Microbial Cell Factories, 2006; 5: 3-3 (más artículos en esta revista)

Morfológico desarrollo de Aspergillus niger sumergidas en ácido cítrico fermentación como una función del nivel de inóculo de esporas. Aplicación de redes neuronales y el análisis de agrupamiento para la caracterización de la morfología del micelio

BioMed Central
Maria Papagianni (mp2000@vet.auth.gr) [1], Michael Mattey (M. Mattey @ Strath.ac.uk) [2]
[1] Department of Hygiene and Technology of Food of Animal Origin, School of Veterinary Medicine, Aristotle University of Thessaloniki, Thessaloniki 54006, Greece
[2] Departamento de Biociencias de la Universidad de Strathclyde, Edificio Royal College, 204 George calle, Glasgow G1 1XW, UK

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Resumen
Antecedentes

Aunque la fermentación de ácido cítrico por Aspergillus niger es uno de los más importantes procesos industriales microbianos y diversos aspectos de la fermentación aparecen en un gran número de publicaciones desde el decenio de 1950, el efecto del nivel de inóculo de esporas de hongos en la morfología no es un área olvidada . El objetivo de la investigación fue presentado a cuantificar los efectos de las variaciones de nivel de inóculo de esporas en la morfología resultante del micelio y para investigar la fisiología de los fenómenos que pone de relieve. Lote de fermentación se llevaron a cabo en un tanque agitado biorreactor, que se inocularon con esporas directamente en concentraciones que van de 10 4 a 10 9 esporas por ml. Los valores obtenidos, evaluados por análisis digital de imágenes, se clasificaron utilizando una red neuronal artificial (ANN), que considera cuatro tipos de objetos: globulares y alargada "pellets", en bosquetes y árboles del micelio libre. La importancia particular de las características morfológicas y su combinación se determinó mediante análisis de clusters.

Resultados

Volumen celular fracción análisis de los diversos niveles de inóculo a prueba reveló que por el aumento de nivel de inóculo de esporas de 10 4 a 10 9 esporas por ml, una clara transición de la forma dispersa a pildoradas ocurre. La glucosamina formación y liberación por el micelio parece estar relacionado con el nivel de inóculo de esporas. Concentraciones máximas detectadas en fermentaciones inoculadas con 10 4 y 10 5 esporas / ml, en donde predominaron los pellets. A niveles mucho más alto inóculo (10 8, 10 9 esporas / ml), la disminución de los niveles de oxígeno disuelto durante la primera fase de fermentación se asociaron con uptakes lento de los iones de amonio y glucosamina concentraciones significativamente más bajos mientras que el micelio desarrollado en la morfología dispersa. Un gran aumento en el principal y el total de filamentación longitudes y ramificación frecuencia se observó en los árboles del micelio como aumentan los niveles de inóculo de 10 4 a 10 9 esporas / ml, mientras que en forma global con partículas de tamaño compacto y su disminuido.

Conclusión

Los métodos utilizados en este estudio, permite la cuantificación detallada de la transición entre los dos extremos formas morfológicas. El impacto de inóculo de esporas en el nivel detallado de las características morfológicas formas producidas fue alta. Control de la morfología del micelio es a menudo considerado como un requisito previo para garantizar una mayor productividad en aplicaciones industriales. La investigación demuestra que se describe aquí se adapta el nivel de inóculo de esporas de manera efectiva los controles de la morfología del micelio.

Antecedentes

Sumergido en la cultura de la morfología de los microorganismos filamentosos varía entre dos formas extremas, pellets y filamentos libres, en función de las condiciones de cultivo y genotipo de la cepa. Según numerosos informes, la morfología del micelio es crucial para el proceso de fermentación, no sólo en relación con la forma de las hifas sí mismos y en la agregación de matas microscópicas (micro-morfología), pero también en la forma de pellets de crecimiento (macro-morfología ). En todos los casos denunciados, el micelio de acidogenic Aspergillus niger se encontró para que se ajusten a las características morfológicas tipo descrito por Snell y Schweiger [1]: corto, hinchazón de los filamentos con consejos hinchada. Los pellets deben ser pequeñas, con una dura, superficie lisa. Se sabe que esta es provocada por el ajuste de la agitación y aireación, el ajuste del pH, la concentración de importantes vestigios de metales, y inóculo nivel [2].

Control de la morfología del micelio en fermentaciones es a menudo un requisito previo para la aplicación industrial. En algunos procesos, libre micelio se requieren para aumentar la productividad, como en la producción de penicilina de Penicillium chrysogenum [3]. Mientras que en otros procesos de "pellets" o células inmovilizadas son necesarios de acuerdo a los informes sobre itaconic [4], y los ácidos cítrico [5], algunas enzimas de hongos, como polygalacturonidase o α-glucosidasa [6], o esteroides biotransformaciones [7]. En cuanto a morfologías de pellets, como requisito previo para el aumento de productividad, las metodologías para la producción de pellets de varios microorganismos se han sugerido [8, 9]. Sin embargo, los informes sobre la morfología preferido son a menudo contradictorios, ya que cada una de las dos formas extremas de "pellets" vs filamentos-tienen sus propias características relativas a la fisiología celular, cinética de crecimiento, el consumo de nutrientes y reología caldo, que puede ser considerado ya sea como ventajas o inconvenientes como .

