BMC Veterinary Research, 2006; 2: 7-7 (más artículos en esta revista)

La resistencia antimicrobiana de Escherichia coli aisladas de pollos de engorde y los seres humanos

BioMed Central
Tricia D Miles (miamud@yahoo.com) [1], Wayne McLaughlin (wayne.mclaughlin @ uwimona.edu.jm) [2], Paul Brown D (paul.brown @ uwimona.edu.jm) [2]
[1] División de Servicios Veterinarios, Ministerio de Agricultura, Hope Gardens, Jamaica
[2] Departamento de Ciencias Médicas Básicas, la Sección de Bioquímica, Universidad de las Indias Occidentales, Mona, Kingston 7, Jamaica

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Resumen
Antecedentes

Uso de los antimicrobianos se considera el factor más importante a la promoción de la emergencia, la selección y difusión de los microorganismos resistentes a los antimicrobianos en tanto la medicina humana y veterinaria. El objetivo de este estudio fue investigar la prevalencia y la base genética de la resistencia a la tetraciclina en fecal Escherichia coli aisladas de pollos de engorde sanos y comparar estos datos con los aislamientos obtenidos de pacientes hospitalizados en Jamaica.

Resultados

Ochenta y dos E. Coli aisladas de muestras de heces de pollos para asar y de la orina y muestras de heridas de los pacientes hospitalizados fueron analizados por disco difusión en agar para determinar sus patrones de susceptibilidad a 11 antimicrobianos. Los factores determinantes de la resistencia a la tetraciclina fueron investigados por el plásmido de perfiles, transformaciones, y la amplificación de plásmidos tener genes de resistencia. Resistencia a la tetraciclina se produjo con una frecuencia de 82,4% en comparación con cepas aviares 43,8% de las cepas humanas. Además, entre los aislados aviar hubo una tendencia hacia mayores frecuencias de resistencia a kanamicina y ácido nalidíxico (p <0,05), mientras que un mayor porcentaje de los aislados fueron resistentes al cloranfenicol y gentamicina (p <0,05). Resistencia a múltiples drogas se encontró en los aislamientos de ambas fuentes y por lo general se asocia con la resistencia a la tetraciclina. Aislamientos resistentes a tetraciclina de ambas fuentes de la gripe aviar y la humana figura uno o varios plásmidos, que son transmisibles por transformación de la química-competente E. Coli. Resistencia a la tetraciclina fue mediada por flujo de salida tetB tetB genes y / o tetD tetD.

Conclusión

El presente estudio pone de manifiesto la existencia de múltiples drogas resistentes E. Coli saludable entre los pollos de engorde en Jamaica, posiblemente asociadas a la expresión de la resistencia a la tetraciclina. Si bien no parece ser una fuente común de la resistencia a múltiples drogas en las cepas de origen aviar o humana, la codificación de los genes de resistencia son similares. Estos resultados sugieren que los genes se difunden en el medio ambiente y justificar una investigación más a fondo de la posibilidad de que las fuentes aviar actúan como reservorios para la resistencia a la tetraciclina.

Antecedentes

Uso de antimicrobianos es posiblemente el factor más importante que promueve el surgimiento, la selección y difusión de los microorganismos resistentes a los antibióticos tanto en la medicina humana y veterinaria [1, 2]. Esta resistencia adquirida se produce no sólo en bacterias patógenas, pero también en la flora endógena de los individuos expuestos (animales y seres humanos) o poblaciones [3 - 6]. En cría intensiva de alimentos animales, los antibióticos pueden administrarse a toda persona en vez de los rebaños de animales, y los agentes antimicrobianos pueden ser alimentados continuamente a los alimentos animales como pollos y pavos como los antibióticos promotores del crecimiento. Por lo tanto, la presión de selección de antibióticos para la resistencia en las bacterias en las aves de corral es alta y, por consiguiente, su flora fecal contiene una proporción relativamente alta de bacterias resistentes [7].

