Journal of Nanobiotechnology, 2006; 4: 1-1 (más artículos en esta revista)

Celular y transferencia de imágenes de AFM de las células del cáncer utilizando Bioimprint

BioMed Central
JJ Muys (j.muys @ bionanosciences.com) [1], MM Alkaisi (m.alkaisi @ elec.canterbury.ac.nz) [1], DOS Melville (d.melville @ bionanosciences.com) [1], J Nagase (junko.nagase @ chmeds.ac.nz) [3], P Sykes (peter.sykes @ chmeds.ac.nz) [3], GM Parguez (gpa32@student.canterbury.ac.nz) [1], JJ Evans (john.evans @ chmeds.ac.nz) [2]
[1] Department of Electrical and Computer Engineering, University of Canterbury, Private Bag 4800, Christchurch, New Zealand
[2] MacDiarmid Institute for Advanced Materials and Nanotechnology, University of Canterbury, Private Bag 4800, Christchurch, New Zealand
[3] Christchurch School of Medicine and Health Sciences, University of Otago, Private Bag 4345, Christchurch, New Zealand

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Resumen

Una técnica para la captura de la permanente impresión de réplica biológica de las células ha sido desarrollado para facilitar el análisis de imágenes de resolución nanométrica utilizando las herramientas, es decir, el microscopio de fuerza atómica (AFM). El método, denominado Bioimprint ™, crea una célula permanente 'huella' de forma no biohazardous Poly (dimethylsiloxane) (PDMS) de polímeros compuestos. La transferencia de escala nanométrica información biológica se presenta como una alternativa técnica de imagen a una resolución más allá de la de microscopía óptica. Mediante la transferencia de células en una topología rígida medio más adecuado para AFM de imágenes, muchas de las limitaciones asociadas a la digitalización de especímenes biológicos pueden ser superados. Posibilidades de esta técnica se demuestra a través del análisis de Bioimprint ™ réplicas creadas a partir de células humanas de cáncer de endometrio. La alta resolución de este proceso de transferencia es la imagen más detallada de la membrana de las estructuras morfológicas compatibles con exocitosis. La integración de litografía suave para reproducir materiales biológicos presentan un mejor método para el estudio de los sistemas biológicos a escala nanométrica.

Introducción

Actualmente, las técnicas de microscopía óptica, son el principal método para la visualización de la superficie celular, con microscópico de las células utilizadas tradicionalmente para el diagnóstico y clasificación de los tipos de cáncer [1]. Sin embargo, debido a las diferencias en las características pueden ser sutiles, precisos de detección puede ser difícil y ambigua [2]. Un inconveniente de utilizar el análisis se centró microscopía de luz es el límite de difracción fundamentales, que en su óptima alcanzable espacial impone un límite de 180 nm en el plano focal y 500 nm a lo largo del eje óptico [3, 4].

Herramientas de imagen, como el de fuerza atómica (AFM) y electrónica de barrido (SEM), microscopios, son investigados por su capacidad de proporcionar información topográfica en una resolución muy superior a los métodos ópticos [5, 6]. A pesar de tener el potencial de imagen de numerosas enfermedades, el cáncer y los agentes patógenos, nanoescala herramientas de análisis no han sido utilizados de manera eficiente en las investigaciones biológicas. Las dificultades asociadas con la imagen blanda, de vida material biológico in situ es difícil y delicado y sigue siendo una tarea que consume tiempo, que al mismo tiempo eficaz, es ineficiente para el análisis y la evaluación de las poblaciones de células grandes [7]. Las predicciones sobre la resolución alcanzable cuando la superficie celular de imágenes de AFM en líquidos, independientemente de la vida o fijo, en general, se considera estar en el orden de 50-500 nm [8 - 10]. Resolución factores limitantes [11] incluyen célula-a-sustrato embargo, el tipo de células, la complejidad topográfica, la composición y la superficie de indentación en la punta suave material biológico. En un sondeo de imágenes basado en el medio ambiente suave biomateriales son susceptibles a la deformación estructural y el movimiento causado por el contacto intermitente por la aguda punta AFM [12]. La punta es un vértice fundamental de resolución AFM factor limitante en las investigaciones y análisis biológicos anterior se ha limitado a blunter sondas por temor a la penetración de la membrana [13].