Un importante inconveniente de pildoradas suspensiones es que el crecimiento de las células-y la consiguiente actividad metabólica-se produce sólo en la superficie, donde el contacto con el oxígeno y los nutrientes medio es suficiente, mientras que las células en el interior de la "pellets" de responder a un entorno muy diferente. Además en "pellets", la limitación de transferencia de masa se produce gradualmente y convertirse en células sometidas a autolisis [10]. Obviamente, sólo una fracción del micelio participa en la biosíntesis de metabolitos cuando esto requiere por ejemplo elevadas concentraciones de oxígeno disuelto. Hay casos, sin embargo, que el inconveniente se convierte en cierta ventaja. Pellet resultados en la formación de sorprendentes efectos en la producción polygalacturonidase por A. Niger y de su síntesis se correlacionan bien con el tipo morfológico particular [6]. La más compacta la bolita, mayor es la síntesis de las enzimas. Cualquiera que sea el medio utilizado, un aumento de casi dos órdenes de magnitud en la polygalacturonidase concentración de la producción y difusión de las tasas de entre el micelio y "pellets" de los primeros. Incrementos similares se observaron en la síntesis de α-galactosidasa por micelio "pellets" de Mortierella vinacea y nikkomycin producción por Streptomyces tendae [11]. Esos fenómenos están relacionados con las limitaciones de difusión en "pellets", que o bien reducir el alcance de la represión catabólica en pellets o limitar el suministro de oxígeno, por tanto, un oxidativo prevención de la inactivación de conjuntos específicos de las enzimas, así como a la existencia de factores adicionales, como los gradientes de Productos metabólicos en "pellets" que actúa como señales biológicas (moduladores). En su examen de los factores que afectan a la morfología del micelio y la producción de metabolitos, Braun y Vecht-Lifshitz [11] sugieren que los agregados del micelio puede ser visto no sólo como conglomerados mecánica, sino más bien como complejos tejidos diferenciados, fenotípicamente se caracteriza por las actividades metabólicas específicas.

Ha habido mucha discusión sobre las dos formas extremas morfológicos, pellets y filamentos libres, ya que se ha establecido que los principios de la morfología general afecta a la productividad y la posterior proceso de la economía. Entre las dos formas extremas pueden mentira una gran variedad de morfologías, la existencia de que muy a menudo olvidadas, sobre todo en los estudios reológicas. Una forma morfológica, que en el caso de P. Chrysogenum podría ser responsable de más del 90% de la biomasa [12 - 14], es la forma de micelio en bosquetes - agregados, de carácter permanente, que no puede ser desintegrado, ya sea por dilución o mezcla suave. Esas formas nunca se mencionó a comienzos de las obras en la morfología de hongos sumergidos en la cultura, debido a la falta de métodos adecuados para vigilar la morfología durante la fermentación. La aplicación de sistemas de análisis de imágenes en la biotecnología de hongos en la década de 1990 permite la extracción de información cuantificada y de la detallada caracterización de las distintas formas morfológicas. Usando el método de análisis de imágenes de Tucker et al. [14], y Thomas Tucker [15] se describen cuantitativamente la transición de pildoradas dispersas a las formas de crecimiento de P. Chrysogenum como inóculo niveles levanta hacia 10 5 esporas por ml de medio.

La investigación sobre los efectos del inóculo de hongos de importancia comercial en los procesos de ahora podría ser más sistemática, haciendo uso de los avances tecnológicos en la vigilancia y caracterización de la morfología del micelio durante la fermentación. Aparte de los primeros trabajos de Martin y de las Aguas en 1952 [16], y del Acero et al. En 1955 [8], que informó sobre algunas relaciones cualitativas, no hay informes en la literatura sobre el efecto del nivel de inóculo de esporas en ácido cítrico por fermentación A. Níger. Evidentemente, es un área descuidada, ya que en términos de la producción en masa de ácido cítrico es considerado como uno de los más importantes de los ácidos orgánicos producidos por métodos microbiológicos. El objetivo de la investigación fue presentado a cuantificar los efectos de las variaciones de nivel de inóculo de esporas en el resultado de la morfología del micelio A. Niger sumergido en la cultura y la fisiología para investigar los fenómenos que pone de relieve. Fermentaciones llevadas a cabo en un tanque de 3,0 L despertado bioreactor y inoculadas con esporas inóculos en el rango de 10 4 a 10 9 esporas por ml de medio. Los valores obtenidos fueron evaluados por procesamiento digital de imágenes y clasificados utilizando una red neuronal artificial funciona como un añadido a MS Excel. La importancia de las distintas características morfológicas y su combinación se determinó mediante análisis de clusters.

Resultados
La germinación de esporas, filamentación ramificación y agregación

Todas las carreras se realizaron en las mismas condiciones de funcionamiento del reactor mientras que el único parámetro que pasó de correr a correr es el nivel de inóculo de esporas que varió en un rango de 10 4 a 10 9 esporas / ml. La inoculación se llevó a cabo con las organizaciones no aglomerados esporas. Tras la inoculación, las muestras para el análisis morfológico y clasificación de objetos por medio de la ANN (Fig. 1] fueron a las 4, 8, 12, 14, 18 horas y luego en intervalos regulares, hasta un máximo de 120 horas. No se detectaron cambios morfológicos durante las primeras 4 horas. A las 8 horas, las esporas parecía hinchada y una gran proporción de ellos fueron aglomerado, mientras que la germinación se inició y no se formaron hifas ramificados. A las 12 horas de ramificación era evidente y en 18 horas se detectaron agregados permanentes.

La fermentación del ácido cítrico

En todas las fermentaciones, la producción de ácido cítrico se inició en torno a 18 horas de la inoculación. El ácido cítrico de producción es elevado, superando en todos los experimentos de 100 g / l, en 150 horas de fermentación. El ácido cítrico tasa de aumento de la producción como la concentración de NH 4 + en el medio de fermentación caída a niveles muy bajos después de la 36 ª hora de la inoculación. Los niveles de biomasa eran comparables en todas las fermentaciones las primeras 72 horas (aproximadamente, 3,5 g / l). Además, en la fermentación, los inóculos inoculadas con esporas de la orden de 10 7 y 10 8 esporas / ml mostró un aumento en la acumulación de biomasa y en 150 horas, momento en el que se dieron por terminadas las pistas, la concentración final de biomasa alcanzó 9 g / l, Mientras que la biomasa de concentración no exceda de 7 g / l en los casos de reducción de los inóculos. Inoculación con esporas 10 9 / ml dio lugar a 8 g / l de concentración de biomasa final. Los niveles de oxígeno disuelto en el bioreactor difiere de acuerdo a las concentraciones de inóculo de esporas. A concentraciones por encima de 10 6 esporas / ml, los niveles de oxígeno disuelto correspondiente no excederá de un 80% de saturación en el punto 30 º horas, mientras que los niveles correspondientes de 10 4 y 10 5 esporas / ml inóculos fueron saturadas 100% que se mantuvo en todo este tipo de fermentación . Concentración de oxígeno disuelto disminuyó aún más hasta el 70% en el curso de fermentaciones inoculadas con esporas concentraciones por encima de 10 6 esporas / ml. El (NH 4) 2 SO 4 captación se calculó en todas las fermentaciones y que se consideraron relacionados con el inóculo de esporas de concentración, ya que las culturas inoculadas con esporas concentraciones superiores a 10 7 esporas / ml mostró una clara absorción más lenta (Fig. 2]. Entre las aproximadamente 36-40 horas, la mayor parte de amonio fue retirado de la media. La tasa de absorción no parece tener ninguna relación con la cantidad de biomasa presente en esta etapa, como los niveles de biomasa en 40 horas fueron comparables.