En Jamaica, el pollo se considera el más produce y consume proteínas de carne, cinco veces más que el sector de la carne y 10 veces más de carne de cerdo. Durante el período 1998 - 2002, Jamaica local de la producción avícola dado aproximadamente 380 kg M con un valor monetario de casi 90 mil millones de dólares [8]. Chicken explotaciones se distribuyen ampliamente en toda la isla y la mayoría se encuentra en la costa sur y las grandes operaciones comerciales que representan el 65-70% del total de la producción de pollos de engorde [8]. Así, el alto consumo de carne de pollo merece gran atención en la protección de la industria contra los factores que amenazan.

En la masacre, de cepas resistentes del tubo digestivo puede contaminar las canales de aves de corral y, en consecuencia, las carnes de aves de corral a menudo se asocian con multirresistentes E. Coli [9 - 11]; también los huevos se contaminan durante la construcción [12]. Por lo tanto, resistentes a los antimicrobianos fecal E. Coli de las aves pueden infectar a los seres humanos tanto directamente como a través de la alimentación. Aunque raros, estos resistentes bacterias pueden colonizar el tracto intestinal humano y puede contribuir también a los genes de resistencia a la flora endógena humana.

Sin embargo, el mecanismo de propagación de la resistencia a los antibióticos de la alimentación animal al hombre sigue siendo controvertido. La colonización del tracto intestinal con resistencia E. Coli de pollo se ha demostrado en voluntarios humanos [13] y no hay pruebas históricas de que los animales son un reservorio de E. Coli se encuentra en los seres humanos [14]. Además, la propagación de la resistencia a los antibióticos en los plásmidos E. Coli de pollos a humanos manipuladores [15, 16] o de los microorganismos resistentes a los antibióticos de las aves a los seres humanos en varios países [13, 17 - 19] se ha informado. La resistencia se ha encontrado en los organismos comunes a los seres humanos y los animales, tales como Salmonella spp., Campylobacter spp. Y enterococos entre otros [20]. Debido a la intrincada equilibrio de la microflora de los distintos hábitats en el ecosistema, la transferencia de genes de resistencia entre las bacterias que ocupan diferentes hábitats tiene el potencial de ocurrir con frecuencia. Genes de resistencia pueden ser transferidos verticalmente entre bacterias de diferentes géneros y familias [21] u horizontalmente entre especies bacterianas diferentes en el mismo género o familia [22, 23].

Herramientas moleculares se han utilizado para correlacionar los agentes patógenos de animales asociados con los agentes patógenos similares afectan a los seres humanos y para demostrar claramente transferibles genes resistentes transportado por plásmidos comunes a los dos animales y los seres humanos [2, 21, 24, 25]. La posibilidad de que la transferencia de genes de resistencia a los antibióticos entre los seres humanos, los animales y el medio ambiente [22] es una amenaza directa para la salud pública. Esta amenaza impulsa las investigaciones en curso en los nuevos mecanismos de resistencia, nuevos enfoques a los antimicrobianos eficacia y estrictas medidas de control en la utilización prudente de los antimicrobianos en la medicina humana y animal. Como la posibilidad de transferencia de bacterias resistentes a tetraciclina de animales a los seres humanos es controvertida, resistentes a tetraciclina E. Coli aisladas de las aves de corral y los humanos se analizaron fuentes plásmido de la diversidad y la presencia de genes específicos asociados con la resistencia a la tetraciclina.

El objetivo de este estudio fue investigar la prevalencia y la base genética de la resistencia a la tetraciclina en comensales E. Coli aisladas de pollos de engorde sanos y comparar estos datos con los aislamientos obtenidos de pacientes hospitalizados.

Resultados
Sensibilidad a los antimicrobianos

Un total de 82 aislamientos de E. Coli se analizaron, 34 de pollos de engorde y 48 de los seres humanos. El porcentaje de cepas sensibles, intermedias y resistentes a cada agente antimicrobiano se describe en la Tabla 1. Hubo una tendencia hacia una mayor frecuencia de resistencia entre los aislados aviar, especialmente a kanamicina, la tetraciclina y ácido nalidíxico (p <0,05). Sin embargo, un mayor porcentaje de los aislados fueron resistentes al cloranfenicol y gentamicina (p <0,05). Todos aviar cepas fueron sensibles a gentamicina, y no hubo diferencias significativas entre las tasas de resistencia de la β-lactámicos y fluoroquinolonas para la gripe aviar y las cepas humanas. No resistentes a tetraciclina E. Aislar coli fue recuperado de los piensos y las muestras de agua de cualquiera de las cinco granjas.

