Immunome Research, 2006; 2: 1-1 (más artículos en esta revista)

Modelado de la conformación de obligado Pénfigo vulgar-péptidos asociados a MHC clase II DR y DQ Alelos

BioMed Central
Tong Joo Chuan (victor@bic.nus.edu.sg) [1], Jeff Bramson (ns2003@med.cornell.edu) [3], Darja Kanduc (d.kanduc @ biologia.uniba.it) [3], Selwyn Chow (ssc2001@post.com) [4], Animesh A Sinha (ans2003@med.cornell.edu) [4], Shoba Ranganathan (shoba@els.mq.edu.au) [5]
[1] Department of Biochemistry, The Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 8 Medical Drive, Singapore 117597
[2] Institute for Infocomm Research, 21 Heng Mui Keng Terrace, Singapore 119613
[3] Departamento de Dermatología, Weill Medical College de Cornell University, 525 East 68o Street, Rm. F-340, New York, NY 10021, EE.UU.
[4] Centro de Investigación de Dermatología, de la División de Dermatología y cutánea Ciencias de la Facultad de Medicina Humana, Universidad del Estado de Michigan, 4120 Biomédicas y Ciencias Físicas Building, East Lansing, MI 48824, EE.UU.
[5] Department of Chemistry and Biomolecular Sciences & Biotechnology Research Institute, Macquarie University, NSW 2109, Australia

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Resumen
Antecedentes

El pénfigo vulgar (PV) es una grave enfermedad ampollosa autoinmune se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos dirigidos contra el patógeno desmoglein-3 (Dsg3), en determinados alelos DR4 y DR6 en caucásicos y DQ5 alelo en los asiáticos. El desarrollo de la secuencia basada en algoritmos de predicción para identificar posibles epítopos Dsg3 ha encontrado un éxito limitado debido a la escasez de asociados PV-alelo-específicas como la formación de péptidos de datos.

Resultados

En este trabajo se construyeron modelos atómicos de diez PV asociados, no asociados y de protección alelos. Nueve previamente identificados péptidos estimuladores Dsg3, Dsg3 96-112, Dsg3 191-205, Dsg3 206-220, Dsg3 252-266, Dsg3 342-356, Dsg3 380-394, Dsg3 763-777, Dsg3 810-824 y Dsg3 963 -- 977, se acopló en la ranura vinculante de cada modelo para analizar los aspectos estructurales de alelo-específicas vinculantes.

Conclusión

Nuestro acoplamiento simulaciones son totalmente coherentes con los datos obtenidos de los funcionales in vitro de unión competitiva ensayos y la proliferación de las células T en los estudios DR4 y DR6 PV pacientes. Nuestros resultados cerciorarse de que DRB1 * 0402 desempeña un papel crucial en la selección de determinados péptidos en la libre DR4 PV. DRB1 * 0402 y DQB1 * 0503 no necesariamente comparten el mismo núcleo de residuos, lo que indica que ambos alelos pueden tener diferentes especificidades vinculante. Además, nuestros resultados por la hipótesis de que los alelos DQB1 * 0202 * 0201 y desempeñar un papel de protección por medio de la unión Dsg3 péptidos con una afinidad mayor a los alelos susceptibles, lo que permite un eficiente autoreactive T supresión de las células.

Introducción

Complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II heterodimeric moléculas son glicoproteínas que consta de las cadenas α y β, con la aproximación de masa molecular de 33 kDa y 28 kDa, respectivamente. Moléculas MHC de clase II son receptores especializados péptido que desempeñan un papel crítico en la iniciación y regulación de la respuesta inmune por medio de la unión de fragmentos que se péptido 10-30 aminoácidos largo [1] y presentarlos en la superficie de células presentadoras de antígeno para el reconocimiento de CD4 + Células T. La clase II región codifica los genes para el antígeno leucocitario humano (HLA) o moléculas de histocompatibilidad de clase II genes estructurales DP, DQ y DR [2, 3]. Si bien específicas DP, DQ DR o alelos en el locus HLA de clase II se correlacionan con enfermedades autoinmunes particular, una variedad de factores de confusión incluyendo vínculo fuerte desequilibrio entre los diferentes alelos HLA, especialmente DR y DQ, complica la identificación exacta de MHC Alelos de susceptibilidad.

