Beilstein Journal of Organic Chemistry, 2005; 1: 10-10 (más artículos en esta revista)

Hacia práctica biocatalíticos Baeyer-Villiger reacciones: la aplicación de una enzima termoestable gramo en la escala de síntesis ópticamente activos-lactonas en un período de dos líquidos-sistema de fase

BioMed Central
Frank Schulz (schulz@mpi-muelheim.mpg.de) [1], François Leca (leca@mpi-muelheim.mpg.de) [1], Frank Hollmann (hollmann@mpi-muelheim.mpg.de) [1] , Manfred T Reetz (reetz@mpi-muelheim.mpg.de) [1]
[1] Max-Planck-Institut für Kohlenforschung Kaiser-Wilhelm-Platz 1, D-45470 Mülheim / Ruhr, Alemania

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Resumen

Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs) son muy prometedoras catalizadores útiles para reacciones de oxidación enantioselectiva de cetonas, en química orgánica, pero no ha utilizado ampliamente debido a varias razones. Entre ellos figuran la inestabilidad de las enzimas en el caso de los estudios in vitro e in vivo, incluso los sistemas de reactivos y productos de inhibición, problemas con la ampliación de la escala y la necesidad de utilizar equipo especializado. El presente estudio demuestra que el térmicamente estable phenylacetone monooxigenasa (PAMO) y, recientemente, la ingeniería mutantes puede ser usado como un catalizador para la práctica enantioselectiva Baeyer-Villiger oxidaciones de varias cetonas en una escala preparativa bajo condiciones in vitro. Con este fin varios parámetros tales como la amortiguación de la composición, la naturaleza de la solvencia del sistema y la co-factor de regeneración del sistema optimizado. En general bastante versátil y eficiente sistema catalítico para enantioselectiva escala de laboratorio BV-oxidaciones de cetonas fue desarrollada, que puede ser fácilmente aplicada incluso por los químicos orgánicos que no están muy versados en el uso de enzimas.

Introducción

Por primera vez en 1899, la Baeyer-Villiger (BV) reacción de cetonas con la formación de ésteres o lactonas se ha convertido en una útil y fundamental de reacción en la síntesis orgánica. [1 - 11] El valor práctico de estos productos para una variedad de aplicaciones en la Campos de los productos farmacéuticos y agroquímicos desde entonces ha impulsado el desarrollo de los catalizadores y los reactivos para este tipo de transformación. Catalítico rutas se han notificado utilizando metales de transición, [3, 6, 12] flavins, [13 - 15] y biocatalizadores - los llamados Baeyer-Villiger monooxygenases (BVMOs). [7 - 11, 16 - 26] Especialmente se BVMOs Particularmente interesante ya que a menudo se combinan con alta stereoselectivity ambientalmente benignas condiciones de reacción. La primera BVMO ser identificado fue cyclohexanone monooxigenasa (CHMO). [10] Siguiendo el trabajo pionero del Taschner relativa a la aplicación de CHMO como stereoselective biocatalyst en la síntesis orgánica, [23] este BVMO sigue siendo el más utilizado la enzima de su tipo . [16 - 18, 22, 24 - 30]

A pesar de las prometedoras características, y casi 30 años de investigación sobre su bioquímica, BVMOs no han encontrado una aceptación generalizada como enantioselectiva catalizadores a escala de laboratorio para la síntesis orgánica. [31, 32] En primer lugar, se limitan a BVMOs reacción acuoso en el que la mayoría de los medios de comunicación sintéticamente interesante sustratos Son escasamente solubles. Como resultado de ello, en la mayoría de los casos sólo poco espacio de tiempo se pueden alcanzar rendimientos. Además, BVMOs son cofactor dependiente de las enzimas, es decir, que requieren cantidades de stoichiometric costoso e inestable nicotinamides (NAD (P) H) para la reducción de O 2-activación. [33 - 35] Otro reto es el factor de coste de los mismos BVMOs , Ya que su uso requiere generalmente tediosos pasos de purificación. Estas complicaciones son frecuentemente dirigidas por el desempeño de biocatalíticos BV-oxidaciones in vivo, es decir, utilizando su conjunto, metabólicamente activas las células microbianas. [27 - 29] Plenario de células biocatálisis, sin embargo, tiene algunos inconvenientes graves, como la necesidad de utilizar personal especializado y equipo Que puede no ser un problema en la industria, pero sin duda es en la mayoría de los químicos para los laboratorios académicos. Además, los rendimientos suelen ser bajos debido al sustrato y de la toxicidad de los productos indeseables de reactivos y el metabolismo. [30] Así, en química orgánica son a menudo reacios a utilizar la utilidad de catalizadores BVMOs la hora de planificar las rutas sintéticas.

