AIDS Research and Therapy, 2006; 3: 5-5 (más artículos en esta revista)

Glutatión y de inhibición del crecimiento de Mycobacterium tuberculosis en la salud y los sujetos infectados por el VIH

BioMed Central
Vishwanath Venketaraman (venketvi@umdnj.edu) [1], Tatanisha Rodgers (rodgerto@umdnj.edu) [1], Rafael Linares (rafael_a.linares @ roche.com) [6], Nancy Reilly (reillyna@umdnj.edu) [1], Shobha Swaminathan (swaminsh@umdnj.edu) [1], David Hom (homdl@umdnj.edu) [2], Ariel C Millman (millmaac@umdnj.edu) [1], Robert Wallis (wallis @ umdnj . Edu) [1], Nancy D Connell (connell@umdnj.edu) [1]
[1-07103, EE.UU.
[2] Centro de emergentes y reemergentes Patógenos, UMDNJ-New Jersey Medical School, Newark, NJ 07103, EE.UU.
[3-07103, EE.UU.
[4-07103, EE.UU.
[5-07103, EE.UU.
[6-07103, EE.UU.
[7] PPD, 1213 N Street NW, Apt. A, Washington DC 20005, EE.UU.

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Resumen

Los niveles intracelulares de glutatión se agotan en los pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida en los cuales el riesgo de la tuberculosis, la enfermedad está particularmente difundida en numerosas ocasiones que la de individuos sanos. En este estudio, hemos examinado el papel de glutation en la inmunidad contra la infección de la tuberculosis en muestras provenientes de sana y virus de la inmunodeficiencia humana sujetos infectados. Nuestros estudios confirman que se reducen los niveles de glutation en células mononucleares de sangre periférica y en los glóbulos rojos aislados de virus de la inmunodeficiencia humana de sujetos infectados (CD4> 400/cumm). Además, el tratamiento de los cultivos de sangre de virus de la inmunodeficiencia humana sujetos infectados con N-acetil cisteína, un precursor de glutatión, causó el mayor control de los intracelular M. La infección tuberculosa. N-acetil cisteína, el tratamiento disminuyó los niveles de IL-1, TNF-α e IL-6, y el aumento de los niveles de IFN-γ en cultivos de sangre derivados de virus de la inmunodeficiencia humana de sujetos infectados, la promoción de la respuesta inmune del huésped para contener M . Infección tuberculosa con éxito.

Introducción

La tuberculosis (TB) es un importante problema de salud global [7]. Aproximadamente un tercio de la población del mundo está latente infectada por Mycobacterium tuberculosis (LTBI). Los individuos con LTBI tienen un 5-10% de riesgo de desarrollo de la vida activa de la enfermedad [7]. Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) en sujetos infectados con LTBI se encuentran en muy alto riesgo de desarrollar tuberculosis activa. El desarrollo de tuberculosis activa en pacientes con VIH, se debe no sólo a la reactivación latente de M. Infección de la tuberculosis, sino también debido a una mayor susceptibilidad a la primaria progresiva M. Infección tuberculosa [7].

Innata y la respuesta inmune adaptativa son necesarios para el éxito del control de M. La infección tuberculosa. Macrófagos proporcionar primera línea de defensa contra M. La infección tuberculosa. Murino macrófagos puede ser activado para matar intracelular M. La tuberculosis por el tratamiento con LPS (de estímulo a la expresión de TNF-α, a través de activación de receptores tipo peaje-) e IFN-γ (un producto de los linfocitos activados). El óxido nítrico (NO) producido por los macrófagos infectados es el principal mediador (moléculas efectoras) en este proceso. Al igual que los de los ratones, los macrófagos humanos también adquirir antimicobacterianos actividad IFN-a través de interacciones con los dependientes de los linfocitos [12]. Sin embargo, el IFN-γ exógenos no mycobactericidal aumentar la actividad de los macrófagos humanos aislados como lo hace, las de los ratones. Varios estudios indican que en lugar de contacto directo celular es necesario para la inducción de la actividad antimicobacterianos en macrófagos humanos [6, 33], y que esto refleja la actividad caspasa-mediada la inducción de la apoptosis, la activación de receptores tipo peaje-, la liberación de péptidos antibióticos ( Por ejemplo, granulysin), o desconoce los mecanismos de [4, 36].

Glutatión reducido (GSH) es un antioxidante y desempeña un papel fundamental en la desintoxicación celular y la mejora de las funciones inmunes [10]. Curiosamente, las personas infectadas por el VIH han subnormal GSH en sus niveles en plasma, pulmón fluido de recubrimiento epitelial, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), y otras células de la sangre [5, 11, 14, 23]. Se ha informado recientemente de que la disminución de los niveles de GSH en PBMC de individuos con infección por VIH se asocia con un peor pronóstico [24]. Inmunodeficiencia por el VIH-1 representa la mayor amenaza para el reconocido éxito de la contención latente M. La infección tuberculosa. El objetivo de este estudio fue examinar el papel de GSH en la inmunidad contra la tuberculosis en muestras provenientes de sanos y sujetos infectados con el virus VIH.