El pénfigo vulgar (PV) es un peligro la vida de forma ampollosa autoinmune trastornos de la piel debido a la pérdida de integridad de los archivos adjuntos dentro de la normalidad intercelular de la epidermis y la mucosa del epitelio. La enfermedad se caracteriza por la presencia de autoanticuerpos dirigidos principalmente patógenos en contra de un 130-kDa glicoproteína transmembrana, desmoglein-3 (Dsg3) [4], en el espinoso desmosomas de la capa de la piel. Fuerte asociación de la energía fotovoltaica para el complejo principal de histocompatibilidad de clase II serotipos DR4 y DR6 se han reportado en la literatura [5 - 7] con más del 95% de los pacientes con PV que poseen uno o ambos de estos alelos [7]. Direct análisis de la secuencia de nucleótidos DR4 y DR6 subtipos reveló que la susceptibilidad a PV está fuertemente ligada a DRB1 * 0402 y DQB1 * 0503 subtipos moleculares, respectivamente [7, 8].

El uso de técnicas computacionales ha sido fundamental en la promoción de epítopo vacuna basada en la investigación, con mucho trabajo se centra en la predicción de las características específicas de péptidos vinculante a las moléculas MHC. Secuencia basada en los sistemas de predicción, basado en la identificación de patrones de péptidos en determinado experimentalmente con fuerza vinculante, se utilizan ampliamente para facilitar la identificación de los péptidos vinculante a las moléculas MHC de clase II. Southwood et al. [9] desarrolló una matriz de calificación para DRB1 * 0401 sobre la base de un polinomio técnica. Mallios [10, 11] informó de los resultados de un análisis discriminante por pasos iterativos meta-algoritmo para identificar aglutinantes de la falta de carpetas para DRB1 * 0101. Brusic et al. [12] un algoritmo genético aplicado a discriminar aglutinantes de la falta de carpetas para DRB1 * 0401. Noguchi et al. [13, 14] utilizado tanto difuso de redes neuronales y modelos ocultos de Markov para predecir posibles aglutinantes para DRB1 * 0401 y DRB1 * 0101. Hammer et al. [15] empleado un péptido de cadena lateral técnica para la detección de escaneo péptidos que interactúan con el DRB1 * 0401. Nielsen et al. [16] Gibbs utilizó un método de muestreo para discriminar DRB1 * 0401 carpetas específicas de la falta de aglutinantes. Karpenko et al. [17] hicieron uso de un sistema de colonia de hormigas para buscar DRB1 * 0401 vinculantes y no vinculantes péptidos. Doytchinova y Flor [18 0401 0101 0701 basado en la suma de las contribuciones de los aminoácidos en cada posición de los sujetos y de diversos péptidos Interacciones entre ellos. Sin embargo, a pesar de los recientes avances en la secuencia basada en las técnicas de predicción, los modelos de cálculo para la mayoría de los alelos PV implicados han sido insuficientes, debido principalmente a la escasez de suficientes datos de péptidos como la formación, y no son adecuados para predecir la unión a péptido PV alelos implicados. Además, la mayoría de los métodos de cálculo sólo se centran en la predicción de péptidos aglutinantes y no aglutinantes, mientras que nuestro objetivo es distinguir entre los diferentes modos de vinculante conferido por susceptibles de protección y alelos.

Un enfoque alternativo para la predicción de péptido / MHC (pMHC) complejos sin la necesidad de formación de un gran conjunto de datos es utilizar la información derivada de las estructuras tridimensionales. Logean y Rognan [19] utilizó un combinatoria edificadas, algoritmo para la construcción de la estructura tridimensional de complejos de pMHC. Altuvia et al. [20] informó de la utilización de un método de cálculo de roscado para clasificar potencialmente vinculante péptidos a las moléculas MHC de clase I. Lim et al. [21] emplean simulaciones de dinámica molecular para examinar las estructuras de A * 0201 en el complejo con 9-mer péptidos. Michielin et al. [22, 23] aplica homología de modelado para seleccionar péptidos que se unen a A * 0201.

Además de predecir las características específicas de péptidos vinculante para las moléculas MHC, modelos tridimensionales se han utilizado también para la clasificación estructural de los alelos HLA en "supertypes" sobre la base de características estructurales derivados de los sitios de unión. Recientemente, Doytchinova et al. [24, 25] empleado jerárquico de agrupaciones y análisis de componentes principales para clasificar alelos sobre la base de características estructurales en ocho HLA clase Iy clase II HLA doce supertypes. La clasificación estructural de alelos facilita la identificación de subgrupos alélica que pueden compartir similares características específicas y vinculantes en esclarecer su posible papel en la inmunidad celular contra agentes patógenos.