Por lo tanto, concluir que en el caso de BVMOs, al menos de mediano plazo, sólo in vitro biocatálisis tiene el potencial de lograr una verdadera preparativa relevancia para la mayoría de los químicos orgánicos. Esto incluye a los que desea aplicar BVMOs sólo de vez en cuando. En ruta con el objetivo de la prestación BVMOs muy prácticos catalizadores, diversos problemas han de cumplir. A menudo, BVMOs son específicas para su sustrato natural resulta en pobres o incluso ninguna actividad con otros compuestos. Este problema, sin embargo, se puede considerar que hay que resolver ahora como diversas herramientas genéticas están a la mano con la que enantiodiscrimination espectro y el sustrato de una enzima puede ser controlado. [36 - 38] A lo largo de estas líneas nos informó recientemente de la evolución de los dirigidos de stereoselectivity CHMO de sustratos que se oxidan con enantioselectivity pobres cuando se utiliza el de tipo salvaje (WT) enzima. [39, 40] Un gran desafío surge con la necesidad de aumentar la eficiencia de la BVMOs, específicamente en términos de espacio-tiempo el rendimiento y el costo Eficiencia de la enzima y cofactor. En particular, la solubilidad de la hidrofóbicas sustrato necesario incrementar al mismo tiempo la actividad y la estabilidad de la biocatalyst en virtud de la reacción en condiciones antinaturales. Además, BVMOs aisladas como las enzimas son muy inestables y requieren especial cuidado en la producción y manipulación. [41, 42] Por último, los disolventes orgánicos tienen un efecto adverso en la estabilidad, sin embargo, puede ser necesario a fin de alcanzar los altos rendimientos de espacio-tiempo.

En la presente contribución que abordar las limitaciones antes mencionadas y el informe escala preparativa enantioselectiva BV-oxidación de rac-biciclo [3.2.0] hept-2-en-6-uno (1) a 2-phenylcyclohexanone (5) de una manera Orgánicos sintéticos que cualquier farmacia puede realizar. En particular, nos demuestran que un BVMO puede ser estabilizado en un aequeous orgánica-fase líquida de dos medianas en condiciones de reacción y con una alta concentración de varios sustratos.

Elegimos phenylacetone monooxigenasa (PAMO) como la BVMO, que se registró por primera vez por Fraaije, Mattevi y compañeros de trabajo en 2004. [43, 44] Su termoestabilidad hace PAMO un prometedor candidato en el desarrollo de sólidas y económicamente atractiva BVMO basada en reacciones , A pesar de que tiene una estrecha gama de sustrato. Este problema fue resuelto, en cierta medida, por el nuevo diseño racional de la WT-PAMO con la formación de las P1, P2 y P3 mutantes muestran un perfil alterado sustrato. [45] Por lo tanto, PAMO se transformó en un "Phenylcyclohexanone Monooxygenase" (PCHMO), la aceptación de 2-no sólo phenylcyclohexanone sino también algunos otros sustratos. [45] En el presente estudio hemos demostrado la aplicación práctica de WT-PAMOs y de la ingeniería para la síntesis orgánica. En particular, se evalúa el alcance y las limitaciones de ambos in vivo e in vitro utilizando la biocatálisis PAMO mutantes (PCHMOs) disponible actualmente en nuestro laboratorio. Una estrategia general para la preparación de prácticas biocatalíticos enantiopure lactonas BVMOs basa en la propuesta.