En nuestros estudios anteriores utilizando macrófagos de diferentes fuentes, hemos demostrado que GSH desempeña un papel fundamental en la inmunidad innata contra la infección tuberculosa [40, 41]. En nuestros estudios recientes nos han demostrado que ha GSH estática H37Rv efecto sobre el crecimiento in vitro [41]. El mecanismo de toxicidad de GSH a micobacterias no se conoce todavía. Una posibilidad es que la presencia de altas concentraciones de GSH puede dar lugar a un desequilibrio en una célula bacteriana ya que contiene tiol una alternativa para la regulación de reducción / oxidación de la actividad (por ejemplo, mycothiol).

En el presente estudio, hemos reexaminado la medida en que los niveles de GSH disminuyó en los sujetos VIH positivos. También se examinó la relación entre los niveles de GSH y la capacidad de matar intracelular M. La tuberculosis, en asociación con otras funciones inmunitarias, como la producción de citoquinas. Los niveles de GSH se modulada por el tratamiento de las muestras de sangre con N-acetil cisteína (NAC) para aumentar o buthionine sulphoximine (BSO) para disminuir GSH intracelular piscinas. Nuestros resultados sugieren que la incapacidad de las células inmunitarias de los sujetos sanos VIH y la tuberculosis para contener el crecimiento puede ser una consecuencia de la incapacidad de los macrófagos para mantener adecuados niveles de GSH durante la infección in vitro.

Métodos experimentales
Temas

Un total de 20 sujetos (10 controles voluntarios sanos y 10 pacientes con infección por el VIH) se inscribieron en UMDNJ-Hospital Universitario de Newark y de la Escuela de Medicina de Nueva Jersey, en Newark, NJ. Los sujetos con infección por el VIH sin tuberculosis (n = 10) fueron contratados en la Clínica de Enfermedades Infecciosas del Hospital de la Universidad UMDNJ-. La Clínica es el sitio de varios estudios en curso del tratamiento del VIH, estos estudios proporcionan tratamiento antirretroviral (ART) a los sujetos inscritos sin cargos. La atención de los pacientes no fue alterada por la participación en este estudio. Los pacientes se define como el VIH-positivas sobre la base de un ELISA positivo con un Western Blot confirmatorio realizado como parte de su rutina de la atención en la clínica. El número promedio de CD4 para el VIH los pacientes en este estudio fue 423 ± 83/cumm. Sólo un paciente había recuentos de células CD4 por debajo de 200/cumm. Siete pacientes se encontraban en tratamiento antirretroviral y tres pacientes no fueron en ningún tipo de tratamiento en el momento de extraer la sangre. Sujetos sanos sin infección por el VIH o una historia de la tuberculosis fueron contratados en el hospital de la universidad y los profesores y empleados (n = 10). Saludable y personas VIH positivas con un historial positivo de una prueba de la tuberculina (TST) se excluyeron del estudio a fin de mantener un estricto estudio de las definiciones. Esto es de acuerdo con la recomendación de que CDC reconoce que una TST positiva refleja la infección latente de TB.

Precauciones de seguridad para el manejo de M. La tuberculosis

Todos los experimentos con M. Tuberculosis H37Rv se realizó en el interior de la seguridad biológica de nivel 3 (BSL-3) instalación. Los protocolos para todos los experimentos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional UMDNJ, New Jersey y la Escuela de Medicina de Seguridad de la Biotecnología Comité Institucional. Todos los procedimientos experimentales se realizó en el interior de los armarios de seguridad de la biotecnología en el BSL-3. Todos los desechos líquidos y sólidos de los experimentos fueron tratados con una solución desinfectante y luego en autoclave.

Tramitación de la infección por H37Rv

M. tuberculosis H37Rv fue cultivada en 7H9 con albúmina-dextrosa complejo (ADC). Static culturas de las micobacterias en el pico de la fase logarítmica de crecimiento (entre el 0,5 y el 0,8 en el A600 A600) fueron utilizados para la infección. La suspensión bacteriana fue lavado y resuspendido en RPMI AB que contiene el suero. Bacteriana en bosquetes fueron desglosados por vortexing cinco veces de 3 mm con perlas de vidrio estériles. La suspensión bacteriana fue aprobada a través de un filtro de 5 μ m de eliminar cualquier otra de matas. El número total de organismos en la suspensión fue determinada por galvanoplastia. Procesado micobacterias han sido bloqueados por las poblaciones en -80 ° C. En el momento de la infección, las existencias de procesados congelados micobacterias fueron descongelados y utilizados para la infección de macrófagos.