En el presente estudio, hemos tratado de comprender la correlación funcional entre alelos MHC clase II y PV, desde un punto de vista estructural interacción. Modelización molecular de diez PV asociados y no asociados receptores MHC clase II (DR4: DRB1 * 0401 *, 0402 *, 0404 *, 0406, DR6 (también clasificada ahora como DR14): DRB1 * 1401, 1404 *, 1405 *, DQ2 : DQB1 * 0201, * 0202 y DQ5: DQB1 * 0503) se realizaron para estudiar la estructura de la organización de la unión de estos alelos groove. Nueve previamente identificado epítopos, Dsg3 96-112, Dsg3 191-205, Dsg3 206-220, Dsg3 252-266, Dsg3 342-356, Dsg3 380-394, Dsg3 763-777, Dsg3 810-824 y Dsg3 963-977 ( Numerados de acuerdo con Swiss-Prot [26] número P32926), capaces de estimular las células T derivadas del paciente, se seleccionaron. La unión de estos péptidos a la DR y DQ estructurales de los modelos estudiados por nuestro eficiente computacional de acoplamiento de protocolo [27]. A la luz derramada por estos modelos atómicos, la obligatoriedad especificidades de cada alelo a los diferentes péptidos se discuten Dsg3. Los resultados obtenidos en el estudio son capaces de discriminar entre PV asociados y no asociados alelos, en consonancia con los resultados experimentales obtenidos por Veldman et al. [28] y Sinha et al. [Resultados no publicados para Dsg3 342-356, 810-824 y 963-977]. Insights en características estructurales detrás de la respuesta inmune protectora proporcionada por alelos de PV también han sido obtenidos por nuestro enfoque estructural inmunoinformática.

Resultados y discusión
Alelo comparaciones - HLA DR4 PV

La secuencia de identidad entre los alelos DR4 (excluyendo DRB1 * 0401) con sus correspondientes plantillas varía de 97,9 a 99,0%, y la similitud de secuencias (en representación de idéntica forma conservadora y sustituir los residuos) se situaba entre el 98,4 y el 99,5% (Cuadro 1]. Los cinco importantes péptido vinculante bolsillos 1, 4, 6, 7 y 9 muestran extremadamente alta de conservación estructural en el C α posiciones, lo que sugiere que la discriminación de cualquier péptido líder epítopo a la selección entre los alelos se debe principalmente al tamaño y la naturaleza de las cadenas laterales Del bolsillo de los residuos. Con el fin de aislar la verdadera enfermedad de las alelo dentro de un haplotipo, en comparación residuos específicos en los bolsillos polimórficos considerarse de importancia de conferir especificidad para la presentación antigénica (Figura 1]. 1 bolsillo, que se caracteriza por un Val / Gly β86 dimorfismo, es la cavidad más profunda y, por lo tanto, lo más importante ancla para el péptido vinculante [29]. Además, la especificidad funcional de las moléculas DR4 también se ve afectada por los polimorfismos en la posición β70, β71, β74, que contribuyen al bolsillo 4. Dos residuos de carga negativa en la posición β70 y β71 que anteriormente se propuso para influir en la selectividad péptido PV en los pacientes [30] se puede encontrar en el DRB1 * 0402 (Asp β70 y Glu β71), sino una carga positiva Arg / Lys β71 se encontró en DRB1 * 0404 *, 0406 * y 0401. Polimorfismo de aminoácidos también se puede observar en la posición β11 de bolsillo 6, β71 de bolsillo 7 y β37 de bolsillo 9, respectivamente.

Alelo comparaciones - HLA DR6 PV

Estudio de las distintas frecuencias de los alelos en DR6 PV pacientes reveló que la susceptibilidad a la enfermedad alelo DQB1 * 0503 es lugar de alelos DR6 [Sinha et al., Manuscrito en preparación]. DQB1 * 0503 y la DR6 PV no asociados alelos investigados en este estudio muestran un importante grado de coincidencia en la alineación, con 14 aminoácidos diferencias en las zonas de la fisura vinculante que pueda afectar péptido vinculante. Claras diferencias en las secuencias de aminoácidos que se observan en los residuos β86 de bolsillo 1, residuos β13, β70, β71, β74, β78 de bolsillo 4, de residuos β11 de bolsillo 6, residuos β28, β30, β67, β71 de bolsillo 7 y residuos β9 , Β37, β57, β60 de bolsillo 9. Similar a los alelos DR4, los cinco importantes péptido vinculante bolsillos 1, 4, 6, 7 y 9 en 0503 y DBQ1 * DR6 alelos demostrar excepcionalmente alta de conservación estructural en el C α posiciones. Una diferencia importante es que DQB1 * 0503 contiene una carga negativa Asp β57 que difiere de la de descarga Ala β57 encuentra en la no-PV asociados DRB1 * 1401 y * 1404. También, en las posiciones β70 y β71, DQB1 * 0503 no contiene residuos de carga negativa identificados en DRB1 * 0402 que son fundamentales para la libre unión de los antígenos en pacientes DR4 PV. En lugar de ello, estas posiciones fueron sustituidos por dos pequeños hidrofóbico neutral residuos (β70 Gly y Ala β71), lo que sugiere que DRB1 * 0402 y DQB1 * 0503 podrá reconocer las diferentes conjuntos de epítopos PV bajo la influencia de un equilibrio diferente de las fuerzas intermolecular. Posiciones β70 y β74 presenta, se cargará la inversión, en el PV no asociados DRB1 * 1401 *, 1404 * y 1405 alelos mientras que la carga negativa en β71 se conserva por sí solo, en comparación con el DRB1 * 0402, el 4 de toma de bolsillo único factor dominante de discriminar entre PV No de asociación y de la susceptibilidad.