De los aminoglucósidos incluido en el grupo, la susceptibilidad resultados fueron variados, con 91,2% y 0% de E. aviar Coli aislados que expresan resistencia a la kanamicina y gentamicina, respectivamente. E. aviar Coli expresó resistencia a los β-lactámicos, ampicilina y amoxicilina / ácido clavulánico en las frecuencias de 20,6% y 2,9%, respectivamente. Resistencia a la tetraciclina se produjo con una frecuencia de 82,4%. Entre las fluoroquinolonas, ciprofloxacina, enrofloxacina, y ofloxacin norfloxacina, la resistencia expresada por los aislados fueron relativamente similares en el 11,8%, 29,4%, 20,6% y 14,7%, respectivamente. Entre los aviar E. Coli aislados, la frecuencia de la resistencia a la primera generación de quinolonas ácido nalidíxico fue aproximadamente cuatro veces mayor si se compara con las fluoroquinolonas. Esta diferencia fue estadísticamente significativa (p <0,05).

La mayoría de los humanos E. Coli cepas fueron sensibles a los agentes antimicrobianos utilizados en el estudio, y el 43,8% y el 33,3% mostraron resistencia a los aminoglucósidos, kanamicina y gentamicina, respectivamente, y el 43,8% fueron resistentes a tetraciclina. Una espera se observó diferencia en el patrón de resistencia de estas cepas a la β-lactámicos, ampicilina (35,4%) y amoxicilina / ácido clavulánico (2,1%). Hubo un bajo nivel similar a la de la resistencia a quinolonas familia (≤ 10,4%).

La prevalencia de múltiples patrones de resistencia en la gripe aviar y humana E. Coli aislados se presentan en la Tabla 2. El patrón de resistencia más frecuentemente observadas en los aislados aviar es la resistencia a kanamicina en combinación con ácido nalidíxico y tetraciclina (41,2%). Este patrón de resistencia se observó aviar en aislamientos resistentes a los cuatro o más antimicrobianos y humanos de los aislados resistentes a los siete o más antimicrobianos. La próxima resistencia fenotipos más frecuentes fueron la resistencia a la kanamicina, el ácido nalidíxico, la tetraciclina y enrofloxacina en el 11,8%, y kanamicina y ampicilina en el 8,8%. El restante 13 E. aviar Coli aislados exhibieron un solo y único patrón fenotípico de la presente, el 23% fueron resistentes a los antimicrobianos 2, el 15,4% eran resistentes a un antibiótico y 61,5% exhiben múltiples único patrón de resistencia a los antimicrobianos ≥ 4 (Tabla 2, Figura 1]. Multi-resistencia a los medicamentos se definen como la resistencia expuesto a tres o más antimicrobianos.

Entre los humanos E. Coli aislados, el 72,9% expresó su resistencia a uno o más antimicrobianos y el 18,8% fueron resistentes a tres antimicrobianos (Tabla 2, Figura 1]. Aproximadamente un 15% de las cepas humanas mostraron resistencia a un solo antibiótico (kanamicina, la tetraciclina o gentamicina), y la resistencia a los antibióticos de dos y cuatro ocurrieron con una frecuencia de 12,5% cada uno. Resistencia a cinco o más antibióticos se produjo en frecuencias de menos de 7%.