Tiempo de preparación los procedimientos utilizados para el aire y el vacío de imágenes de entornos de deshidratación y requieren la fijación, que también pueden causar la deformación y artefactos [14]. Aunque el fluido basado en imágenes SEM AFM o intentos de abordar estas cuestiones mediante el mantenimiento de las condiciones fisiológicas, factores tales como el tiempo de digitalización, la sonda o de la interacción de electrones, y mojado efectos son la limitación de estas dificultades técnicas útiles. En consecuencia, nano-imagen como un instrumento de análisis de la biología sigue siendo subutilizados.

En la industria de los semiconductores, la litografía de alta resolución permite la transferencia de patrón para la fabricación de estructuras y dispositivos de nanoescala. Recientemente, nanoimprint, una forma suave de la litografía, se ha añadido como candidata a la próxima generación de la litografía; un sucesor para la fotolitografía de patrón de replicación en la fabricación de circuitos integrados [15, 16]. Soft litografía funciones poniéndose en contacto con un modelo estructurado en un material suave licuado de polímero, lo que permite una permanente réplica a ser fabricados después de curado.

Mediante el uso de una técnica, denominada Bioimprint ™, biológicas células están directamente integradas con los procesos de fabricación de litografía suave para crear impresiones de células en un sólido soporte de almacenamiento para su posterior análisis de imágenes usando nano-herramientas. En el proceso, un polímero biocompatible líquido se pone en contacto con una célula de curado antes de crear una réplica negativa.

En este artículo se presenta un método alternativo para el estudio de las células biológicas Bioimprint ™ utilizando una técnica de análisis con el AFM, a fin de que la alta resolución y la replicación de imágenes de la topografía de la superficie de las células humanas de cáncer de endometrio. Como no malignas de las células del endometrio no fueron inmediatamente disponibles como controles de este trabajo representa un estudio preliminar.

Resultados

La capacidad de la Bioimprint ™ proceso de reproducir con precisión la topografía y la transferencia celular en un Poly (dimethylsiloxane) (PDMS) polímero se investiga. Figura 1 (a] muestra una Bioimprint ™ réplica de un maligno de células de endometrio, que es positiva invertido para lograr una transposición digital de los negativos réplica o 'impresión' hechas por la célula durante la impresión. La réplica presenta características visibles celular en ambos micras y nanoscales. A lo largo de la imagen, dimple numerosas depresiones, que tienen una media de anchura y la profundidad de 820 nm y 360 nm, respectivamente, se consideran localizados en la membrana. Aunque estas características parecen ser demasiado grandes para ser de fusión poros, son potencialmente asociados con la exocitosis.

Exocitosis ha sido descrito de muchas maneras con amplia especulación que rigen tanto los mecanismos de fusión de membranas de conducción, así como topología de la membrana. Se acepta que la fusión comienza por un gránulo o de la vesícula dentro de la celda de acoplamiento en la membrana para liberar su contenido. La forma en la que el contenido de los gránulos son liberados sigue siendo debatido, y hay argumentos en apoyo total y transitorio de fusión, tal como se describe en los fusibles y de colapso "y" kiss-y-run 'mecanismos, respectivamente. Verificación visual, sin embargo, ha sido limitada, en parte debido a las dificultades que viven con imágenes o estructuralmente intacto en las células de alta resolución, y la falta de protocolos bien definidos y métodos de la integración de nano-de imágenes con herramientas de la biología. El modelo dimple [17 - 21] predice que exocitosis es iniciada por fusión de membranas, en la que, un andamio construido en la membrana dilata dimple para crear un sitio, donde posteriormente subyacente gránulo muelles para crear una fusión de poro y la liberación de su contenido. Mientras que otros modelos [22, 23] para la fusión de membranas existir esta sigue siendo una de las más convincentes y bien documentados modelos de exocitosis.

Una característica adicional se muestra en la Fig. 1 (a] es el esbozo de una forma esférica que influyen en la membrana celular, que se supone que es el núcleo (N). En la Fig. 1 (b] un alcance traza revela el impacto del núcleo subyacente en la membrana, lo que provoca un efecto distorsionado indicada por puntos (1), (2). Weyn et al. [24] han investigado los efectos de la deshidratación sobre mesotelioma maligno de las células y AFM informó una mucho más difícil y sangrado perfil uniforme sobre toda la célula, mientras que las células tienen una hidratado más redondeada y superficie lisa. Los núcleos colapso fue también una posible función de los efectos resultantes de la deshidratación y aunque algunos núcleos de las células demostrado sumersión, ese no era el caso en cada una de las células impresa.