Alelo comparaciones - PV y susceptibles de protección alelos

Las diferencias en las secuencias de aminoácidos que se observan en los residuos β86 de bolsillo 1, de residuos β70, β71 de bolsillo 4, residuos β28, β30, β47, β71 de bolsillo 7 y residuos β37, β57 de bolsillo 9. Los dos alelos de protección (DQB1 * 0201 y DQB1 * 0202) no contienen residuos de carga negativa en la posición β70 (bolsillo 4) y β71 (bolsillo 7). En lugar de ello, estas posiciones fueron reemplazados por dos grandes de carga positiva y aminoácidos (Arg β70 y Lys β71). Las características específicas de la energía fotovoltaica y susceptibles de protección alelos también se ven afectados por claras diferencias estructurales en el C α posiciones de las dos cadenas α y β (C α RMSD> 0.57Å), indicando que las diferencias en la discriminación entre el péptido alelos se debe a una combinación de Tanto la columna vertebral de conformación, así como el tamaño y la naturaleza de las cadenas laterales de los residuos de bolsillo.

Epítopo comparaciones - HLA DR4 PV

Ocho previamente identificados estimulantes Dsg3 epítopos (Dsg3 191-205, Dsg3 206-220, Dsg3 252-266, Dsg3 342-356, Dsg3 380-394, Dsg3 763-777, Dsg3 810-824 y Dsg3 963-977) para DRB1 * 0402 se acopló a la unión de todos los groove DR4 (DRB1 * 0401 *, 0402 *, 0404 *, 0406) alelos investigados en este estudio. El análisis de estos péptidos Dsg3 determinada alelos reveló que sólo un péptido conformación puede encajar perfectamente en la hendidura vinculante de DRB1 * 0402, y de estos enfrentamientos atómica Dsg3 péptidos que se obtengan para todos los demás subtipos DR4 investigados en este estudio. En particular, dos epítopes (Dsg3 342-356 y Dsg3 810-824) han reducido los residuos (Ser / Cys) en el bolsillo de 1, lo que sugiere que gran ancla residuos pueden desempeñar un papel fundamental para la alta afinidad obligatorio en DR4 PV moléculas, una observación previamente documentada De la gripe asociada a IA d alelo de ratones [31]. Este hallazgo proporciona apoyo a la evidencia de que DRB1 * 0402 se asocia con DR4 PV mientras que otros subtipos son no asociados, con la excepción de DRB1 * 0406 que se informa, está asociada en la población japonesa [32]. Como tal, existe la posibilidad de la existencia de otros péptidos pertinentes en el japonés poblaciones que se unen a * 0406, pero aún no se han determinado.

Epítopo comparaciones - HLA DR6 PV

Dsg3 96-112, un epitopo identificado recientemente en DR6 PV pacientes [28], encaja perfectamente en la ranura vinculante de DQB1 * 0503, con dos secuencias básicas identificadas en residuos de los residuos 102-110 y 101-109. El núcleo identificado 101-109 intermolecular de hidrógeno tiene cuatro bonos en comparación con siete de hidrógeno intermolecular bonos en el núcleo de 102-110. Perfecta adaptación de Dsg3 206-220, Dsg3 252-266, Dsg3 342-356, Dsg3 810-824 y 963-977 en la Dsg3 vinculante groove de DQB1 * 0503 es también obtenidos. Atómica enfrentamientos se obtienen para Dsg3 191-205, Dsg3 380-394 y Dsg3 763-777, así como todos los alelos DR6 investigados en este estudio. La proporción de DRB1 * 1401 *, 1404 * 1405 y ha informado de que se incremente en PV probablemente debido a la vinculación desequilibrio. La falta de unión de todos los péptidos estimuladores investigados en este estudio a estos alelos HLA indica que la asociación en DR6 PV pacientes es más probable en el DQB1 locus (alelo DQB1 * 0503) y no vinculados DRB1 loci (DRB1 * 1401, 1404 * Y * 1405). Nuestros datos apoyan la noción de que la informó de las asociaciones de esta enfermedad con el DRB1 * 1401, 1404 *, 1405 * se deben al desequilibrio vinculación con la verdadera enfermedad asociada alelo (DQB1 * 0503).