Separación de monocitos de la sangre humana

Humanos de los monocitos-macrófagos derivados (HMDM) se utilizaron para estudiar los efectos de IFN-γ y GSH en la inducción de la muerte intracelular de H37Rv. Estos experimentos se realizaron sólo en muestras de sangre de sujetos sanos, debido a la falta de disponibilidad de suficiente volumen de sangre de pacientes con VIH. Cuarenta ml de sangre de sujetos sanos fueron utilizados para monocitos aislamiento. PBMC se aislaron por centrifugación ficoll hypaque densidad. PBMC fueron lavadas con PBS y resuspendido en RPMI conteniendo 5% de suero AB. PBMC (10 × 10 6 / así) se distribuyeron en Poly-DL-lisina 12 y placas de revestimiento y se incubaron durante la noche a 37 ° C, 5% de CO 2 en un ambiente humidificado, para permitir que los monocitos a que se adhieran a la placa. No adherentes células fueron eliminadas por el lavado y la suave adherente monocitos se cultivaron en RPMI que contengan 5% AB suero durante 7 días antes de ser utilizado para experimentos de infección para permitir la diferenciación de los macrófagos. El número total de macrófagos por así (en el día siete) fue su cuantificación separar los macrófagos de un único bien por la adición de helado accutase (Sigma). Viable separado macrófagos fueron contados en una cámara de recuento Neubauer por tinte azul de tripan exclusión. El número medio de los macrófagos y por el día 7 es de aproximadamente 5 × 10 5.

Macrófagos infección

HMDM de sujetos sanos fueron mantenidos in vitro, tal como se describe más arriba. Los macrófagos son infectados por el procesado en H37Rv moi de 10:1. Macrófagos se incubaron con H37Rv durante 2 h (para la fagocitosis), después de que los organismos extracelulares fueron retirados por un lavado con PBS. Macrófagos infectados se mantuvieron en RPMI conteniendo 5% de suero AB. Macrófagos infectados culturas quedaron sin efecto a las 4 h, y 7 días después de la infección y el tratamiento, para medir la viabilidad de H37Rv intracelular. Cell libre sobrenadantes de macrófagos infectados cultivos fueron diluidos y chapada extracelular para el crecimiento bacteriano. Intracelular viabilidad de H37Rv fue determinado por lisis macrófagos infectados con agua destilada estéril y enchapado en el lisado 7H11 enriquecido con ADC, a enumerar las colonias de micobacterias.

Supervivencia de los H37Rv en IFN-γ, LPS tratados HMDM

IFN-γ es considerado un microbicida predominante activador de los macrófagos en funciones y es esencial para la prevención de la progresión incontrolada de M. Infección tuberculosa [2, 18, 27]. Por ello, estudió la supervivencia de H37Rv en IFN-γ, LPS tratados HMDM. HMDM se mantuvieron in vitro e infectadas con el H37Rv, como se describió anteriormente. H37Rv infectados HMDM fueron tratados con IFN-γ (100 U / ml) y LPS (1 μ g / ml), se suprimieron las culturas a las 4 h, y 7 días después de la infección y el tratamiento, para determinar la viabilidad intracelular de H37Rv y no dentro IFN-γ, LPS-macrófagos estimulados.

Supervivencia de los H37Rv dentro de NAC tratados HMDM

La detección de los efectos de GSH en los macrófagos humanos mediada por la inhibición de crecimiento intracelular H37Rv. HMDM fueron tratados con diferentes concentraciones de NAC. Cisteína captación se considera como la etapa limitante de la tasa de síntesis de GSH. La manera más eficaz de aumentar los niveles de cisteína en las células cultivadas in vitro es suministrar el medio de cultivo con NAC. NAC es fácilmente absorbido por las células y no es tóxico. Intracelularmente, NAC es de-acetilado y cisteína se utiliza para la síntesis de GSH. H37Rv infectados HMDM fueron tratadas con 5, 10, 15, y 20 mM de NAC, y el crecimiento intracelular de H37Rv se estudió. Macrófagos infectados culturas quedaron sin efecto a las 4 h, y 7 días, después de la infección y el tratamiento. Macrófagos infectados fueron lisadas y de plata de las colonias de micobacteria.

Toda la sangre mycobactericidal ensayo

Micobacterias añadido a heparinized sangre (después de la dilución con medio de cultivo de tejidos), son rápidamente ingeridas por monocitos y otras células fagocíticas, como los neutrófilos. Este modelo difiere de otros modelos de la infección intracelular en la sangre que todos los elementos están representados. Interacciones de los monocitos infectados con las células asesinas naturales y de antígenos específicos de células T resultado en el control del crecimiento intracelular. En contraste con los estudios con aislados macrófagos, la sangre total ensayo requiere un bajo volumen de sangre. La sangre se diluye en la siguiente proporción: 300 μ l de sangre de sujetos sanos y pacientes fueron diluidos a 1 ml con RPMI. Hemocultivos fueron infectadas con el 10 5 UFC de H37Rv. GSH niveles en la sangre culturas fueron alterados usando agentes como NAC (10 mM) y BSO (500 μ M), que específicamente aumento y disminución de GSH intracelular. El efecto de la alteración en los niveles de GSH M. Se estudió la supervivencia de la tuberculosis. El tratamiento de las células con BSO causas de inhibición de la síntesis de GSH. BSO inhibe específicamente la actividad de γ-glutamil-cysteinyl enzima sintetasa, que cataliza la reacción primer paso en la síntesis de GSH. Hemocultivos fueron tratados con NAC ya sea o en la combinación de NAC y la BSO de 24 h antes de la infección. H37Rv infectados sangre total culturas fueron incubadas a 37 ° C y cosechada en determinados intervalos (2 h, y 48 h) por sedimentación a 2000 rpm durante 10 min. Sobrenadantes fueron utilizadas para determinar los niveles de citoquinas y extracelular crecimiento de micobacterias. Anfitrión células fueron perturbadas por la adición de agua estéril. Los lisados se chapada en 7H11 medio enriquecido con ADC colonias de micobacteria.