El impacto de la ubicación de los núcleos en la formación de la depresión dimple sitios en la membrana es más evidente en la Fig. 1 (a], donde se encuentran concentrados principalmente en las zonas alrededor del núcleo. Esto se ve reforzado en el AFM positivo réplica de la célula de cáncer de endometrio muestra en la Fig. 2 (a], cuando la mayoría de las depresiones dimple están dispersos alrededor del núcleo (N). Aquí, en contraste con la Fig. 1 (a], el núcleo parece bien hidratado y redondeado como una estructura uniforme, sin sangrado perfil o sumergidas efecto. En la Fig. 2 (b], un 10 μ m imagen selectivamente se centró en una superficie de la membrana se ve saturado por las dos más grandes y esféricas más numerosas depresiones más pequeñas, como se indica por los puntos (1) y (2), respectivamente. Esto pone de manifiesto la significativa variación en el tamaño de la depresión visto sitios en la membrana.

Un beneficio adicional de la AFM es su capacidad de sentido con precisión la topografía en 3-D con un alto grado de contraste. En los dispositivos de radiación dispersa, como la microscopía de luz, el contraste es débil y de la Z-dimensión es a menudo ignorado y analítica como evidencia cuantitativa en el diagnóstico, o cuando la evaluación de la función celular. Esto queda ilustrado por el alcance rastro en la Fig. 3 (b] la medición de la sección transversal de 3 tashababy menor en (a). El dimple depresiones son vistos con un diámetro medio de 600 nm y 100 nm de profundidad, mientras que, las piscinas más grandes parecen mucho más profundo.

Las observaciones en este estudio sugieren que la célula había réplicas imágenes diversas morfologías potencialmente causada por mutaciones en el cáncer, que actúan a deformar y distorsionar la estructura de la célula de varias formas [25, 26], y, a menudo, resultado de complejas y diferentes formas celulares. Incluso teniendo en cuenta el potencial de los artefactos causados en el proceso de replicación celular hay gran variabilidad en la forma y lugares de distinguir las características de células. Figura 4 (a] refuerza esta mostrando un Bioimprint ™ réplica de una célula de cáncer de endometrio con una apariencia diferente y de acuerdo núcleo de los que se presentaron anteriormente. Un redondeado núcleo (N) se ve claramente compensada con el derecho de la celda, con la ampliación de la membrana izquierda. Una vez más, numerosas depresiones se consideran localizados en la membrana que rodea el núcleo, pero especialmente de manifiesto son dos grandes piscinas se encuentra en la membrana directamente encima del núcleo. El alcance rastro en la Fig. 4 (b] muestra las depresiones formadas como rupturas, de aproximadamente 3 μ m de ancho y la ampliación de al menos 700 nm de profundidad dentro de la célula. La forma y el fondo real de la ruptura es difícil medir con exactitud debido a las limitaciones asociadas con la punta de imágenes, que se ha traducido en una imagen que refleja el perfil de la punta en lugar de imágenes de la ruptura.

Más que ilustran el alcance y la variación de la morfología celular, y el potencial efecto de la gruesa capa de polímero tiene en la generación de núcleos de los artefactos se ilustra en la Fig. 5 (a): Una imagen de un AFM Bioimprint ™ positiva muestra una réplica de 40 μ m maligno de células endometriales Con un único núcleo (N), que parece estar claramente separados de la membrana. Un alcance rastro en la Fig. 5 (b] ilustra cuantitativamente el 18 μ m de ancho núcleo, que es visto drásticamente por la ampliación de ~ 300 nm por encima de la membrana que rodea el nivel. Mientras que otros tipos de células imágenes no muestran variación en tales núcleos de la forma y estructura de las membranas, sin controles no malignos sigue siendo incierto si estos artefactos son un inducido de la Bioimprint ™ proceso celular o propiedades que son características de cáncer.