Resultados y Discusión

La venta en el comercio rac-biciclo [3.2.0] hept-2-en-6-de un (1) punto de referencia común es un sustrato para la BVMOs. Es fácilmente oxidados por CHMO enantioselectiva en un curso y los productos de esta oxidación son valiosos intermedios en la síntesis de prostaglandinas. [31, 32, 46]

En primer lugar, hemos evaluado la stereoselectivity de la oxidación de 1 en estándar de células enteras utilizando catálisis WT-PAMO y las tres enzimas mutante (P1-P3) informó recientemente por nuestro grupo (Esquema 1]. [45]

Para el WT-PAMO encontramos después de un tiempo de reacción de 24 hectáreas de conversión de 43% y regular para enantioselectivity lactonas (-) 2 (+) y 3 (Cuadro 1]. La conversión fue mejorado notablemente con mutantes P1, P2 y P3 a más del 95% en las mismas condiciones de células enteras, lo que indica claramente una mayor actividad de la enzima. Además de P2 y P3 de alta enantiopurities para ambos productos lactonas se lograron. Este resultado es una reminiscencia de la observación anterior de que estas PAMO-mutantes muestran un aumento de la eficiencia y stereoselectivity oxidantes en ciertas cetonas cíclico, en relación con WT-PAMO. [45]

Inicialmente, estos experimentos se realizaron con una baja concentración de sustrato 1. Lamentablemente, una caída drástica en la conversión se observó cuando el pote de concentración se aumentó a más de 1 g / L al utilizar PAMO mutante P3 (Figura 1]. Una explicación plausible es el sustrato y / o inhibición de productos como se informó anteriormente en el caso de CHMO-oxidación catalizada sustrato de la misma. [31]

Con el fin de superar esta inhibición hemos probado el uso de una segunda fase líquida, en su totalidad de células usando una catálisis de agua-fase orgánica inmiscible para servir como sustrato de depósito y sumidero producto. La plena conversión podría obtenerse utilizando dioctylphthalate como la fase orgánica (media: dioctylphthalate = 1:1) con sustrato niveles de hasta 3 g / L, de 1. Sin embargo, nuevos incrementos llevado a la disminución de conversión, que es de nuevo una señal de sustratos y / o inhibición de productos. Mejora significativa sólo se puede esperar el uso de más polares orgánicos fases más favorables que permitan la compartimentación de los reactantes entre la fase acuosa y orgánica. Tales disolventes orgánicos, sin embargo, no son compatibles con toda la célula de la catálisis. [47]

Por lo tanto, evaluaron in vitro de la catálisis, inicialmente utilizando phenylacetone (4) como el sustrato. Tal catálisis utilizando monooxygenases exige eficiente reciclaje de los redox-cofactor NADPH. Con este fin una serie de sistemas se han descrito. De hecho, varias enzimas de los sistemas de reciclaje, están disponibles en el comercio. [48 - 50]

Para eficiente BV-oxidación catálisis con PAMO, la regeneración del sistema debe cumplir con varios requisitos. La enzima tiene que ser de fácil acceso. Para esos efectos la E. Coli sistema de expresión sería apropiado debido a la facilidad de manejo de este microorganismo. El reciclaje de enzimas termoestables debe ser, al menos, en la medida de la producción de enzimas PAMO y, además, deben presentar un elevado grado de tolerancia hacia los disolventes orgánicos. Estamos especuló que termoestables alcohol deshidrogenasas podrán cumplir con estas exigencias y decidió utilizar la secundaria alcohol deshidrogenasa (ADH 2 °) de Thermoanaerobacter ethanolicus. [51 - 56] Este 2 ° ADH se oxida alcoholes secundarios como isopropanol a las correspondientes cetonas, lo que equivale un reciclaje De NADPH que luego pueden ser utilizados por PAMO en un acoplado de reacción (Esquema 2]. La purificación de esta enzima de una sobre-expresión de E. Coli cepa resultó ser sencilla, simple tratamiento térmico de la leche es suficiente para purificar hasta cerca de la homogeneidad. [56]