Determinación de GSH

Los niveles de GSH intracelular en PBMC, glóbulos rojos (RBC), y el plasma, de individuos sanos y de sujetos VIH positivos se analizaron por espectrofotometría, utilizando un kit de ensayo GSH proceder de Calbiochem. Este enfoque se utiliza para determinar si los niveles de GSH disminuyó en todos los componentes de la sangre o sólo en algunos componentes específicos. Lisados de plasma y células de glóbulos rojos y PBMC, derivados de la sana y sujetos VIH positivos, se mezcla con igual volumen de hielo frío 5% de ácido metaphosphoric (MPA) y se centrifuga a 3000 rpm durante 15 minutos. Sobrenadantes se utilizaron para el ensayo de GSH, como por las instrucciones del fabricante del equipo. Plasma, glóbulos rojos, y PBMC fueron separados de la sangre por todo el gradiente de densidad de centrifugación usando ficoll hypaque. Las muestras se utilizan también para el análisis de proteínas por el método de Bradford utilizando Bio Rad reactivo.

Citoquinas ensayo

Hemocultivos fueron preparados por excursiones que los métodos. Cultivos de sangre de sujetos sanos y pacientes con VIH, fueron tratados de la siguiente manera: la ausencia de tratamiento, la infección con el H37Rv, y la infección con el H37Rv y el tratamiento con NAC. Culturas se suprimieron a las 2 h y 48 h, después de la infección. No infectada culturas se dieron por terminadas al mismo tiempo puntos. Culturas se centrifuga a 2000 rpm durante 10 min. Sobrenadantes de libre de células sanas y pacientes con VIH, se han utilizado para el ensayo de citoquinas, que se realizó con un kit Beadlyte proceder de Upstate. Se trata de un kit muy sensible que se puede utilizar para detectar múltiples citocinas en el cultivo de tejidos muestras. Un anticuerpo monoclonal específico para una citoquina está ligado covalentemente a un talón conjunto fluorescentes, que captura la citocina. Un complementarios con biotina de anticuerpos monoclonales de citoquinas luego completa la inmunológicos sándwich y la reacción se detecta con streptavidina-ficoeritrina utilizando un Luminex. El ensayo se realizó según el protocolo del fabricante.

Análisis estadístico

El análisis estadístico de los datos se realizó mediante el programa Statview y la significación estadística se determinó usando unpaired t test. Los datos de los ensayos de citoquinas fue analizado por test no paramétrico (Kruskal-wallis). Las diferencias se consideraron significativas con un nivel de p <0,05.

Resultados
Supervivencia de los H37Rv en HMDM

Se estudió la supervivencia de H37Rv en HMDM de sujetos sanos. H37Rv infectados HMDM fueron tratados con IFN-γ (100 U / ml) y LPS (1 μ g / ml), y la viabilidad intracelular de H37Rv y no dentro de IFN-γ, LPS-estimulado macrófagos se comparó. Figura 1a muestra los resultados de seis distintos temas realizados por triplicado. Se observó un crecimiento significativo dentro de H37Rv no HMDM h entre el 1 y 7 días (Figura 1a]. El aumento fue de casi cuatro veces. HMDM estimulación de las células con el IFN-γ, LPS también dio lugar a un crecimiento significativo de H37Rv intracelulares (Fig 1a]. Sin embargo, el aumento en H37Rv crecimiento fue menos de tres veces (Figura 1a]. Para examinar si GSH desempeña un papel importante en la muerte de los macrófagos humanos H37Rv, HMDM de voluntarios sanos fueron tratados con 5, 10, 15, y 20 mM de NAC, y el crecimiento intracelular de H37Rv se midió. Los experimentos realizados en seis diferentes temas demuestran que el tratamiento de HMDM con NAC 10 mM resultó en estasis en H37Rv crecimiento en tres de cada seis sujetos (Fig 1b]. Tratamiento de los HMDM con NAC a las 5 mM y 15 mM inducida por la inhibición de crecimiento H37Rv, en uno de cada seis, y dos de cada seis individuos, respectivamente (datos no presentados). El tratamiento con 20 mM NAC no tuvo ningún efecto sobre la inhibición del crecimiento de H37Rv (datos no presentados). Por lo tanto, la NAC en 10 mM es más eficaz en el control de inducir el crecimiento de M. La tuberculosis, en comparación con el IFN-γ, LPS, u otras concentraciones de NAC (Fig 1b] en el aislado HMDM.

Toda la sangre modelo

Varios estudios indican que el contacto directo de células es necesaria para la inducción de antimicobacterianos actividad en macrófagos humanos [6, 33], y que esto refleja la actividad caspasa-mediada la inducción de la apoptosis, la activación de receptores tipo peaje-, la liberación de péptidos antibióticos (por ejemplo, Granulysin), o desconoce los mecanismos de [4, 36]. Micobacterias son rápidamente ingeridos por células fagocíticas cuando se añade a heparinized sangre (después de la dilución con medio de cultivo de tejidos). Este modelo difiere de otros modelos de la infección intracelular en la sangre que todos los elementos están representados.