Discusión

Gran parte aún no se ha conocido acerca de la naturaleza de las células del cáncer de endometrio y hasta ahora no ha habido un fiable, sencillo método para visualizar la topografía de células en el aire, en alta resolución sin fijación y deshidratación. La posibilidad de ver directamente las estructuras de membrana regulada por exocitosis permitirá a los investigadores a analizar la naturaleza y la respuesta secretora de las células, dando información sobre las respuestas y efectos de drogas. Una considerable variabilidad en el tamaño de dimple depresiones y roturas, así como la dinámica de formación y agrupación de estas estructuras en torno al núcleo, demuestra que las células tienen diversas morfologías.

Hay una falta de coherencia en el grado de deformidades en las células del cáncer: Razones por las diversas formas núcleos visto podría ser explicado por la fuerza ponderada de los polímeros, a la prensa en la membrana y el núcleo de fundición como una estructura sobresale de la celda . Sin embargo, la capacidad de ver y potencialmente caracterizar los efectos de las mutaciones del cáncer en ambos nanoscales micras y presenta una mejora con respecto señaló óptica convencional. Además de la alta resolución de imagen activada por la AFM, la capacidad de la imagen con precisión en 3 dimensiones-presenta una importante ventaja frente a la radiación dispersa dispositivos de imagen. La sensibilidad de la AFM y precisa la transferencia de células de la topografía en un polímero proporciona un método con la capacidad de superar las dificultades actuales de imágenes de materiales biológicos por la AFM.

Ventajas de Bioimprint ™ extender más allá de la simple reproducción litográfica proceso, con beneficios tales como el almacenamiento prolongado de análisis y sin perder la capacidad de adaptación de la resolución. Además, al ser una sustancia no biohazardous, las impresiones de material patógeno, las células infectadas y otras muestras biológicas pueden ser transportados o intercambiados para el análisis de la contaminación sin preocupaciones. Esto reduciría la necesidad de complejas y largas documental aprobación, que es requerido por los gobiernos y las instituciones, y facilitaría fuera de la casa de análisis. Más ganancia es la posibilidad de mantener registros de pacientes utilizando un espécimen indirecta, sin necesidad de costosos equipos de almacenamiento o de la contaminación.

Utilidad de Bioimprint ™ puede ser comprendido sobre todo cuando se usa como un complemento de la técnica convencional con imágenes ópticas, y como método alternativo para los que requieran estricta preparación de muestras, tales como la fijación química y la deshidratación con el fin de visualizar la topología de células por AFM [27] o SEM [ 28]. Estas aplicaciones pueden emplear inmunohistoquímica metodología en la celda, antes de la reproducción de la celda utilizando la topografía Bioimprint ™. Esto combinado físicas y químicas enfoque puede producir una mejor comprensión de la mecánica y la funcionalidad celular.

Artefactos en forma de burbujas atrapadas atrapado entre la célula y la rasgadura de polímero y de la membrana celular, también se observaron y fácilmente identificable. Un factor crucial en la impresión estructura de la célula es la cantidad de fluido en la superficie restante antes de la aplicación poliméricos. Ausencia de una fina capa de células por encima de la media, inevitablemente, provoca la aridez, y ha dado lugar a muchos Bioimprint ™ mostrando réplicas característica núcleo deshidratación artefactos. Por otra parte, el exceso de líquido de crear un interfacial capa que impide la transferencia de características de alta resolución.

Una limitación en la actual metodología utilizada para fabricar sellos editoriales es que el proceso carece de los necesarios para el control de la fabricación de la precisión y coherencia de las réplicas de células. Impresión condiciones son demasiado lentos y una gran proporción de la población de células no ser reproducido con exactitud debido a la deshidratación efectos significativos. Utilizando el calor de curado PDMS polímero, las réplicas son, en realidad, un "tiempo-promedio" en lugar de un "único-shot 'captura impresión, en la que el polímero se ajusta a la estructura de la célula. Los artefactos son, inevitablemente, que está introduciendo la respuesta celular a las condiciones de curado y de polímeros, que son más notablemente demostrada por los efectos en el núcleo.

Actualmente, los esfuerzos se concentran en torno a la elaboración de un rápido UV curables como polímero formado una delgada capa de la validez de hilar, que está impresa en lugar de vertido por encima de las celdas en un grueso [29]. Aunque la luz ultravioleta es, sin duda, perjudicial para la fisiología celular, el tiempo necesario para replicar es de 100 veces más corto que el convencional PDMS compuesto, que permita una representación más exacta de la célula viva a repetirse. Los resultados preliminares muestran una reducción en el número de células que muestran núcleos sumersión o deshidratación efectos y una mejor resolución de transferencia.