La glucosamina por la formación de micelio y la posterior liberación en el caldo de fermentación parece estar relacionada con el nivel del inóculo de esporas. La glucosamina detectados en el caldo de fermentación a las 18 horas en los casos de los inóculos 10 4, 10 5, 10 6 y esporas / ml, mientras que a las 24 horas en todos los demás casos en los que los niveles de inóculo fueron mayores. La concentración máxima de 46 g / l, se observó a 55 horas en fermentaciones inoculadas con 10 4 y 10 5 esporas / ml. Esto se mantuvo prácticamente estable hasta 90 horas de fermentación a reducirse drásticamente después. Las muestras analizadas para la glucosamina en el mismo momento en que puso de manifiesto que el nivel de inóculo aumentado a niveles superiores a 10 6 esporas / ml, disminución de la acumulación de glucosamina. Cuando el inóculo de esporas 10 9 / ml se aplicó, la glucosamina niveles detectados a 55 y de 70 horas fueron de 21 y 18 g / l, respectivamente.

El desarrollo de la morfología de Aspergillus niger

A las 24 horas, según el nivel de inóculo de esporas, una forma morfológica tendencia es más bien establecido sin filamentosas o "pellets", por ejemplo, sin embargo todavía es pronto para que la clasificación ya que los cultivos fueron bien en la fase de crecimiento y todo tipo de formas morfológicas se detectaron. Específicos de las tasas de crecimiento se redujo alrededor de 50 horas a partir de la inoculación de ácido cítrico mientras que las tasas de aumento de la producción (no se muestra). La comparación de los errores de la identificación de objetos mi medio de la ANN indicó que la clasificación de mejores resultados se obtuvieron en el período comprendido entre el 50 y 90 horas en todas las culturas. El promedio de 70 horas se eligió la clasificación para la morfología de los estudios desde que se estableció por vez, en todos los casos y también porque el tiempo que corresponde a las más altas tasas de producción específicos observados (no se muestra). La importancia (probabilidad de clasificación errónea) de las distintas características morfológicas de Aspergillus niger se muestra en la Fig. 3. Según el análisis, la zona tiene la mayor importancia y de la longitud total de filamentación en el más bajo. La evaluación de la importancia de la combinación de estas características morfológicas revela que la combinación de cultivo de tiempo con el objeto de superficie y excentricidad dado la mayor importancia o de la más baja clasificación errónea.

Volumen celular fracción análisis de los diversos niveles de inóculo se muestra en la Fig. 4. La figura muestra los porcentajes de las diversas formas morfológicas en 70 horas culturas. La transición de las formas de dispersión de pildoradas micelio es tan claro como el que aumentan los niveles de inóculo de esporas de 10 4 a 10 9 esporas / ml.

Dado que en todos los casos los niveles de inóculo diversas formas morfológicas fueron identificados en muestras aparte de la forma dominante, en las figuras 5, 6, 7, 8 probado todos los niveles de inóculos se trazan en relación con los parámetros morfológicos correspondientes a la libre agregados filamentosos o material. Figuras 5 y 6 muestran el efecto del nivel de inóculo de esporas en la forma dispersa, mientras que Figs 7 y 8 muestran el efecto sobre la agregación del micelio. Como se ilustra en estas cifras, la variación del nivel de inóculo dado lugar a muy diferentes morfologías del micelio que está desarrollando la final de la fase de crecimiento de un lote de la cultura (70 horas). Según Figs 5 y 6, un gran aumento en la media principal hifales longitud, con una media de la longitud total y la frecuencia de ramificación de los micelios se observó que el aumento del nivel de inóculo de 10 4 a 10 8 esporas / ml. Un nuevo aumento de 10 8 a 10 9 esporas / ml parece haber sólo pequeños efectos adicionales principalmente en la media del número de consejos por micelio. La forma de datos agregados mostró similar comportamiento. Como el aumento del nivel de inóculo de 10 4 a 10 9 esporas / ml hubo una gran disminución en el tamaño de las partículas de agregados (Fig. 7], y un gran cambio en la rugosidad y la compactación (Fig. 8].

Discusión

Relaciones cualitativas entre A. Niger morfología y los distintos parámetros de los procesos en la fermentación de ácido cítrico como agitación, pH, y las diversas medio mandantes han sido reportados en muchos casos. Información cuantitativa sin embargo, se dispuso de análisis de imágenes con aplicaciones en años más recientes. La mayoría de las investigaciones sobre la relación entre la morfología del micelio, la producción de metabolitos y los parámetros del proceso en cuestión antibiótico fermentaciones. El ácido cítrico por fermentación A. Niger, en cuanto a la relación de la morfología y la productividad, fue objeto de un pequeño número comparativamente de los informes [2]. Tal y como aparece en una serie de informes, una cantidad considerable de trabajo se ha llevado a cabo sobre el control de A. Niger macro y micro-morfología durante fermentaciones en virtud de diversos niveles de agitación [17, 18] y los regímenes de mezcla [18], diversos niveles de concentración de glucosa en el lote y lote alimentado-cultura [19] y el pH, de fosfatos y de los niveles de concentración de manganeso [20]. Estas obras se han llevado a cabo con la misma cepa y el tipo de reactor, eliminando de esa manera la evaluación relacionados con la tensión o problemas relacionados con el proceso de reactor diferencias. En todos los casos, el sistema objeto de la investigación parece ser muy sensible a los cambios en los parámetros del proceso morfológicamente reaccionar y producir una gran variedad de morfologías, por ejemplo, de las formas filamentosas a pildoradas. Además, en el aumento de las tasas de agitador (por ejemplo, de más 350 rpm), un requisito previo para el logro de altos rendimientos de ácido cítrico, un ciclo de la fragmentación del micelio y re-crecimiento y se ha observado una transición de matorral para liberar a los filamentos de matas se vigila durante la fase de producción , Una situación que mantiene la producción de ácido en las tasas de aumento de los niveles ya que el porcentaje de micelio mantenerse metabólicamente activo en el aumento de los niveles a través de la formación de nuevas ramas de la fragmentación de hifas [21]. Un patrón similar de la fragmentación, re-extensión, y una mayor fragmentación se ha informado en muchos casos para otros microorganismos filamentosos, cultivadas bajo condiciones de intensa agitación [22 - 28].