Que los aislados fueron resistentes a otros agentes fueron examinados por su sensibilidad a la tetraciclina (Tabla 3], y los aislados resistentes a tetraciclina fueron examinados por su susceptibilidad a otros agentes (Cuadro 4]. La resistencia cruzada a los diferentes clases de antimicrobianos, se observó, sin embargo, la mayoría de estas cepas fueron resistentes a tetraciclina. Excepciones notables fueron resistentes a la ampicilina aviar y la kanamicina aislamientos resistentes a las cepas humanas, de los cuales el 42,9% y 37,5%, respectivamente, fueron sensibles a la tetraciclina (Tabla 3]. Por otra parte, entre el 10,4 y el 42,4% de los resistentes a la tetraciclina (Tet-R) aviar aislados fueron resistentes a las fluoroquinolonas, en particular, enrofloxacina, con casi todos están resistentes a ácido nalidíxico y kanamicina (Tabla 4]. La mayoría (96,4%) de la Tet-R humanos aislados fueron resistentes a la ampicilina y kanamicina, seguido de cloranfenicol (42,9%), gentamicina (38,1%) y las fluoroquinolonas (14.3-23.8%). Aunque no estadísticamente significativo, es interesante observar que un mayor porcentaje de los aislados fueron resistentes a la enrofloxacina.

Plásmido de perfiles y transformaciones

Un plásmido o más bandas de entre 2 y ≥ 12 kb kb se observaron en todos salvo siete y ocho aviar humana aislamientos resistentes a tetraciclina (Figura 2]. La definición de diferentes perfiles de los diferentes en al menos un plásmido de la banda, seis perfiles de plásmido se observaron entre los aislamientos aviar, y tres perfiles de plásmido se observaron entre los humanos aislados.

Purificado de los plásmidos aislados resistentes a tetraciclina se utilizaron para transformar químicamente competente E. - Coli JM109 (DE3) (Promega), sin embargo sólo el 12 kb plásmido se recuperó de transformantes. Transformantes había susceptibilidad antimicrobiana similar a las cepas donante (datos no presentados).

La digestión de estos 12 kb plásmidos con EcoR1 EcoR1, BamH1 BamH1 y Hind111 Hind111, no revelaron ningún importantes polimorfismos (datos no presentados).

De los genes de resistencia a la tetraciclina

De los genes de resistencia a la tetraciclina de E. Coli cepas que expresan resistencia a la tetraciclina fueron amplificados en la PCR con cebadores dirigidos a la tetraciclina eflujo tetB tetB genes y / o tetD tetD. Productos PCR se obtuvieron de los 21 Tet-R aviar y 13 de las cepas humanas (Figura 3].

Discusión

En este estudio se ha examinado la resistencia a los antimicrobianos en los comensales E. Coli aisladas de pollos de engorde y los comparó a los aislados clínicos de los pacientes hospitalizados. Debido a la toma de muestras geográfica de los aislamientos aviar, esta vigilancia proporciona una muestra representativa de la resistencia a las tendencias de la industria avícola de Jamaica.

En comparación con el resto de los agentes antimicrobianos utilizados en este estudio, aviar aislados fueron sensibles a gentamicina, amoxicilina / clavulánico y cloranfenicol. Sin embargo, el aumento de la resistencia se observaron frecuencias de las fluoroquinolonas, en la aparente falta de presión de selección.

Hay fuertes indicios de que el uso de agentes antimicrobianos puede dar lugar a la aparición y diseminación de resistencia E. Coli [13, 15, 16, 26 - 28], que luego pueden ser pasados a la gente a través de los alimentos o por contacto directo con animales. Sin embargo, hay un número creciente de informes sobre la circulación y la amplificación de los genes de resistencia a los antimicrobianos, incluida la resistencia a la tetraciclina en el medio ambiente [22, 30, 29, 32], lo que podría facilitar la aparición y propagación de la resistencia a los antibióticos en bacterias. El hallazgo de múltiples drogas resistentes comensales E. Coli aisladas de las granjas de pollos de engorde que no informaron el uso de antibióticos de acuerdo con estos últimos informes. Rysz y Alvarez [31] demostró que las bacterias en el suelo pueden adquirir resistencia a la tetraciclina de exposición ambiental, posiblemente, la creación de un reservorio de resistencia a factores generados fuera de acogida de animales. Su hallazgo sugiere que la toma de muestras ambientales de una granja es importante para acceder a la exposición a factores de resistencia de la granja de escorrentía en las cuencas, salvo en los casos en que los suelos se incrementará con abono orgánico. Sayah et al. [32] informó de que el medio ambiente granja aislamientos mostraron susceptibilidad reducida (medida por el tamaño de la zona de difusión en disco), en comparación con los aislados de muestras fecales a la mayoría de los agentes estudiados. Sugirieron que las fuentes no incluidas en la muestra, por ejemplo, los trabajadores agrícolas y de la vida silvestre con acceso a la explotación al medio ambiente, podría ser una de las fuentes de resistencia a los factores. Estamos de acuerdo con esto como una posible fuente de resistencia a los factores determinantes en nuestro estudio.