Epítopo comparaciones - PV susceptibilidad Alelos

Nuestro acoplamiento simulaciones muestran una fuerte evidencia de que DRB1 * 0402 y DQB1 * 0503 puede obligar a los diferentes conjuntos de epítopos PV mediante el reconocimiento de las diferentes secuencias de péptido básico en el surco vinculante (cuadro 2]. Tres PV epítopos (Dsg3 191-205, Dsg3 380-394 y Dsg3 763-77) sólo puede obligar a DRB1 * 0402, cuatro PV epítopos (Dsg3 206-220, Dsg3 252-266, Dsg3 342-356 y Dsg3 810-824 ) Puede obligar a los dos alelos con diferentes secuencias de péptidos básicos, uno PV epítopo (Dsg3 963-977) puede obligar a los dos alelos con la misma secuencia de péptido básico, y un epitopo PV (Dsg3 96-112) sólo puede obligar a DQB1 * 0503 . DRB1 * 0402 y DQB1 * 0503 podrá reconocer el mismo epitopo Dsg3 en dos únicos conjuntos de secuencias básicas (que puede ser en la proximidad) en el mismo epitopo. Estos resultados están completamente de acuerdo con los datos experimentales [28].

Epítopo comparaciones - PV protección alelos

Nuestros resultados indican que la simulación DQB1 * 0201 y DQB1 * 0202 puede unirse a múltiples secuencias básicas para la mayoría de los epítopos PV investigados en este estudio. DQB1 * 0201 puede obligar a un epitopo (Dsg3 963-977) en dos regiones clave, un epitopo (Dsg3 206-220) en tres principales regiones, tres epítopos (Dsg3 191-205, 252-266 y 342-356), en cuatro centrales Regiones, y dos epítopes (Dsg3 96-112 y 810-824) en cinco regiones. DQB1 * 0202 puede obligar dos epitopos (Dsg3 96-112 y 963-977) en tres principales regiones, dos epítopes (Dsg3 342-356 y 810-824) en cuatro regiones centrales y un epitopo (Dsg3 252-266) a los cinco principales Regiones. En contraste, la mayoría de los epítopos PV (con la excepción de Dsg3 96-112 y 252-266) puede obligar a PV susceptibles alelos DRB1 * 0402 y DQB1 * 0503, en un único núcleo. Este hallazgo apoya la hipótesis de que la protección alelos DQB1 * 0201, * 0202 pueden ser capaces de unirse a la mayoría de péptidos con una afinidad mayor PV susceptibles alelos, lo que permite un eficiente autoreactive supresión de las células T [33].

Papel de los residuos de acompañamiento en la selección péptido

Nuestros datos demuestran que la conformación de acompañamiento péptido residuos que se extienden más allá de la unión groove son fundamentales para la selección de péptidos MHC clase II alelos. Las principales secuencias de Dsg3 963-977 encaja perfectamente dentro de la obligatoriedad de alojamientos no asociados alelos DRB1 * 0401, * 0404, 1404 * y pobres, pero los contactos con los respectivos alelos en Phe α50 se obtienen cuando la conformación de la N-terminal de acompañamiento Ile4 de residuos se tenga en cuenta. Estos resultados sugieren que la unión es determinado por tanto el núcleo de acompañamiento y de los sectores, al considerar el global de la interacción entre cada uno de los péptidos y los respectivos alelos.

Secuencia de motivos

Epítopo secuencia basada en la predicción se basa en la identificación de la secuencia de motivos de los datos experimentales disponibles. La correlación de los residuos con el péptido básico obligatorio por motivos previamente definidos Veldman et al. [28] y Sinha et al. (Resultados no publicados) se muestra en la Tabla 3, para comprender en qué medida los enfoques basados en la secuencia será válida con especial referencia a la energía fotovoltaica. La secuencia de conservación observado aquí es demasiado bajo para justificar la generación de un consenso secuencia patrón.

Péptido VII (Dsg3 763-777) y de acuerdo con los motivos de Veldman et al. [28] y Sinha et al. (Resultados no publicados), mientras que el resto de péptidos muestran una baja a moderada cumplimiento. De las cuatro posiciones en comparación, péptido IV (Dsg3 252-266) muestra acuerdo sólo en la posición p6. Por Dsg3 342-356 péptido, el núcleo nonamer identificados por nuestros modelos es 346-354, que se pasó por registro de un residuo de la base de 347-355 informó por Veldman et al. [28], y 345-353 identificados por Sinha et al. (Resultados no publicados), de la obligatoriedad de groove * 0402. Este cambio es fundamental como residuos p1 y p4 identificados por nosotros no encajan bien en ambos motivos vinculante. Nuestros estudios sugieren que el modelado de péptido posición p4 no necesitan ser cargados positivamente a lo indicado por Veldman et al. [28], el apoyo a la existencia de un motivo más degenerada por Sinha et al. (Resultados no publicados) en esta posición. Además, p1 también parece ser más que degenerar sugerido anteriormente [28], que muestra una preferencia por hidrofóbico y residuos grandes, pero pueden acomodar los residuos de otros tamaños también. De ahí que para la generación de la secuencia de los patrones de diseño de péptidos para el diseño de vacunas, información estructural es importante [34] y el péptido exacto en el surco vinculante identificados por nuestro protocolo de acoplamiento será más útil aquí.