Por lo tanto, si la prueba de monocitos interacción con otras células inmunitarias dará lugar a la inhibición de crecimiento intracelular H37Rv utilizando sangre total culturas, que proporciona un micro-clima que es propicio para las interacciones celulares.

Toda la sangre mycobactericidal ensayo en sujetos sanos

La sangre de voluntarios sanos se diluye como se describe y tratados con ninguno o 10 mM NAC. Los hemocultivos fueron infectadas con 5 × 10 5 UFC de los procesados H37Rv. Sangre infectada culturas se dieron por terminadas a las 2 h y 48 h después de la infección para determinar la viabilidad de H37Rv intracelular. Suspensiones de células fueron centrifugadas para separar el sobrenadante de células libres y "pellets". Sobrenadantes se diluyeron y chapada extracelular para el crecimiento bacteriano. Intracelular viabilidad de H37Rv fue determinado por el enchapado lisados de células de sangre diluida en 7H11. La infección de la sangre con las culturas H37Rv dado lugar a casi dos veces los aumentos en el crecimiento intracelular de H37Rv (Fig. 1c]. El aumento en el crecimiento H37Rv fue estadísticamente significativa. Tratamiento de los cultivos de sangre con NAC (10 mM), a causa de la inhibición del crecimiento en todos los H37Rv siete personas a prueba (Fig. 1c]. Los datos en la Fig 1c son medias de siete sujetos sanos. Tratamiento de las culturas con la BSO derogado efecto de la inhibición del crecimiento de NAC (Fig. 1c]. Estos resultados indican que la inhibición de crecimiento H37Rv NAC tratada en cultivos de sangre se debe a la combinación de efectos directos antimicobacterianos de GSH y la activación de células inmunes inducidos por GSH.

Los niveles de GSH en muestras de sangre sana y de personas VIH positivas

Los niveles de GSH intracelular en PBMC RBC y se analizaron por espectrofotometría, tal como se describe. Se observó un significativo y más del 50% de disminución en los niveles de GSH intracelular en PBMC (Fig 2a] y RBC (Fig 2b] de pacientes con VIH, en comparación con sujetos sanos. Los datos se muestra en la Fig 2 son promedios de seis saludable y seis sujetos infectados por el VIH. Se observó que no existen diferencias en los niveles plasmáticos de GSH entre sanos y pacientes con VIH.

El control del crecimiento de H37Rv por NAC tratada con cultivos de sangre de pacientes con VIH

Intracelular de crecimiento H37Rv fue monitorizada en cultivos de sangre de los seropositivos. Se observó un crecimiento significativo de H37Rv no en cultivos de sangre (Figura 3a]. NAC tratamiento de la inhibición inducida por el crecimiento intracelular de H37Rv. Los datos en la Fig 3b son medias de los datos obtenidos de los ocho diferentes personas VIH positivas. BSO tratamiento derogado el efecto inhibidor ocasionado por el tratamiento NAC (Fig. 3c].

Determinación de citocinas en la sangre cultura sana y sobrenadantes de los seropositivos

Citocinas se midieron en la sangre sobrenadantes de la cultura sana y sujetos infectados por el VIH. Curiosamente, en los temas de VIH, la infección H37Rv inducida por la sangre culturas para producir un aumento de los niveles de citoquinas pro-inflamatorias como la IL-1, TNF-α y la IL-6 (Fig. 4a, 4b, 4c]. H37Rv infección inducida por casi tres veces el aumento en la producción de IL-1, en comparación con los controles no infectados (Fig. 4a]. NAC tratamiento de los infectados H37Rv culturas abajo regulados los niveles de IL-1 (Fig. 4a]. En comparación con los controles no infectados, la infección inducida H37Rv siete veces los aumentos de los niveles de TNF-α en dos pacientes sometidos a la prueba (Figura 4b]. NAC H37Rv tratamiento de la infección causada culturas reducción de los niveles de TNF-α (Fig. 4b]. H37Rv infección inducida por casi diez veces los aumentos en la producción de IL-6, en tres pacientes sometidos a la prueba (Figura 4c]. NAC tratamiento de la reducción de los niveles de IL-6 a las que se encuentran en el control no infectadas. También observó que la infección por el VIH de la sangre con las culturas H37Rv causado seis veces aumentos en la producción de IFN-γ en dos pacientes y tres veces aumenta en un paciente (Figura 4d]. En comparación con los controles sin tratar, tratamiento de la NAC H37Rv infectados culturas inducido diez aumentos en la producción de IFN-γ en dos pacientes y aumenta casi cuatro veces en el mismo paciente (Figura 4d]. En resumen, nuestros estudios demuestran que la NAC tratamiento regulado por la síntesis de IL-1, IL-6 y TNF-α y el aumento de los niveles de IFN-γ (Fig 4a, 4b, 4c, 4d].