A la resistencia a los antimicrobianos tetraciclina, kanamicina y ácido nalidíxico se observó entre los aviar E. Coli aislados (Tabla 1]. La presencia y la frecuencia de resistencia a la tetraciclina en E. Coli de los pollos de acuerdo con las conclusiones de otros estudios sobre la resistencia a los antibióticos en E. Coli [16, 32]. Los patrones de resistencia a la tetraciclina se han atribuido en parte al amplio y prolongado uso de tetraciclina en la industria de aves de corral [3, 4, 6, 15, 16]. Dado que la tetraciclina es un compuesto de origen natural, las bacterias pueden estar expuestos a estos agentes en la naturaleza y al margen de todo uso humano para el tratamiento de la enfermedad, para la profilaxis, o la promoción del crecimiento para el ganado. Tetraciclina es un antibiótico usado primera línea para muchos de los animales domésticos y se utiliza a menudo antes de que la resistencia a los antibióticos perfil de un agente patógeno ha sido determinado. La resistencia a la tetraciclina es mediada por plásmido, con una amplia variedad de determinantes genéticos [33]. Esto hace que sea más posible que una bacteria susceptible de adquirir resistencia a los factores de conjugación, o por la transformación, como se demostró en este estudio.

Los bajos niveles de resistencia se observaron para ofloxacin, ciprofloxacino y gentamicina. La observación de que más del 85% de E. aviar Coli aislados fueron resistentes a ácido nalidíxico (concomitante con la reducción de su vulnerabilidad a los fluoroquinolonas) es importante teniendo en cuenta que las fluoroquinolonas se utilizan para tratar una variedad de E. Coli infecciones en los seres humanos [34]. Este hallazgo coincide con los informes anteriores [16, 35], y subraya la necesidad de vigilar-quinolona y bacterias resistentes a fluoroquinolonas en la producción de aves de corral ya que su aparición es un importante problema de salud entre la mayoría de la inocuidad de los alimentos en la comunidad. Este es el contexto de que el ácido nalidíxico selecciona para bajo nivel de resistencia a ciprofloxacina (y posiblemente otras fluoroquinolonas) [36]. Si bien la resistencia a quinolonas mutaciones cromosómicas que implica reducir la permeabilidad de la membrana y la disminución de drogas o la acumulación de alterar el ADN topoisomerases, la resistencia a las fluoroquinolonas más se asocia con mutaciones en la ADN-girasa [36, 37].

Resistencia a aminoglucósidos en E. Coli mayoría de los casos se produce por enzimas modificadoras de aminoglucósidos-[38, 39] codificados en plásmidos transmisibles [40]. No es sorprendente que un mayor número de los aislados fueron resistentes a kanamicina en comparación con gentamicina, como kanamicina es susceptible a la mayor cantidad de enzimas. Por el contrario, la resistencia a la gentamicina es mediada por las modificaciones de algunos sitios de la molécula.

Resistencia a múltiples drogas (a por lo menos tres antimicrobianos) fue encontrado en E. Coli de las dos fuentes de la gripe aviar y humana (Tabla 2, Fig. 1], pero fue mayor en la frecuencia y la proporción de los aislamientos aviar. Sin embargo, cuando estos resistente a múltiples drogas se compararon los organismos, es evidente que no tienen fuentes comunes de bacterias resistentes. La mayoría aviar resistente a múltiples drogas aislados exhibieron resistencia a la combinación de antibióticos que incluía kanamicina, la tetraciclina y ácido nalidíxico, mientras que la mayoría de las cepas humanas fueron resistentes a la kanamicina y tetraciclina o kanamicina y gentamicina. Esto sugiere que los aislados aviar que se Tet-R tienen más probabilidades de ser más resistentes a los agentes antimicrobianos. La resistencia a la tetraciclina deben ser conservados en la población bacteriana en el tiempo, independientemente de la presión de selección, que podría dar lugar a un aumento general de la resistencia en el tiempo. Además, es probable que las fuentes aviar podría actuar como reservorios de Tet-R de la contaminación ambiental y la colonización humana. Además, la diferencia en la resistencia entre los dos grupos de aislados se puede explicar en términos de las interacciones de los organismos (asociados a la acogida) y la posible transferencia horizontal de genes en sus respectivos entornos.