Progresión de la enfermedad en PV

T respuesta celular a un número de epítopos entre PV pacientes ha reportado en varios estudios [2, 8, 26, 29, 30]. Puede haber heterogeneidad de la enfermedad, lo que significa que clínicamente similares pero distintos fenotipos podría funcionar por las vías alternas, cada una con diferentes inicial inmuno epítopo (s). El diferencial de células T reactividad, entre los pacientes individuales a los distintos péptidos puede ser también una función de la etapa de la enfermedad o la gravedad y la correlación con los mecanismos de progresión de la enfermedad. Si bien puede haber un número limitado de epítopos presentes en los pacientes en las primeras etapas de la enfermedad, la difusión de epítopo puede ocurrir durante la progresión de la enfermedad, lo que resulta en la reactividad a los epítopos anteriormente inocua. Además, la reactividad, a múltiples epítopos dentro de los pacientes se detectó en dos casos (Dsg3 191-205 y 342-356 para PV107; Dsg3 191-205, 810-824 y 963-977 para PV117). Autoanticuerpos contra desmoglein 1 también se ha informado de graves de la enfermedad [35]. Otra incidencia de múltiples células T reactividad, en un PV paciente ha sido informado anteriormente [29]. Estos hallazgos, junto con nuestros resultados de la simulación, se presta más credibilidad a la hipótesis de que no solo epítopo es responsable de la enfermedad de iniciación y propagación, y son consistentes con el comportamiento esperado y observado capacidad de generar múltiples pMHC complejos desde un único objetivo autoantígeno.

Conclusión

Docking simulaciones en el sitio de unión de PV asociados y no asociados DR y DQ alelos se han realizado para analizar los aspectos estructurales de carácter vinculante y alelo-especificidad de nueve previamente identificados Dsg3 epítopos. Representar a la posibilidad de que cualquier núcleo péptido secuencias pueden ser reconocidos por la ranura vinculante de alelos MHC de clase II, un deslizamiento ventana se aplicó para generar todas las posibles combinaciones de péptidos nonamer núcleo de cada péptido Dsg3. Este método puede eliminar cualquier sesgo en la selección de péptidos básicos sobre la base de patrones de secuencias solo.

Nos hemos dado cuenta de la existencia de ajuste óptimo básico residuos en diferentes posiciones de cada péptido (con excepción de Dsg3 96-112) en la ranura vinculante de DRB1 * 0402, sin observarse atómica choque penas o malos contactos. En cambio, los enfrentamientos atómicas tienen experiencia en todos los demás PV no asociados alelos DR4. Esta discriminación establece, además, el papel crucial que desempeña DRB1 * 0402 en la selección de los auto-péptidos en DR4 PV. Además, encontramos que DRB1 * 0402 y DQB1 * 0503 no necesariamente comparten el mismo núcleo residuos. Es posible que el DRB1 * 0402, DQB1 * 0503, y todas las demás PV no asociados alelos pueden tener diferentes conjuntos de características específicas vinculantes. Nuestros estudios indican también que la perfecta adaptación de la central nonameric péptido residuos dentro de la ranura vinculante de alelos MHC clase II no podrá garantizar la perfecta colocación de la totalidad de péptido, de acompañamiento y de los residuos fuera de la ranura vinculante puede desempeñar una parte fundamental en la selección péptido. Tales interacciones vinculante sugieren que la ampliación de péptidos más largo de la ranura vinculante de MHC clase II alelos deben tenerse en cuenta en la generación de HLA de clase II motivos y vinculante para el diseño de vacunas.

La comparación de los principales residuos péptido vinculante con motivos definidos previamente por Veldman et al. [28] y Sinha et al. (Resultados no publicados) indica que la secuencia de los métodos basados en la actualidad son insuficientes para el diseño de PV epítopos como hay tanto registro de los cambios en la propuesta de los motivos, así como polimorfismo observado en el centro de residuos en el surco vinculante. Más datos experimentales sean necesarios para la definición de DR4 y DR6 PV vinculante motivos específicos.