Con la excepción de la IL-10, todas las otras citoquinas producidas por sujetos sanos no mostraron una tendencia clara. La regulación de la síntesis de IL-10 en respuesta a la infección y H37Rv NAC tratamiento fue similar en sujetos sanos y pacientes con VIH. H37Rv inducida casi diez veces los aumentos de los niveles de IL-10 en los sanos y los sujetos infectados por el VIH (Fig. 5a, 5b]. Además, el NAC tratamiento redujo los niveles de IL-10 a las que se encuentran en los controles no infectados, tanto en sujetos sanos y pacientes con VIH (Fig. 5a, 5b].

Discusión

Desarrollo de la tuberculosis en pacientes infectados por el VIH se basa en una predisposición a la reactivación latente de M. A la infección por tuberculosis y la susceptibilidad a la primaria progresiva M. Infección tuberculosa [9]. Sin embargo, la relación de acogida de la respuesta inmune al desarrollo de la tuberculosis durante las diferentes etapas de la enfermedad del VIH no está claro. El comportamiento oportunista de M. La tuberculosis en humanos la infección por el VIH puede explicarse por la represión de tipo-1 respuestas en el nivel de células presentadoras de antígeno, las células T CD4 y los macrófagos efector.

Los estudios in vitro han demostrado que la disminución de los niveles de GSH intracelular disminuye la supervivencia celular, altera las funciones de las células T y aumenta la replicación del VIH, la activación de NF-kB y la sensibilidad a la TNF-α induce la muerte celular [10, 11, 19]. Un papel también ha sido propuesto para GSH como porteador molécula de NO. El óxido nítrico también reacciona con el GSH para formar GSNO, un donante de NO con una mayor estabilidad [34, 35].

En primer lugar informó de que facilita el control de GSH intracelular de M. Bovis BCG en el NO-derivados de la deficiente macrófagos iNOS sacude ratones, y en HMDM [40]. Estos estudios indicaron que GSH ha directa antimicobacterianos actividad distinta de su papel como portador NO. Además, en nuestros estudios recientes hemos demostrado que GSH es vital para el control del crecimiento intracelular H37Rv en J744.1 macrófagos [41].

Se ha informado de que la producción de IFN-γ es crucial para el control de M. Infección de la tuberculosis [18]. Alteración de la producción de IFN-γ se correlaciona con la progresión de la inmunodeficiencia y está probablemente relacionado con anormalidades en el IL-12-IFN-γ eje [8, 31]. Por lo tanto, el crecimiento de la prueba H37Rv en HMDM de sujetos sanos que no son estimulados in vitro o con IFN-γ, LPS. Se observó un significativo, cuatro veces más en el crecimiento dentro de H37Rv no HMDM, entre el 1 h, y 7 días (Figura 1a]. H37Rv estimulación de las células infectadas HMDM con IFN-γ, LPS también dio lugar a un triple aumento en el crecimiento de H37Rv intracelulares (Fig 1a]. Desde nuestros estudios anteriores sugiere un papel para GSH en la inmunidad innata contra M. La tuberculosis, probamos si NAC induciría HMDM tratamiento para inhibir el crecimiento de H37Rv. Hemos observado que en la NAC 10 mM concentración inducida por la inhibición de crecimiento H37Rv en tres de cada seis individuos sanos sometidos a la prueba (Fig 1b]. Aunque los niveles normales de GSH están presentes en células derivadas de sujetos sanos, los niveles podrían disminuir durante el estrés oxidativo y nitrosative generados durante la infección tuberculosa. Por lo tanto, la adición de NAC causada HMDM a la inhibición del crecimiento de M. La tuberculosis por el aumento de los niveles de GSH intracelular. Estos resultados sugieren que la inhibición del crecimiento de H37Rv en NAC tratada HMDM se debe a los efectos directos antimicobacterianos de GSH. Además, la incapacidad de HMDM de algunos individuos sanos para inhibir M. Crecimiento de la tuberculosis se debe probablemente a la incapacidad de los macrófagos para mantener adecuados niveles de GSH, a pesar de NAC tratamiento.

Como se describió antes, la inmunidad innata y adaptativa son esenciales para el éxito de la eliminación de M. La tuberculosis. Macrófagos interaccionan con otras células inmunes in vivo, para el éxito de retraso en el crecimiento de M. La tuberculosis. La sangre total modelo de la infección se asemeja a un sistema vivo en la promoción de interacciones celulares. Este modelo difiere de otros modelos de la infección intracelular en la sangre que todos los elementos están representados. La infección de la sangre culturas de los voluntarios sanos con H37Rv resultado en un casi dos veces más en el crecimiento H37Rv (Fig. 1c]. El aumento en el crecimiento H37Rv fue estadísticamente significativa. En contraste con HMDM, el tratamiento de los cultivos de sangre con NAC (10 mM) causado H37Rv inhibición de crecimiento, en todos los siete individuos a prueba (Fig. 1c]. Nuestros resultados sugieren que la inhibición del crecimiento de H37Rv NAC tratada en cultivos de sangre se debe a los efectos directos antimicobacterianos de GSH y debido a la activación de células de la sangre inducida por GSH.