Para hacer frente a múltiples fármacos organismos resistentes, se recomienda por lo general que potencialmente sinérgica combinaciones se utilizan los antimicrobianos. Evaluamos nuestros aislamientos de resistencia cruzada entre las tetraciclinas y otros agentes. Los aislados resistentes a otros antimicrobianos, con excepción de la ampicilina, también fueron resistentes a tetraciclina. Cepas resistentes a tetraciclina de fuentes aviar fueron susceptibles a la ampicilina, amoxicilina / clavulánico, cloranfenicol, ciprofloxacino y gentamicina, pero resistente a la kanamicina y ácido nalidíxico. Esto indica limitada resistencia cruzada y sugiere posibles opciones terapéuticas que existen para las aves de corral sigue siendo colonizados por Tet-R E. Coli. Por otra parte, un mayor porcentaje de la Tet-R humanos de las cepas fueron resistentes a las fuentes de otros antibióticos, aunque 57 - 95% era susceptible a la amoxicilina / clavulánico, gentamicina y las quinolonas. Entre estas cepas, se produjo una importante resistencia cruzada a los aminoglucósidos, la ampicilina, y las quinolonas.

Nuestros resultados indican que el Tet-R transportado por plásmidos aviar o humana E. Coli aislados demostrar similar a la distribución de los factores determinantes de la resistencia en diversas bases genéticas. Esto probablemente indica un bajo nivel de exposición como animal hosts con una continua exposición a la tetraciclina tienen un mayor porcentaje de Tet-R E. Coli, y estas cepas con una mayor diversidad de los genes de resistencia.

En los organismos gram negativos, incluyendo E. Coli, la resistencia a la tetraciclina con frecuencia se rige por eflujo genes que están normalmente asociados a los grandes plásmidos, que son en su mayoría conjugativo. Estos plásmidos se realizan a menudo otros genes de resistencia a antibióticos, metales pesados genes de resistencia y / o de otros factores patogénicos como toxinas, por lo tanto, la selección de cualquiera de estos factores selecciona para el plásmido. Las investigaciones moleculares subyacentes en la resistencia a la tetraciclina mecanismos reveló que el 69% de los aislamientos resistentes a tetraciclina poseían plásmidos de resistencia sobre la base de éxito de las transformaciones de una cepa susceptible. Es probable que el resto de los aislados fueron utilizando mecanismos de resistencia basada en el cromosoma o en integrones transportados en plásmidos [41, 42]. Un mecanismo de resistencia a la tetraciclina se investigó el uso universal primer pares sobre la base de secuencias pertenecientes a las clases de flujo de salida, tetB y tetD [30]. Los productos resultantes de aproximadamente 1 kb que indican claramente que la resistencia a la tetraciclina entre el E. Coli aisladas en el presente estudio se rige principalmente por los genes que codifican una bomba de salida mecanismo. Estos Tet-R cepas que figuran ya sea tetB tetB o tetD tetD eflujo genes, que junto con la ausencia de polimorfismo en el plásmido RFLP datos, sugieren que existe una similitud de la resistencia a la tetraciclina en el mecanismo de estos organismos. Dado que muchos humanos y aves de corral bacterias comensales el mismo tet genes, plásmidos, transposones y integrones que causan enfermedades como las especies [43], nuestros resultados sugieren que estos agentes pueden ser transferidos a las bacterias que causan enfermedades.