En el caso del presente trabajo, la morfología detalladas investigaciones mostraron que después de aproximadamente 90 horas de la inoculación, el número de pellets (en pildoradas fermentaciones) aprobó una fracción máxima, y aumentó de nuevo. El mismo fue monitorizada con matas. Se espera, obviamente, la fragmentación y la nueva modalidad de crecimiento. En filamentosos caldos, el resultado de inóculos de la orden 10 8 y 10 9 esporas / ml, se indicó desde la fragmentación de las variaciones en la longitud media total del micelio y longitudes de cero, de primer y segundo orden ramas de micelio. Hemos supervisado la morfología del micelio fermentaciones en todo el fin de encontrar el período que da la más confiable de información cuantitativa con respecto a la influencia del inóculo. Fragmentación y volver a los patrones de crecimiento fueron objeto de un informe anterior sobre el mismo fermentación [21] y se producen con independencia del tipo de inóculo. Por lo tanto, en el presente trabajo se informa sobre la fermentación período en el que se establece la morfología y parece bastante estable y esto es antes de la fragmentación y el re-crecimiento de los fenómenos tienen lugar. Según estudios preliminares sobre los errores de identificación de objetos, a través de la ANN, este plazo se amplía de 50 a 90 horas y como se explica en la sección anterior, las cifras que figuran en morfológicas se refieren a los perfiles de las muestras tomadas en 70 horas.

En la mayoría de las publicaciones sobre la fermentación de ácido cítrico por A. Niger, el inóculo utilizado fue un preculture, que se cultiva en agitar frascos (inóculo vegetativo). De esta manera, el desarrollo morfológico está predeterminado en un grado y, en todo caso, depende en gran medida de las cualidades de la preculture. Un fuerte y uno de alta densidad de la biomasa-inóculo siempre es recomendable para el éxito de la fermentación. Inoculando directamente con esporas de los turnos de fermentación hacia atrás por un período correspondiente a la hinchazón de esporas, la germinación y la ramificación. Este período inicial de la fermentación parece ser muy importante para el resultado global en términos de la morfología. Permanente agregados (no detangled agitando) fueron detectados en 18 horas en todas las fermentaciones, en tanto que a las 24 horas a la tendencia morfológica se estableció-"pellets" o formas filamentosas libre-y que ello dependerá del nivel de inóculo de esporas.

Ha habido alguna discusión en el pasado con respecto a los factores que afectan a éste la agregación y la formación de pellets en microorganismos filamentosos. En su examen, y el Vecht Braun-Lifshitz [11] enumeró una serie de factores que influyen en la formación de pellets como microbiológicos (genética, de la pared celular composición, el tamaño del inóculo, la tasa de crecimiento, la nutrición, de carbono: nitrógeno ratio) y fisicoquímicos (fuerzas de cizallamiento, Agentes activos de superficie, pH, la temperatura, los iones Ca 2 +, la fuerza iónica, sólidos en suspensión). Sin embargo, la evaluación de estos factores incluso en el caso de la conocida industrialmente importantes especies de Aspergillus y Penicillium lleva a informes contradictorios [3 - 5, 29]. A pesar de las contradicciones, el efecto de la fermentación de diversos parámetros en la formación de pellets parece ser bastante similar en los sistemas de filamentosos como genéticamente distantes como hongos y actinomicetos. Así, en p. Chrysogenum [30], A. Niger [31, 32], Streptomyces tendae [33], y S. Griseus [11], "pellets" se forman en el inóculo de esporas por debajo de 10 11 / m 3 (fermentador volumen), mientras que a mayor crecimiento inóculos filamentosos prevalece. Además, los factores que favorecen el aumento de las tasas de crecimiento, como los medios de comunicación ricos en nutrientes fácilmente asimilables, se han examinado, en algunos casos, para reducir la formación de pellets en hongos [30] y [33] actinomicetos. Esas observaciones llevan a una limitación hipótesis [11], que sugiere que la falta de un determinado nutriente, incluidos oxígeno, induce la formación de pellets. El aumento de la agregación del micelio se observó como consecuencia de la limitación de nutrientes, especialmente el nitrógeno [6, 33], aunque con respecto a los informes de oxígeno son contradictorias. A partir de los informes existentes, es difícil sacar una conclusión acerca de oxígeno, ya que no comparaciones directas con diversos niveles de oxígeno se hicieron. En cuanto a la observación común [4, 5, 30] predominando pildoradas morfologías de los primeros en la vida de una cultura (suficiente suministro de oxígeno) filamentosa de inflexión en las fases posteriores (oxígeno limitado culturas), se trata más bien de una consecuencia del aumento de la vacuolización y la posterior fragmentación del micelio Y re-crecimiento, en condiciones muy diferentes de los que en el inicio de la fermentación.