Conclusión

Un suave litográfica técnica para la creación de la réplica de células impresiones con nanoescala de información se ha introducido y probado en humanos células de cáncer de endometrio. Mediante la creación de una célula de 'huella' en un polímero solidificado estable, permanente no biohazardous registro puede ser analizado y en alta resolución utilizando la AFM. Bioimprint ™ supera muchas de las dificultades inherentes asociados con celulares de imágenes de AFM y de los avances de su integración como instrumentos de investigación en la biología. Con la verificación visual en última instancia, ser el pilar para el diagnóstico de cáncer, un método de facilitar el uso de imágenes en resolución atómica potencialmente podrían utilizarse para caracterizar más anomalías morfológicas en la nanoescala. Aunque en este momento, es difícil deducir si las diversas formas y formas son características potenciales vinculados a las mutaciones de células malignas, o si son los artefactos inducidos de la Bioimprint ™ proceso de replicación. Este estudio preliminar de los informes de trabajo en las áreas de la replicación celular de células de cáncer de endometrio y de imágenes por microscopía de fuerza atómica.

Métodos

Humanos de las células del cáncer de endometrio se cultivaron, de conformidad con las directrices institucionales de la Escuela de Medicina Christchurch y Ciencias de la Salud, Universidad de Otago, Nueva Zelandia, después de la aprobación ética y consentimiento informado adecuado. La preparación de las células son los siguientes: tejidos adenocarcinoma endometrial fueron cosechadas de las mujeres sometidas a histerectomía, y no se tomaron biopsias miometriales del tumor de útero abierto. Los tejidos fueron digeridos en la colagenasa-A (1 mg / ml), y la dispersión de las células, cultivadas de la noche a la mañana y que consiste en medio de alfa-MEM con 1% penicilina / estreptomicina, el 0,1% de BSA y el 10% de suero fetal ternero.

Antes de la aplicación de polímeros de incubación de todos los medios de comunicación y fue aspirado muestras fueron lavadas en fisiológica de búfer fosfato salino (PBS). El sistema de transferencia de patrón para la fabricación de impresión se ilustra en la Fig. 6: Inicialmente, Poly (dimethylsiloxane) (PDMS) (Dow Corning, EE.UU.) solución fue mezclada en una proporción de 10:3 de polímero para curar agente, el aire se retiró de En la solución de vacío y antes de la curación de 2 minutos a 95 ° C. Aproximadamente 5-8 gramos de compuesto se aplicó encima de las celdas en un adjunto de 5 cm de plástico plato Petri-y de inmediato se incubaron en un horno a 37 ° C por 2 horas. El espesor de la resultante de polímero por encima de las celdas es típicamente entre 2,5 y 5 mm. El archivo adjunto de las células para prevenir el sustrato características de ser sumergidas por completo dentro del material de polímero, lo que permite una impresión de las expuestas en la superficie de las células que se hizo en el polímero. La máscara era pelado, límpiela en DIW ultra-sónica baño para eliminar cualquier material biológico adjunto y una última fase de polimerización se completó en un horno a 95 ° C por 2 horas.

El endurecido Bioimprint ™ impresiones fueron analizados por un AFM (DI 3100, Veeco Instruments, Santa Barbara, CA) a la explotación del modo de uso de triangular sin contacto cantilevers (NSC11, MikroMasch, Estonia), que son típicamente operados entre 0.6-1 Hz en un ~ Resonante frecuencia de 315 kHz con un nominal sub-10 nm radio de curvatura y una fuerza constante de 48 N / m. Para recuperar la orientación original de la célula, las réplicas positivas son tomadas por digitalmente invertir el AFM scans de las impresiones o moldes / negativo réplica, que se hicieron por las células cuando impresas en el polímero.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a todas las mujeres a partir de la Christchurch Women's Hospital, a quienes sus donaciones sin esta investigación no fue posible de. Asimismo, reconocer las importantes contribuciones hechas por la enfermera Dianne Harker y sus esfuerzos realizados garantizar la ética de procesamiento de todos los tejidos. Esta investigación fue apoyada por el MacDiarmid Instituto de Materiales Avanzados y Nanotecnología.