas con PBS y directamente visualizado por microscopía confocal.

Transmisión electrónica de los análisis microscópicos de CPV-VLPs se realizaron mediante el depósito de 10 μ l alícuotas de la muestra en la malla 100-carbono recubierto de cobre para redes de 2 minutos. Las redes fueron teñidas con 10 μ l de acetato de uranilo 2% y visualizados en virtud de un microscopio electrónico Philips CM100.

Contribuciones de los autores

PS concibe el estudio y realizó experimentos. GD asistida con tinte de etiquetado, el virus de modelado estructural y análisis de cromatografía de columna. AS asistida con el sistema de baculovirus expresión y purificación de virus. MM proporcionó orientación con el diseño experimental y preparación manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a C. Hsu y W. Ochoa de asistencia con microscopía electrónica. Los autores reconocen la ayuda del Dr V. Reddy (TSRI) en el CPV cápside del virus de modelado. Agradecemos la generosa donación de baculovirus recombinantes que expresan proteínas CPV-VP2 y TRVb1 células de los Dres. C. Parrish y T. McGraw, respectivamente, en la Universidad de Cornell, Nueva York. Este trabajo se presenta en este manuscrito TSRI # 17725-CB con el apoyo de subvenciones CA112075 y NO1-CO-27181 a MM y AS