En el presente trabajo, trampa-net formación y estabilización de los agregados del micelio en fermentaciones inoculadas con 10 4, 10 5 y 10 6 esporas / ml correspondía a un aumento de los niveles de oxígeno disuelto, lo que es contrario a la mencionada hipótesis relativas a la limitación de oxígeno. Más interesante es la observación de que un más rápido (NH 4) 2 SO 4 captación se registró en estas fermentaciones (Fig. 2], seguido de la formación y liberación de la glucosamina en el momento anterior (detectado en 18 horas en el caldo), y en cantidades elevadas En comparación con fermentaciones inoculadas con esporas de las concentraciones más altas. En nuestro último trabajo sobre el destino y la función de los iones de amonio durante la fermentación ácido cítrico por A. Niger [34], se ha demostrado que la glucosamina es el producto de la relación entre la glucosa y amonio durante las primeras etapas del proceso de fermentación de ácido cítrico por A. Níger. Ese estudio se centró en las primeras etapas de fermentación y, en particular, sobre la suerte y el papel de los iones de amonio y de la dinámica global del sistema bajo condiciones de producción. Mediante la aplicación óptima de la concentración inicial de iones de amonio en el medio (la misma cantidad de (NH 4) 2 SO 4 aplicada en el presente estudio), este tiene que ser agotado antes de la producción de ácido cítrico establece. La mayor parte de amonio se elimina de la caldo de entre 20 y 25 horas y es casi agotadas por 36 horas. La absorción de los iones amonio es seguida de una liberación de protones. Pormenorizada de los estudios sobre la relación entre la absorción de iones de amonio y de protones liberación llevada a cabo por Wayman [35] demostró que los dos están relacionados, pero sólo de manera indirecta. La liberación de protones en el caldo no coincide precisamente con la tasa de absorción de los iones amonio, desfases, pero un par de horas. Esta demora se opone a que un protón / amonio antiport como medio de asimilación de amonio. Coincidently, picos de la tasa de absorción de amonio seguir picos en la tasa de crecimiento de alrededor de 4 horas. Una cadena de acontecimientos que conduce al crecimiento de la captación de amonio conduce a la liberación de protones se establezca en la primera fase. Sin embargo, un fenómeno que no coinciden precisamente con la absorción de amonio es la captación de glucosa que se encuentra en un nivel tan alto (150 g / l) que debe ser mediada por proteínas.

Tal como se presenta en la sección de resultados, la mayor parte de amonio fue retirado de la mediana entre aproximadamente 36-40 horas, mientras que la concentración máxima de la glucosamina en fermentaciones inoculadas con 10 4 y 10 5 esporas por ml, llegó a 46 g / l en 55 horas. Comparando estos resultados con los reportados en nuestra publicación anterior [34] se observa una importante demora en el proceso de formación y liberación de glucosamina, que es, evidentemente, atribuir al tipo de inóculo (esporas vs inóculo vegetativo). Asimismo, ambas (NH 4) 2 SO 4 captación y concentración de la glucosamina en el caldo parecen estar relacionados con la concentración del inóculo de esporas. Micelio agregación es mayor en condiciones que garanticen el aumento de los niveles de oxígeno disuelto (por ejemplo, concentración de inóculo de esporas hasta 10 6 esporas por ml). En esas condiciones, la absorción de iones de amonio es más rápido seguido de una formación más rápida y la liberación de la glucosamina, que sin duda contribuye, como una sustancia pegajosa, a la elaboración de los agregados permanentes. La glucosamina niveles significativamente más bajos en fermentaciones iniciado con inóculos de esporas más fuertes corresponden a formas filamentosas morfológicos.

La función de la aireación en la fermentación de ácido cítrico por A. Niger es bien conocida (10). Baja aireación producir una reducción de los niveles de productividad. Varios aspectos de la función de la aireación y el oxígeno disuelto se han investigado hasta la fecha [36]. Sin embargo, la relación entre los niveles de oxígeno disuelto en el bioreactor y el desarrollo de la morfología de hongos aún no se puede comprender plenamente [10]. En este caso, una relación entre los niveles de oxígeno disuelto y la absorción de iones de amonio, que se refleja en la biosíntesis de la glucosamina, parece existir. La tasa de absorción no tiene ninguna relación con la cantidad de biomasa presente en esta fase, ya que los niveles de biomasa en 40 horas fueron comparables. Obviamente, esta relación influye en el desarrollo de la morfología de los hongos ya que ningún otro parámetro parece que tiene un efecto en esta serie de experimentos. No existen informes en la literatura acerca de la concentración de oxígeno disuelto y el amonio, la absorción de iones. Es bien sabido que la producción de ácido cítrico comienza con el agotamiento de amonio en el caldo [36]. También es bien sabido que los altos niveles de oxígeno disuelto se asocia a altas tasas de producción de ácido cítrico [37]. Se espera, por tanto, que lo que provoca un retraso en la transferencia de los iones de amonio dentro de la célula causará un retraso en la tasa de producción de ácido cítrico. Bajas concentraciones de oxígeno en el caldo, puede interferir con el protón / amonio antiport [34] tradujo en una disminución de las tasas de absorción de los iones de amonio y la reducción de las tasas de producción de ácido cítrico. El rápido proceso de acumulación de glucosamina [34] en esas condiciones también se ve afectada. La concentración de los polisacáridos en la superficie de las hifas se espera que desempeñe un papel en la formación permanente de los agregados debido a la naturaleza de los compuestos, que actúa como agente de una superficie de adherencia. Bajo concentraciones de oxígeno disuelto en nuestro caso, como resultado del aumento de los niveles de inóculo. La relación entre el oxígeno disuelto y la absorción de iones de amonio, con independencia del nivel de inóculo de esporas, necesita una investigación más a fondo que está más allá del objetivo del presente informe.

En su examen sobre la morfología del micelio y la producción de metabolitos, Braun y Vecht-Lifshitz [11] escribió que: "la modificación afecta a la superficie de la agregación directa. Sin embargo, es difícil asignar algunos factores (por ejemplo, tasa de crecimiento, la limitación de nutrientes o tamaño del inóculo) como responsable específicamente para la cohesión o desintegración de los agregados del micelio ". Nuestros resultados muestran que el tamaño del inóculo fúngico morfología determina indirectamente influyendo en el medio ambiente en el interior del bioreactor y, en consecuencia, las tasas de fermentación, por lo tanto, afectan a la formación de polisacáridos que en el inicio de la fermentación parece ser crítica para el desarrollo de las formas morfológicas particular.

Aplicación de redes neuronales y el análisis de agrupamiento para la caracterización de la morfología de los hongos se ha informado hasta el momento sólo por Gerlach et al. [12]. En ese informe, la influencia de la temperatura, concentración de fosfato, y la agitación se investigó sobre la morfología de A. Awamori en agitar frascos de las culturas y puente aéreo biorreactores y de la relación de la morfología de hongos para el rendimiento del proceso se examinaron. Nuestros resultados sobre el significado (probabilidad de clasificación errónea) de las distintas características morfológicas de A. Niger, como se muestra en la Fig. 3, indican que el área tiene la mayor importancia mientras que la longitud total de filamentación en el más bajo. Resultados de la misma tendencia se informó por Gerlach [12] para A. Awamori, quien también encontró que la combinación de cultivo de tiempo con el objeto de superficie y excentricidad dado la mayor importancia. Lamentablemente, en ese estudio de un inóculo vegetativo (preculture) bioreactor se utiliza para la eliminación de los experimentos de esa manera cualquier efecto inóculo.