Con el fin de estabilizar la producción de la enzima en presencia de una fase orgánica, que evaluaron diversos aditivos, como buffer azúcares, detergentes no iónicos, y la albúmina sérica bovina (BSA), que se sabe que ejercen efectos beneficiosos sobre otras enzimas. [57] Siendo el efecto más pronunciado en la estabilidad de la enzima resultado de la utilización de detergentes. En general hemos encontrado que consiste en un buffer 50 mM Tris-HCl (pH 8,0 a 40 ° C), 2 g / L de BSA, 5% (w / v) de glucosa, 5% (w / v) de la lactosa, y el 0,1% (v / V) de Tween-20 a ser óptima en el mantenimiento de la estabilidad PAMO. La influencia de los diferentes disolventes se ensayaron en una mezcla 1:1 en virtud de la reacción en las condiciones previstas (40 ° C, vigorosa mezcla). Desde la selección de los disolventes, ciclohexano demostrado ser más adecuado, que exhiben moderada influencia en la estabilidad de PAMO, y metil terc-butil éter (MTBE) se mostró como segundo mejor. Sin embargo, en el caso de ciclohexano, un 50% de la actividad de la enzima se pierde durante los primeros cinco minutos de incubación (Figura 2]. Para los otros disolventes de este efecto es aún más pronunciada. Después de este breve período inicial de la pérdida de actividad de la enzima producto mucho más lento. El 2 ° ADH presenta una menor dependencia de su actividad en el disolvente y la composición de amortiguación y es en general más estable que PAMO. Curiosamente, ninguna correlación aparente puede ser trazada entre la hidrofobicidad del disolvente (expresado como logP) y PAMO la actividad y la estabilidad, como se constató en el caso de la catálisis de células enteras. [47] Esto está de acuerdo con los resultados encontrados previamente por Otros sistemas. [58]

Optimización de las condiciones de reacción se realizó a través de phenylacetone barato (4) y WT-PAMO como un sistema modelo. Nuestro objetivo era desarrollar un procedimiento simple que permite cualquier químico orgánico de manejar un catálisis enzimática con el estándar BVMO utilizando equipo de laboratorio y sin formación especial, por ejemplo, en técnicas de trabajo estéril. Llegamos a la conclusión de que puede ser posible la utilización normal de vidrio, una barra magnetica de agitación y de un baño de aceite para ejecutar las reacciones. Además, las enzimas debe ser fácil de manejar sin refrigeración u otras precauciones especiales. Para ello, hemos utilizado la aclaró lisado de la E. - Coli y células a un tratamiento térmico que a 50 ° C durante 1 h. Después de la centrifugación de nuevo para aclarar el lisado, la solución resultante enzima se utilizó sin mayor purificación. La fracción de PAMO de la proteína total se estimó después de la electroforesis en gel por tinción de Coomassie a ser alrededor de un 35%, la concentración de proteínas totales, medido por un ensayo de Bradford era de 800 μ g / ml, lo que resulta en una actividad específica de 3,75 U / mg Del total de proteínas (1 U corresponde a la cantidad de enzima que consume 1 μ mol / min de NADPH a 25 ° C). Para el 2 ° ADH se procedió de manera similar y la enzima purificada por bomba de calor, el tratamiento de las células de E.coli resuspendido en buffer Tris-en 85 ° C durante 15 min, seguido de 15 minutos a 72 ° C, y posteriormente se centrifuga Como anteriormente. La enzima resultante soluciones se pueden almacenar a temperatura ambiente durante días o en el 4 ° C durante semanas sin pérdida significativa de actividad. Para el almacenamiento a largo plazo alícuotas de la enzima solución fueron congeladas a -80 ° C.