Hemos confirmado la labor de otros, que son los niveles de GSH disminuyó en los pacientes con infección por VIH-1 [5, 11, 14, 23] y, a continuación, la hipótesis de que esta disminución se asocia con la reducción de la capacidad de los monocitos a matar intracelular M. La tuberculosis. Además, propone que NAC tratamiento mejoraría el asesinato de M. La tuberculosis. Hemos probado nuestra hipótesis mediante la determinación de los niveles de GSH en la sana y sujetos VIH positivos. Se observó un significativo y más del 50% de disminución en los niveles de GSH en PBMC de RBC y pacientes con VIH que en los sujetos sanos (Fig 2a, 2b]. Desde GSH aumenta inmune innata y adaptativa funciones, la deficiencia de GSH en PBMC puede contribuir a la progresiva disfunción inmune de la infección por el VIH. Los macrófagos juegan un papel central en la infección por el VIH y la tuberculosis, ya que son de las primeras células a la infección [19]. Además, los macrófagos son un importante reservorio para el VIH y la M. La tuberculosis. El principal obstáculo para la erradicación del VIH es el virus latente en estos embalses, que ha impulsado la búsqueda de nuevos fármacos y estrategias para proteger a este compartimento de la célula. Eritrocitos, se han utilizado como sistema de transporte para entregar antirretrovirales a los macrófagos moléculas selectiva. Fraternale et al [19] han informado de que el tratamiento de ratones con AZT + + GSH-DD1 cargado RBC reduce significativamente el contenido de ADN proviral, en comparación con los ratones tratados con AZT + DD1. Este resultado es consistente con nuestra hipótesis, y sugiere que los bajos niveles de GSH en la RBC, como se observa en este y otros estudios, afectará a la GSH porteador funciones de RBC, comprometer GSH entrega a los macrófagos.

Con el fin de determinar los efectos de la NAC en el tratamiento PBMC RBC y en la reducción del crecimiento de H37Rv intracelular, sangre total culturas del VIH los pacientes fueron tratados in vitro con NAC y infectadas con H37Rv. Hemos observado un crecimiento significativo de H37Rv no en cultivos de sangre de pacientes con VIH (Figura 3a]. NAC tratamiento in vitro de cultivos de sangre para VIH temas derivados de la inhibición causados en el crecimiento de H37Rv intracelulares (Fig 3b]. Además, la BSO de tratamiento derogado el efecto inhibidor ocasionado por el tratamiento NAC (Fig. 3c]. Esto sugiere que la restauración de los niveles de GSH en sujetos VIH causados mejora en funciones de la célula inmune para contener M. Crecimiento de la tuberculosis.

El contenido de GSH disminuyó en células inmunitarias de los seropositivos, fue al menos en parte atribuirse a la disminución en el plasma de cisteína en plasma y el aumento de glutamato (un inhibidor de cisteína permeación Xc-a través del sistema de transporte), como se observó en los primeros meses de la infección. La disminución de GSH intracelular de cisteína y de plasma observado en pacientes con VIH se debe a la crónica de estrés oxidativo, que puede dar lugar a la progresión de la enfermedad. La menor disponibilidad de cisteína se puede superar, en cierta medida, por la cisteína precursor NAC [13]. Un informe reciente de un ensayo clínico llevado a cabo con cuidado indica que el tratamiento NAC mejora la situación clínica y los retrasos de la progresión de la enfermedad del VIH [24]. Este estudio mostró que la administración a largo plazo de NAC a los pacientes de SIDA mejora su perfil hematológico, GSH contenido y la esperanza de vida [24].

Se midió los niveles de citoquinas en sangre cultura sana y sobrenadantes de los sujetos infectados por el VIH. Sin tendencia clara en el perfil de citoquinas se observó en sujetos sanos. Curiosamente, se observó que la infección in vitro con H37Rv inducida por toda la sangre de pacientes con VIH culturas para sintetizar aumento de los niveles de citocinas como la IL-1, TNF-α, IL-6 e IL-10 (Fig 4, 5]. IL-1, TNF-α, IL-6 son los principios de citoquinas pro-inflamatorias producidas por monocitos después de varias infecciones bacterianas y compartir una amplia gama de actividades biológicas [4, 5]. Los estudios in vitro han demostrado que la micobacteria preparativos, incluida lipoarabinomannan , Pueden ser causa de la liberación de TNF-α e IL-1 de PBMC humanos [25, 42, 44].

La liberación de citoquinas pro-inflamatorias después de la infección micobacteriana es un anfitrión de la respuesta inmune que puede ser propicio o nocivos para el anfitrión. Newman et al. Informó de que el aumento de la supervivencia de M. Avium intracellulare (MAI) en aislados macrófagos se correlaciona con la eficiencia con la que el TNF-α y la IL-6 se producen en respuesta a la infección por MAI [28]. No obstante, el aumento de los niveles de estas citoquinas pro-inflamatorias pueden ser negativo para el anfitrión, ya que no sólo causa de fase aguda eventos, tales como fiebre, pero también mediar caquexia, y necrosis hemorrágica letal shock [29, 30, 37]. TNF-α por los clásicos cascada que se conoce a un máximo de regular los niveles de IL-1 e IL-6.