Conclusión

En conclusión, los resultados de este estudio proporcionan evidencias importantes para la resistencia a los antimicrobianos de E. Coli aisladas de pollos de engorde criados en explotaciones registradas, sin el empleo de antimicrobianos, y los pacientes hospitalizados en Jamaica. Observamos que la resistencia a la tetraciclina fue en general asociados a plásmidos, y la resistencia fue mediada por tetB tetB o tetD tetD eflujo genes. Los resultados sugieren que la resistencia a la tetraciclina mecanismos de la gripe aviar y humana fuentes pueden ser similares. A largo plazo el examen de los estudios prospectivos aisladas de las ubicaciones geográficas definidas están obligados a detectar con mayor precisión temporal y espacial diferencias en la resistencia a los antimicrobianos en cepas de E. Coli.

Métodos
Aviar y humana E. Coli aislados

Muestras de heces se recogieron muestras al azar de cinco granjas de aves de corral (aproximadamente 4 km) en la parroquia de Santa Catalina, Jamaica entre 2000 y 2001. Las muestras (100 g) fueron recogidos durante un período de 42 días a los 3 días, mantiene a los 6 º C y se realizaron análisis bacteriológicos dentro de las 4 h de la colección. Los rebaños investigados, así como de otras poblaciones de aves en las granjas de aves que consta de más edad, no eran tratadas con antibióticos durante el período de investigación. Farm registros indicó que no se les administró a los agentes antimicrobianos durante los 12 meses anteriores a la recogida de muestras. Los piensos y las muestras de agua fueron muestreados en cada visita a las diferentes granjas y hacen pruebas de E. Coli resistentes a tetraciclina. De los animales domésticos o bien se encuentra ausente o por lo menos a 500 m de las operaciones de pollos de engorde.

Cuarenta y ocho aislados clínicos de E. Coli aisladas de orina y herida especímenes de los pacientes hospitalizados en el Hospital Universitario de las Indias Occidentales, St Andrew, Jamaica en 1999, también fueron analizados en este estudio. El Hospital Universitario es un 500-cama, multidisciplinario en el hospital docente que se adjunta a la defectuoso de las Ciencias Médicas de la Universidad de las Indias Occidentales en Jamaica. El hospital sirve a la zona metropolitana de Kingston y St Andrew, y se encuentra a unos 80 km de la granja de pollos de engorde más próximos que se investigó.

Todos E. Coli organismos fueron aislados y purificados en agar MacConkey (laboratorios Difco, Detroit, Michigan) y Triple-inoculadas en agar de hierro, urea agar, Simmons' citrato de agar y Motilidad-indol-lisina medios de comunicación (Difco). Los aislados produciendo reacciones bioquímicas similares a la norma E. Coli cepa, ATCC 25922 fueron identificados como E. Coli y seleccionado para la realización de nuevos ensayos. Estos E. Coli aisladas fueron trasladados a 2 ml de caldo de Luria y se incuba a 37 ° C durante 18-24 h. Un mililitro (1 ml) de esta cultura se añadió a 0,8 ml de 80% de glicerol estéril en un tubo estéril, vortex y almacenados a -80 ° C.

Sensibilidad a antimicrobianos

Pruebas de susceptibilidad antimicrobiana se realizaron por la técnica estándar de difusión en disco de acuerdo con las recomendaciones del Comité Nacional de Normas de Laboratorio Clínico (NCCLS) [44]. Los antibióticos utilizados en este estudio se presentan en la Tabla 1. Antimicrobiana de los cartuchos que contienen los discos se obtuvieron de Oxoid (Hampshire, Reino Unido), Mast Diagnóstico (Merseyside, Reino Unido), BBL (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) o Janssen-Cilag (Puebla, Mexico), almacena entre 4 y -20 ° C, y permitió llegar a la temperatura ambiente antes de su uso. Identificación se subcultured del banco a Miller LB agar e incubados durante 18-24 h antes de ser trasladado a 5 ml de solución salina estéril al 0,9% para igualar el'0 .5 'MacFarland estándar (Remel, Kansas). Un estéril punta torunda de algodón se utilizó para streak secado al aire Mueller-Hinton II placas dentro de los 15 minutos de ajuste de la turbidez. Posteriormente, se añadieron los antimicrobianos discos y placas fueron incubadas aeróbicamente a 35 ± 2 ° C durante 16-18 h. El diámetro de las zonas de inhibición que rodean los discos de antimicrobianos se midió con una precisión de milímetros. Aislados fueron resistentes considerará sólo cuando la zona de inhibición es inferior o igual a la resistencia de corte recomendado por las guías NCCLS [44]. El control de calidad se realizó tal como se recomienda utilizar E. Coli cepa ATCC 25922.