La metodología que aquí se presenta puede servir como un método general apropiado para la búsqueda de péptidos alélicas específicas, aplicables al diseño de las dos sub-tipo específico de vacunas, así como promiscuas péptido epítopos. En particular, este enfoque es útil en situaciones en las que no existan datos suficientes para la formación de secuencias basados en modelos de predicción. En el contexto de PV, este enfoque proporciona un medio para discriminar entre péptido aglutinantes y no aglutinantes para un número de PV implicados alelos que la formación es deficiente. Nuestros resultados apoyan la hipótesis [33] que los alelos DQB1 * 0202 * 0201 y desempeñar un papel de protección por medio de la unión Dsg3 péptidos con una afinidad mayor a los alelos susceptibles, facilitando la supresión eficaz de las células T autoreactive. Con cada vez más pruebas que indican que no solo epítopo pueden ser responsables de la enfermedad tanto en la iniciación y propagación de PV, es valiosa para identificar todos Dsg3 péptidos que se unen a los alelos susceptibles PV. En concreto, la identificación de los péptidos que se unen a ambos DRB1 * 0402 y DQB1 * 0503 son de gran importancia ya que estos péptidos pueden servir como objetivos para epítopo basada en la vacunación terapéutica de los dos DR4 y DR6 PV pacientes. El trabajo futuro incluirá autoantigens de Dsg1, el principal agente causal de pénfigo foliáceo y en los casos graves de la energía fotovoltaica.

Materiales y métodos
Plantilla de búsqueda

En este estudio, diez PV asociados, en estrecha relación no asociados y de protección de MHC clase II alelos DRB1 * 0401 *, 0402 *, 0404 *, 0406 *, 1401 *, 1404 *, 1405, DQB1 * 0201, * 0202, y * 0503 fueron seleccionados para el análisis. MHC secuencia de los datos se obtuvieron de IMGT-HLA http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ base de datos [36]. La cadena α DR alelos de todos los investigados en este estudio es la secuencia DRA1 * 0101, con la cadena β del alelo sub-tipo. Para determinar los posibles estructurales de las plantillas disponibles en el Protein Data Bank (PDB) [37] para el modelo de edificio, una secuencia de búsqueda de similitudes se realizó a través de PSI-BLAST [38] se están ejecutando en los servidores en el NCBI http://www.ncbi.nlm. Nih.gov / explosión / y de la más alta calidad de las plantillas fueron seleccionados entre los resultados que se muestran. Entre estos, el cristal de las estructuras de HLA-DR4 (AP código 1D5Z) y HLA-DQ2 (AP código 1S9V) se aprobaron como de las estructuras de DRB1 * 0401 y DQB1 * 0201, respectivamente (100% de identidad de secuencia). El cristal de las estructuras de DRB1 * 0401 (AP código 1D5Z), DQB1 * 0602 (AP código 1UVQ) y DQB1 * 0201 (AP código 1S9V) fueron seleccionados como modelos para todos los demás subtipos DR, DQB1 * 0503 y DQB1 * 0202, respectivamente (Cuadro 1].

Modelo de construcción

El programa MODELLER [39], fue empleada para el modelado comparativo de ambos DRB1 (* 0402 *, 0404 *, 0406 *, 1401 *, 1404 *, 1405) y DQB1 (* 0202, 0503 *) subtipos. Los modelos son construidos por satisfacer óptimamente limitaciones espaciales obtenidos de la adaptación de la estructura de la plantilla con el objetivo de la secuencia y CHARMM campo de fuerza-22 [40]. El modelo inicial se perfeccionó mediante la asignación de los estados rotameric parte esencial de las cadenas de acuerdo con la correspondiente estructura de cristal, seguido por una breve minimización de la energía [41] del programa Interna Coordina Mecánica (ICM; Molsoft LLC, San Diego, CA) [42] .

Paciente de contratación y agrupaciones

Los pacientes y los controles fueron reclutados de clínicas de la Dermatología en el Hospital Presbiteriano de Nueva York (Campus de Cornell, Nueva York, NY). HLA tipificación se realizó en el Instituto Rogosin, New York Presbyterian Hospital, NY. Los controles fueron sin enfermedad y fueron los tipos HLA DRB1 * 0402 (n = 1), o DRB1 * 0402 y DQB1 * 0503 (n = 1), mientras que los pacientes PV mecanografiada como DRB1 * 0402 (7 / 9), DRB1 * 0402 y DQB1 0503 * (1 / 9), o DQB1 * 0503 (1 / 9) (Cuadro 4].