Como se ilustra en la Figs 4, 5, 6, 7, y 8, variando el nivel de inóculo de esporas dado lugar a muy diferentes morfología del micelio que está desarrollando la etapa final del crecimiento de los lotes culturas. Fig. 4 muestra el volumen de la celda fracción análisis (70 horas) para los diferentes niveles de inóculo de esporas aplicado en este estudio. Una clara muestra es la transición que tendrá lugar de forma dispersa a pildoradas como aumentan los niveles de inóculo de 10 4 a 10 9 esporas / ml. Inoculando con 10 4 esporas / ml resultó en "pellets" que representó el 95% de los objetos detectados. El 10 5 esporas / ml inóculo dio una mezcla de pellets y bosquetes, con el predominio de "pellets" de matas y la contabilidad de un 15%. No hubo ninguna diferencia significativa para los inóculos de 10 6 y 10 7 esporas / ml. En ambas fermentaciones, en bosquetes representaron el 90% de los objetos detectados. Inoculación con 10 8 y 10 9 esporas / ml como resultado dispersas micelio (gratuito forma filamentosa) y una pequeña proporción (20%) y agrupadas de micelio. Caracterización cuantitativa de A. Niger en la morfología de la fermentación de ácido cítrico como una función del nivel de inóculo de esporas se informó aquí por primera vez.

Como se mencionó en la introducción, la mayoría de los estudios publicados de análisis de imágenes tratar con la morfología de Penicillium especies de importancia comercial o actinomicetos. Porcentaje de análisis de las diversas formas morfológicas de Streptomyces clavuligerus y P. Chysogenum en fermentación sumergida que se ha hecho por Tucker et al. [14] en el ensayo de un método de análisis de imágenes totalmente automático de la morfología del micelio. El método permite un rápido mediciones de los parámetros morfológicos importantes de la dispersión de micelio libremente, pero lo más importante es siempre una novela caracterización de la forma agrupada que constituye más del 90% de la biomasa en algunas fermentaciones (como en el presente caso) y podría, por lo tanto, se espera A tener una importante influencia sobre el caldo de reología, fermentador de mezcla, transferencia de masa, y por lo tanto la productividad de la fermentación. Sobre la base de los métodos de detección de objetos similares a los de Packer et al. [38] y Paul et al. [39], Gerlach et al. [12] informó sobre el análisis de la fracción de células volumen sumergido en las culturas de A. Awamori estudio de la influencia de los sistemas de reactores de la morfología de hongos. En estos casos el efecto del nivel de inóculo de esporas no estaba entre los temas de las investigaciones.

El efecto del nivel de inóculo de esporas de hongos en la morfología del objeto del informe por Tucker y Thomas [15] con p. Chrysogenum, que utiliza análisis de imagen para mostrar un fuerte transición de la forma dispersa a pildoradas como el inóculo de esporas aumentó de 5 × 10 4 a 5 × 10 5 esporas / ml. Aunque el nivel de inóculo aplicado límites son estrechos y el estudio se llevó a cabo en agitar frascos, informó de los resultados son sólidos y, en general, de acuerdo con observaciones anteriores (cualitativa) en el mismo microorganismo y Calam por Smith [40]. La influencia de la concentración inicial de esporas en la aglomeración que conduzca a la formación de pellets en P. Chrysogenum culturas fue también estudiada por Nielsen et al. [25]. Para una baja concentración de esporas en el inóculo, los autores encontraron que sólo unos pocos elementos de aglomerado y "pellets", con un pequeño diámetro se obtuvieron. A mayores concentraciones de esporas, muchos elementos hifales aglomerados y convertido en "pellets" de gran diámetro. En ese estudio, las concentraciones de esporas fueron utilizados para la inoculación en el orden de 10 7 esporas / l (de 3,5 × 10 7 a 8,6 × 10 7 esporas / l), y aunque el análisis de las imágenes se utilizó para cuantificar la morfología en la que trabajo, no distingue Se hizo entre los pellets y bosquetes, que en otras obras con el mismo microorganismo [8] parecen dar cuenta de más del 90% de las partículas detectadas a éste.

Como se explica en la sección Resultados, en las figuras 5, 6, 7, 8 probado todos los niveles de inóculos se trazan en relación con los parámetros morfológicos correspondientes a la libre filamentosos o agregados de material, porque en cada experimento, aparte de la forma dominante, las diversas formas morfológicas son identificados . De acuerdo con estas cifras, el impacto del nivel de inóculo de esporas de los detalles de las características morfológicas de una determinada forma es alto. Un gran aumento en la duración media hifales principal, el total de filamentación longitud, y la frecuencia de ramificación del micelio se observa como se eleva el nivel del inóculo de 10 4 a 10 8 esporas / ml, y sólo un pequeño efecto adicional en la media del número de consejos por micelio Se observa en el 10 9 esporas / ml (Figs 5, 6]. Esto significa que en el caso de fermentaciones en la que predomina enredado micelio, la libre filamentosos material es de pequeño tamaño, que es lógico y tal vez resultado de la fragmentación de hifas o de esporas que germinaron más tarde que otros. Los datos globales dieron resultados similares. El aumento de la inóculo de 10 4 a 10 9 esporas / ml, el tamaño de las partículas detectadas agregada disminuye, aumenta su rugosidad y la compacidad disminuye (Figs. 7, 8]. Resultados de una tendencia similar se informó por Tucker y Thomas [15] para P. Chrysogenum: aumentar el nivel de inóculo de esporas del 5 × 10 4 a 5 × 10 5 esporas / ml causado una gran disminución en el tamaño y clump un gran cambio en la rugosidad y compacidad. Aumentar aún más el nivel de inóculo de esporas disminuido lentamente el porcentaje de matas. Esto es directamente contrario a las observaciones de Nielsen et al. [25] de nuevo para P. Chrysogenum, que determinó que el aumento de diámetro de pellets con la concentración de esporas. Nielsen et al. [25] examinó el comportamiento diferente de sus microorganismo de la de Aspergillus tal y como aparece en el trabajo de Takahashi y Yamada [31, 32], y explicó que sobre la base de los distintos mecanismo de la coagulación de esporas de Aspergillus y Penicillium en la forma propuesta por Takahashi Y Yamada (36): Las esporas de Aspergillus son del tipo coagulativa (coagular, mientras que las esporas germinan y dan lugar a una red de interconexión de hifas), mientras que las esporas de Penicillium son de la no coagulativa tipo (una sola espora es capaz de Convertirse en una bolita). Este mecanismo no parece aplicable en nuestro caso, como en muchos otros [9, 25], y el uso de sistemas de análisis de imágenes en los estudios de la morfología de hongos dejó en claro que la aglomeración no sólo se determina por el organismo, sino también por el medio ambiente Condiciones. Obviamente, las comparaciones directas de las obras llevadas a cabo con diferentes organismos (incluso diferentes cepas del mismo organismo), medios de comunicación y biorreactores no son viables. Nielsen et al. [25] comentarios sobre esas observaciones contradictorias de la siguiente manera: "Así, sobre la base de nuestro presente los datos experimentales, se concluye que la aglomeración que conduzca a la formación de pellets no es simplemente determinado por la probabilidad de que el contacto físico entre elementos hifales".