Niveles elevados de IL-6 están presentes en el plasma de pacientes con tuberculosis [15]. Estudios realizados por Van Heyningen et al [39] indican que los macrófagos infectados con M. Bovis BCG liberados abundante de IL-6 que a su vez inhibe la capacidad de los macrófagos para inducir la proliferación de células T CD4 de hibridoma. Nagabhushanam et al. [26] informó de una novedosa función de la IL-6 en la inhibición de la respuesta inmune celular a erradicar M. La infección tuberculosa. Sus estudios demuestran que la IL-6 producida por M. Macrófagos infectados por la tuberculosis inhibe selectivamente los macrófagos en respuesta a IFN-γ. En otras palabras, la secreción de IL-6 por M. Macrófagos infectados por la tuberculosis-puede contribuir a la incapacidad de IFN-γ para erradicar M. Infección de la tuberculosis [26].

Los altos niveles de IL-6 liberada por los macrófagos infectados tienen consecuencias para la co-infección con el VIH [32]. Infecciones por micobacterias son una de las más comunes enfermedades que definen el SIDA, y puede incluso acelerar la progresión a SIDA [17]. Las dos infecciones parecen crear sinergia, causando un cambio de anfitrión-patógeno saldo a favor del agente patógeno, que no puede ser revertida por el tratamiento con agentes antimicobacterianos [43].

TNF-α e IL-6, así como la IL-1, puede aumentar la replicación del VIH [3, 21]. Así, la reducción de las citoquinas pro-inflamatorias producción in vivo puede mejorar el control de la replicación viral. Niveles elevados de IL-6, TNF-α y la IL-10 se han descrito anteriormente en los casos de enfermedad avanzada por VIH [1, 20, 22]. Por lo tanto, los aumentos en los niveles de citoquinas pro-inflamatorias causará un bucle de retroalimentación positiva en la que las dos infecciones se complementan entre sí, dando lugar a la progresión acelerada de ambas enfermedades.

En nuestros estudios, hemos observado que el tratamiento NAC causado baja regulación de la síntesis de IL-1, IL-6 y TNF-α (Fig. 4a, 4b, 4c], y sobre regulación de la síntesis de IFN-γ ( Fig 4d]. Estos resultados sugieren que el GSH podría tener un papel crucial en vivo en la reducción de los niveles de citoquinas pro-inflamatorias de proteger el anfitrión contra la progresión de la enfermedad.

La tuberculosis activa se asocia con la supresión de las respuestas de células T [17] y el aumento de la producción y la actividad de los inmunosupresores como la IL-10. IL-10 ha demostrado ser producido por los macrófagos infectados con micobacterias. IL-10 y TGF-β se superponen entre sí en muchos de sus efectos biológicos, incluyendo, la inhibición de la proliferación de las células T y la producción de IFN-γ [21]. Niveles elevados de IL-10 en suero durante avanzados de la infección por el VIH puede aumentar supresión inmunológica, que permite las infecciones oportunistas [21]. En nuestros estudios, hemos observado que el tratamiento NAC disminuyó los niveles de IL-10 a favor de la activación inmune (Fig. 5b].

Demostramos la inhibición de crecimiento intracelular H37Rv en nuestros estudios in vitro utilizando NAC tratados con cultivos de sangre de pacientes con VIH. Además, el tratamiento de los cultivos de sangre con NAC modula la producción de citocinas en favor de la acogida. Como se describe en el modelo (Fig. 6a], nuestros resultados indican que el aumento de las células inmunes y de GSH antimicobacterianos funciones son importantes para el crecimiento de H37Rv control de la tensión arterial de las culturas saludables y los sujetos infectados por el VIH (Fig 6a]. Además, el NAC tratamiento regulado por la síntesis de IL-10 y de las citoquinas pro-inflamatorias en la sangre culturas de los sujetos infectados por el VIH a favor de la activación inmune (Fig 6b]. Actual de las intervenciones para prevenir la tuberculosis en las zonas donde la tuberculosis y el VIH son endémicas, como el África subsahariana, tienen serias limitaciones. ART está limitada por su costo y por su exigencia de un sofisticado sistema de atención de salud. Isoniazida quimioprofilaxis ha limitado la eficacia en las regiones de alta transmisión de la tuberculosis, sobre todo en las personas muy susceptibles con infección por el VIH avanzada. Además, la isoniazida INH es ineficaz contra cepas resistentes a la tuberculosis, que puede dar cuenta de 10-20% de todos los casos en algunas zonas. NAC es de bajo costo y no tóxicos (se considera un complemento alimenticio en los EE.UU., y está disponible sin receta en tiendas de alimentos de salud). Los resultados de este estudio puede conducir a la investigación a largo plazo que será de importancia potencial para el control de la tuberculosis en todo el mundo.

Agradecimientos

Esta labor cuenta con el apoyo de la Fundación UMDNJ Grant (VV), y la Asociación Americana del Corazón-Desarrollo Científico 0335370T Grant (VV). Los autores reconocen la división de Enfermedades Infecciosas y UMDNJ NIH AI34436 de apoyo parcial. Reconocemos doctor Jerrold Ellner útil para los debates. Damos las gracias a Yaswant Kumar Dayaram de asistencia técnica y de la lectura del manuscrito. Damos las gracias a todos los pacientes, voluntarios sanos, y el Centro de Sangre de Nueva Jersey, para darnos muestras para este estudio.