Plásmido de perfiles y transformaciones

Todos los aislamientos resistentes a tetraciclina (NCCLS interpretativo zona ≤ 14 mm) fueron seleccionados para plásmido contenido de acuerdo a la lisis alcalina mini-prep método [45] y se resolvieron en geles de agarosa 0,7%. Plásmido de ADN utilizados como marcadores de tamaño tipo fueron regalos del Dr S. Morrison. Purificado de los plásmidos se utilizan geles y para transformar químicamente sensibles a la tetraciclina-competente E. JM coli 109 (DE3) (Promega), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Transformantes se analizaron en medios selectivos que contienen 30 o 60 μ g / ml de tetraciclina (Sigma) después de incubación a 37 ° C durante 18-24 h. El plásmido libre de la cepa de acogida se incluyó como control susceptible.

Longitud de los fragmentos de restricción polimórficos (RFLP)

Para determinar el grado de similitud genética entre los plásmidos de resistencia, los 12 kb plásmidos fueron digeridos con BamH1 BamH1, y EcoRI HindIII EcoRI HindIII (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se compararon los patrones de bandas basada en la inspección visual de la bromuro de etidio-geles teñidos.

Identificación de genes Tet-R

Tetraciclina eflujo genes (tetB y tetD) fueron amplificados por PCR con los primers tetBD y tetBD-F-R [30]. El tamaño previsto de la PCR-amplificación de los productos son 967 o 964 pb para el tetB o tetD producto, respectivamente. Reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un 25 μ l de volumen que contiene 5 μ l (5 ng / μ l) plásmido de ADN, 2,5 μ l de amortiguación × 10, 2 μ l (25 mM) MgCl 2, 5 μ l (500 μ M) mezcla dNTP, 0,25 μ l (5 Pmol / μ l) de cada cebador, y el 0,2 μ l (5 U / μ l) Taq polimerasa (Promega). Muestras de ADN fueron desnaturalizados a 95 ° C durante 5 minutos en un Perkin Elmer GeneAmp Sistema 9600 (PE Biosystems, CA), y ampliada en los 30 ciclos de 94 ° C durante 60 s, 50 ° C durante 45 s, y de 72 ° C Durante 90 s, con una prórroga adicional de 72 ° C durante 300 s [30]. Los productos fueron separados en el 0,7% de agarosa en TBE 0,5 × y visualizados por la luz UV después de la tinción con bromuro de etidio.

Análisis estadístico

La sensibilidad a los antimicrobianos de datos son expresados como porcentajes o frecuencia de las cepas aviares o humanos. A un solo sentido o análisis de la varianza estadística χ 2 se utilizó para estimar general de la diferencia entre las frecuencias o porcentajes de resistencia entre la gripe aviar y humana E. Coli aisladas. En todos los casos, p <0,05 se consideró estadísticamente significativa.

Lista de abreviaturas

NCCLS, el Comité Nacional de Normas de Laboratorio Clínico; PCR, reacción en cadena de polimerasa; RFLP, polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción; Tet-R, resistentes a tetraciclina.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

TDM participó en la búsqueda en la literatura, el diseño del estudio, la recogida de datos y la interpretación; WM concibe el estudio y participó en el diseño del estudio y la interpretación de los datos; AP participó en la búsqueda bibliográfica, análisis estadístico, la interpretación de los datos y preparación manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por una beca de la Universidad de las Indias Occidentales y la publicación del Fondo de Investigación para TDM. Material de apoyo del Departamento de Ciencias Médicas Básicas, Universidad de las Indias Occidentales, Mona, es muy apreciada.