Los cambios en las fracciones de los distintos tipos morfológicos o de las características de dispersión de agregados y las formas que pueden ocurrir más en proceso de fermentación fueron más allá del objetivo del presente estudio. También, más allá del objetivo del presente estudio fue el de los cambios observados se relacionan con el rendimiento final de ácido cítrico. Sin embargo, como los presentes resultados sugieren que la morfología de hongos depende en gran medida de inóculo de esporas nivel, puede ser posible que para manipular, a fin de evitar morfologías libremente, como por ejemplo la forma dispersa, que en altas concentraciones de biomasa causa graves problemas reológicas y la baja productividad. Considerando los resultados reportados en el presente estudio, se debe recalcar que estas se aplican a la producción de ácido cítrico A. Níger. Diferentes formulaciones medio de esporas pueden afectar la germinación. Espora stock preparación condiciones son también muy importantes. Y, a pesar de las formas morfológicas similares en diversos microorganismos filamentosos puede ser producido bajo controles similares, es mejor evitar el tratamiento de estos resultados como un fenómeno general. Es muy característico que sólo un pequeño aumento (de 5 × 10 4 a 5 × 10 5 esporas / ml) en P. Chrysogenum concentración de esporas se exigía en el informe de Thomas Tucker y [15] para producir un gran y repentino cambio en la morfología, a partir de pildoradas filamentosos. En el caso del presente informe, A. Niger inóculo de esporas de concentración debería ser aumentado en muchos órdenes de magnitud (de 10 4 a 10 8) para producir resultados similares.

Análisis de la imagen produce un gran número de objetos características, que pueden variar ampliamente durante la fermentación. Estas características sin embargo, no producen por sí mismos información suficiente sobre el estado morfológico. Su combinación, incluido el tiempo de fermentación, por medio de una red neuronal artificial, permite su clasificación en general, tipos de objetos. El análisis de clusters permite la evaluación de la importancia del objeto y sus características combinación óptima para todo tipo de fermentación. La presente investigación reveló que la combinación de un escaso número de características objeto ha significado mucho mayor que el de todas las funciones y esto está de acuerdo con los resultados presentados por Gerlach et al. [12]. Los métodos utilizados en este estudio, permite la cuantificación detallada de la transición entre los dos extremos formas morfológicas. Sería útil, por tanto, en las investigaciones sobre el efecto de las condiciones de cultivo en los primeros avances de esporas inoculadas fermentaciones.

Conclusión

El objetivo del presente trabajo fue cuantificar el efecto del nivel de inóculo de esporas de hongos en la morfología de A. Niger en la importancia comercial de la fermentación de ácido cítrico. Esto se logró mediante la utilización de análisis de imágenes en combinación con una red neuronal artificial y el análisis de agrupamiento. Los métodos utilizados en este estudio, permite la cuantificación detallada de la transición entre la extrema formas morfológicas de los filamentos libres y "pellets". El impacto del nivel de inóculo de esporas en las características morfológicas de cada particular forma producida por el cambio de la concentración de esporas en el inóculo fue alto. Control de la morfología del micelio es a menudo considerado como un requisito previo para la aplicación industrial. La investigación demuestra que se describe aquí se adapta el nivel de inóculo de esporas de manera efectiva los controles de la morfología del micelio.

Materiales y métodos
Material

Compuestos químicos utilizados en este estudio fueron adquiridos a SIGMA-ALDRICH productos de química fina (Missouri, EE.UU.) y Oxoid (Basingstoke, Reino Unido). Los filtros utilizados por la célula de peso seco mediciones fueron por Whatman Internacional (Maidstone, Reino Unido).

Microorganismo, la preparación del inóculo, medio

Un industrial de la cepa Aspergillus niger (A. niger PM1, de la Universidad de Srathclyde) se utilizó a lo largo de este trabajo. Esta melaza se mantuvo en agar, que contiene 300 g / l de melaza de caña (ajustada a pH 6,8), y 18 g / l agar (técnicos, grado 3, Oxoid). Las placas fueron incubadas a 30 ° C durante 7 días. Las esporas se obtuvieron de la cultura madura placas suspensiones de esporas y se diluye con medio estéril a hacer una serie de concentraciones en el orden de 10 4 esporas / ml a 10 9 esporas / ml de los medios de comunicación.

La composición del medio de fermentación fue el siguiente (g / l): D-glucosa, 150; (NH 4) 2 SO 4, 2,5; MgSO4 7H 2 O, 0,5; KH 2 PO 4, 2,0; Fe 3 + [ Como Fe 2 (SO) 4 24H 2 O], 0,1 × 10 -3; Zn 2 + [como ZnSO 4 7H 2 O], 0,1 × 10 -3; Cu 2 + [como CuSO 4 5H 2 O] , 0,06 × 10 -3.