Péptido establecido

Nueve previamente identificados epítopos Dsg3 96-112, 191-205, Dsg3 206-220, Dsg3 252-266, Dsg3 342-356, Dsg3 380-394, Dsg3 763-777, 810-824 y Dsg3 que suscitó Dsg3 963-977 primaria Respuesta proliferativa de células T en pacientes con PV [2, 8, 26, 29, 30] fueron seleccionados para estudios de modelado. T respuesta celular a ocho de estos péptidos (Dsg3 191-205, Dsg3 206-220, Dsg3 252-266, Dsg3 342-356, Dsg3 380-394, Dsg3 763-777, Dsg3 810-824 y Dsg3 963-977) ha Sido reportados en pacientes portadores de DRB1 * 0402. Dsg3 96-112 ha informado de que trate de obtener respuesta de células T en pacientes con DQB1 * 0503, pero que carecen de DRB1 * 0402 [28]. De estos Dsg3 191-205, Dsg3 342-356, Dsg3 810-824 y 963-977, se mostró Dsg3 directamente a obligar a la DRB1 * 0402 receptor de los ensayos de unión competitiva (Sinha et al., Resultados no publicados). En pocas palabras, soluble HLA DRA1 * 0402 * 0101/DRB1 fueron purificados por el DR-cromatografía de afinidad específicos y se incubaron con diferentes concentraciones de péptidos experimental (0-40 μ M), en presencia de biotina clase II-asociados-invariante cadena peptídica (CLIP) ( 1 μ M) por 2 horas. La MHC-péptido complejos fueron capturados en una placa de 96 pocillos recubiertos con anti-HLA-DR (L243) (BD Pharmingen, San Diego, CA). El CLIP obligado a la moléculas MHC fue directamente ensayada mediante Europium (Eu)-etiquetados streptavidina (Perkin Elmer, Boston, MA). La relativa unión de los péptidos se determinó midiendo el desplazamiento de la CLIP a diferentes concentraciones de péptido.

Péptido de acoplamiento

Análisis de los motivos http://www.syfpeithi.de vinculante [43], y las estructuras de cristal disponible sugiere un núcleo región de los nueve aminoácidos esenciales para vinculantes. Sobre la base de esta observación, un deslizamiento de entrada de la ventana de tamaño nueve (Figura 2] se aplica a generar todas las combinaciones de residuos nonameric básico péptido que se modela en la ranura vinculante de cada alelo. Cada núcleo péptido fragmento es vinculante atracó en la ranura en un protocolo de tres pasos descritos en un estudio anterior [27]. En breve, de acoplamiento de los principales péptido residuos se realiza de la siguiente manera: (i) básico péptido fragmentos en los extremos de la ranura es vinculante acopló usando ICM sesgada procedimiento de Monte Carlo, seguido por (ii) bucle de cierre de péptido básico de satisfacción de los residuos espaciales Limitaciones, y finalmente (iii) el perfeccionamiento de la espina dorsal y parte de las cadenas de péptidos residuos núcleo atómico, así como a los receptores de choque regiones. A continuación, los residuos de acompañamiento se extienden desde el núcleo péptido residuos utilizando ICM sesgada procedimiento de Monte Carlo. La función de calificación aprobado empírico [44, 45] tiene en cuenta electrostatics continuo y discreto, y hidrofóbico y la pérdida de entropía [45, 46]. Esta metodología permite una rápida y precisa de acoplamiento de péptidos con un promedio de tiempo de cálculo de aproximadamente 18 minutos para completar el modelado de cada péptido en una CPU 4-SGI 3200 Origen de trabajo. Para cada ligando, la mejor solución se obtiene sobre la base de los siguientes criterios: características del enlace de la molécula MHC, patrón de entierro de péptido hidrofóbico cadenas laterales, y la ausencia de enfrentamientos atómica o repulsivo contactos.

Definición de contacto con los residuos

En este estudio, MHC-péptido residuos se consideran en contacto si por lo menos un par de sus no-hidrógeno ( "pesadas") los átomos se encontró dentro de 4.00Å Radio [47]. Intra-péptido interacciones y dentro de las interacciones MHC no se consideraron, ya que tienen menor influencia en péptido / proteína de estructura de base. Cualquier átomo en el péptido y de cualquier átomo en el MHC se consideraban experimentando choque atómicas si su separación es inferior a 2.00Å [48] por falta de átomos de hidrógeno y por debajo de 1.60Å para participar en los átomos de hidrógeno bonos [49, 50].

Definición de bolsillo vinculante para alelos MHC clase II

Las interacciones entre las partes de las cadenas de péptidos obligado ligandos polimórficos y cavidades (ancla o "focos") en el sitio de unión de los alelos de MHC clase II son importantes para determinar el péptido afinidad y especificidad de la secuencia de las moléculas MHC y se definen de acuerdo a la labor De Stern et al. [51, 52].

Lista de abreviaturas

PV: Pénfigo vulgar

Dsg3: Desmoglein-3

MHC: complejo principal de histocompatibilidad

HLA: antígeno leucocitario humano

Contribuciones de los autores

JCT llevó a cabo el modelado y la homología de acoplamiento estudios y redactado el manuscrito. JB, DK y SC llevó a cabo la inmunorreactividad. AAS y AR participó en el diseño del estudio. AR desarrollado el proyecto y finalizó el manuscrito.