Cultura condiciones

El tanque agitados biorreactor utilizado en el presente trabajo es un 3,0 L de Nueva Brunswick Ciencia BIOFLO 110. El reactor fue equipado con deflectores. La agitación sistema constaba de dos 6-bladded Rushton de tipo rotores (52 mm), que operan en un agitador de velocidad de 400 rpm. Proceso de la temperatura se mantuvo en 28 ° C y la tasa de flujo de aire en el 1 vol / vol / min de aire / medio (vvm). PH fue controlado en el 2,1 por automático de la adición de titrants (2 M de NaOH y 20% de H 2 SO 4 soluciones). Glicol polietileno (MW 2000, SIGMA) se utilizó como antifoam en todas las fermentaciones. Fermentaciones terminada en 150 horas de la inoculación.

Los métodos de análisis

Se determinó el peso seco de filtrado de 20 ml de caldo a través de pre-filtros de fibra de vidrio pesaba (grado GF / C, 4,25 cm, Whatman), el lavado y secado en un horno de microondas (15 min a baja potencia) y de la izquierda en un dessicator para 24 Horas antes de reweighing. El ácido cítrico se determinó por el método de Marier y Boulet [41]. La glucosa se determinó mediante el uso de un glucosa oxidasa / peroxidasa método descrito por Kunst et al. [42].

La concentración de iones de amonio en solución se calculó utilizando un electrodo de amonio (Asea Brown Boveri / Kent Taylor 8002-8). Un protocolo fue desarrollado [35] para permitir la buena reproducibilidad de un gran volumen de muestras y un largo período de tiempo. Las concentraciones de iones de amonio en el micelio se calcularon con el caldo de filtrado y lavado de la torta de filtro con agua del grifo (búfer en el mismo pH como el caldo con HCl). Las células fueron luego re-suspendido en una pequeña cantidad de amortiguación y de las membranas celulares fueron interrumpidas por más adición de metanol a hacer una suspensión de solución de fuerza aproximadamente el 50%. Después de pie durante 24 horas y la eliminación de los sólidos, los iones se midieron con el electrodo.

La glucosamina determinación se realizó por HPLC análisis (utilizando un detector de masa). La concentración serie de normas (siempre por SIGMA, D (+)-La glucosamina Hydrochloride, C 6 H 13 NO 5-HCl, 215.6 MW) fue de 30, 15, el 7,5 y el 3,75 mM y que se analizaron utilizando una columna de Carbohidratos Redex RNM ( Phenomenex, 300 × 7,8 mm) y un detector de masa (Sedex 55). Los estándares utilizados para la glucosa fueron 54, 27, 13,5, y 5,4 mM. La fase móvil fue el agua, el caudal de 0,4 ml / min (0,6 ml / min para la glucosamina). El procedimiento se realizó a los 85 ° C y una presión de 1,9 bares y repitió tres veces. El software utilizado fue el Gilson 715 HPLC.

Análisis y tratamiento de imágenes

Morfología de hongos que se caracteriza por utilizar un semi-automática del sistema de análisis de imágenes que consta de un microscopio Olympus (Olympus, New Hyde Park, NY, EE.UU.) funciona como contraste de fases, una cámara CCD (Sony, Cambridge, UK), un PC con un marco - Grabber, y el software de análisis de imágenes (SIS, Olympus, Alemania). Preparación de muestras y mediciones fueron, tal como se describe en las publicaciones anteriores [18, 19, 43]. Un aumento de 100 × se aplicó para las mediciones de las partículas del micelio. Para cada uno de micelio, el área y perímetro de las mediciones se utilizaron para estimar otros parámetros morfológicos. Estos incluyen la longitud de la ruta más larga conectado a través del micelio (longitud principal), la longitud total de todas las hifas del micelio (longitud total de la imagen skeletonized), el número de consejos, y la unidad de filamentación en el crecimiento (longitud total dividido Por el número creciente de los consejos). Para todos los objetos detectados, las siguientes características evaluadas fueron: área, circularidad, excentricidad, el total de filamentación longitud, y la frecuencia de ramificación. La excentricidad se determinó según Pitas [44]. Clasificación de los objetos detectados se hizo por medio de una red neuronal artificial funciona como un añadido a MS Excel. Cuatro clases de objetos se definen: micelio filamentosos (-1/-1), en bosquetes (-1 / 1), globulares "pellets" (1 / 1) y alargada "pellets" (1/-1). Los números entre paréntesis son los códigos utilizados para la formación de la red neuronal. El entrenamiento de la red neuronal fue realizada por la propagación de vuelta-, la alimentación recomendada para el avance de las redes de Rumelhart et al. [45].

Para evaluar la importancia que la decisión sobre la clasificación de la red neuronal de los diversos parámetros morfológicos, el análisis de agrupamiento se aplicó lo descrito por Gerlach et al. [12]. El análisis de clusters considera un espacio multidimensional de estado compuesto de datos normalizado. Los rangos de los datos de la función objetivo se descompuso primero en grupos del mismo tamaño. Cluster centros fueron formados a partir de los datos en cada una de las agrupaciones y de la distancia de los valores medidos en los respectivos parámetros de la agrupación centro se calculó de acuerdo a criterios geométricos. La clasificación se caracterizó como correctos cuando las distancias de los respectivos datos medidos desde su centro son más pequeños que sus distancias de cualquiera de los otros centros de racimo. Cuando este no es el caso, la clasificación es errónea, con un bajo número de clasificaciones erróneas que indica una estrecha relación de los respectivos parámetros de la función objetivo.

Los cojines y "pellets" se caracteriza, en términos de área, perímetro, compacidad y rugosidad. Compacidad se estima mediante la relación de la superficie de las hifas en el clump / bolita a la superficie total delimitada por su perímetro exterior real [14]. Rugosidad está dada por el factor de circularidad. El porcentaje de micelio en forma de "pellets" de matas y se calculó de acuerdo a Tucker et al. [14]. El hongo crece en partículas esféricas o alargadas, que se distinguen entre pellets y de matas o como árboles individuales del micelio. Según el resultado del proceso morfológico de vigilancia, el volumen de las células se calcula a partir de las proyecciones de superficie de los objetos según Packer et al. [38] y Paul et al. [26].

Fermentaciones se realizaron por triplicado. Para mediciones de la morfología de un promedio de 500 objetos fueron medidos por muestra. Morfológico datos se presentan como valores medios.

Contribuciones de los autores

Ambos autores contribuyeron igualmente en este trabajo