La configuración inicial de la catálisis experimentos era un matraz de cristal-en cada caso, bien ventilado y con aire y equipado con un agitador magnético y un reflujo refrigerador para evitar la evaporación del disolvente. Una reacción de la temperatura de 40 ° C fue elegido como un compromiso entre la enzima NADPH-cofactor y la estabilidad por un lado, y la alta actividad de la enzima por el otro. En la reacción se utilizó significativamente mayor actividad NADPH-regeneración (4 U / mL de 2 ° ADH) que PAMO-actividad (0,6 U / mL) para forzar el equilibrio de NADPH / NADP + estar en la reducción de lado. Así, no sólo cinética de inhibición de la reacción deseada oxigenación debido a la limitación de NADPH-burlaron. La estabilidad de la propia cofactor fue también aumentaron, ya que NADP + es bastante inestable en virtud de las condiciones básicas. [59]

Isopropanol, siendo la más eficaz stoichiometric sacrificio de donantes de electrones, como resultado redujo significativamente la estabilidad de las enzimas utilizadas. La máxima concentración de isopropanol en virtud de la cual ambas enzimas muestran óptima actividad resultó ser el 5% (v / v). Con el fin de mejorar la conversión, hemos añadido la reducción de los excedentes de los equivalentes, en forma de 2-pentanol como un sacrificio sustrato. Así, debido a la más favorable de particionado coeficiente de 2-pentanol entre la acuosa y la fase orgánica, la disminución de las concentraciones de alcohol en la fase acuosa que se puede lograr. En general, el sistema de beneficios de las dos fases líquidas en dos aspectos, primero por eludir efectos inhibitorios de los sustratos y productos de la enzima de la producción y la segunda por evitar los efectos perjudiciales del alcohol. A raíz de este protocolo, es posible llevar a cabo la oxidación de la BV-phenylacetone (4) con la formación de éster 5 en concentraciones de hasta 1 g / L con un 80% de conversión dentro de las 24 h.

Con este protocolo optimizado Evaluación de la oxidación de cetonas rac-biciclo [3.2.0] hept-2-en-6-de un (1) (Esquema 1] y rac-2-phenylcyclohexanone (6) (Esquema 3]. Como delineadas anteriormente, ambos se convierten cetonas enantioselectively por mutante P3 en la catálisis de células enteras (Tabla 1].

Nos complace observar enantioselectivities esencialmente idénticos en la aplicación de la catálisis in vitro (1 cetona para comparar el cuadro 1; cinética de la resolución de 6 de cetonas se caracteriza por un factor de la selectividad de E = 100, el 7 lactona enantiopurity de ser el 95,4% ee (R) ).

Cetona 1 podría ser cuantitativamente oxidados en una concentración de 5 g / L para el correspondiente producto lactonas dentro de las 24 h, pero en una concentración de 20 g / L de conversión se redujo a 50-60%. En este caso, el correspondiente alcohol, el biciclo [3.2.0] hept-2-en-6-ol, también fue obtenido en hasta un 30% de rendimiento, es de suponer que el producto de la reducción en un 2 ° ADH. Esto abre la oportunidad para iniciar la reacción no a partir de la cetona, pero ya a partir de las correspondientes alcohol en una forma más elegante, eludiendo así el sacrificio de alcohol. [60] En general, se concluye que la originalmente observada de reactivos y productos en la inhibición de células enteras Catálisis ya no es el problema.

El buen BV-oxidación de cetonas 6 en concentraciones de 5 g / L no causó problemas a raíz de una ligera modificación. En este caso, la reacción fue encontrado para ser más eficaz cuando se utilizó como MTBE en la segunda fase, muy probablemente debido a la baja solubilidad del sustrato de ciclohexano. La cinética de resolución llegado a la óptima del 50% después de la conversión de aproximadamente 24 h. A la ampliación de la escala de gramo cantidades se straight-forward sin cambios en el procedimiento.

En general hemos obtenido los números de volumen de negocios (TONs), de más de 30000 para el P3-PAMO-BV-oxidación catalizada de cetona 1, que a lo mejor de nuestro conocimiento no tiene precedentes para la flavina monooxygenases dependen de los productos básicos en la presencia de disolventes orgánicos (Tabla 2] .

P3-PAMO se encontró que se activa por más de diez horas en la reacción sin ninguna pérdida de actividad (Figura 3] y la exposición a los tipos de reacción que corresponden a los que se encontraron anteriormente en el estado de equilibrio de análisis cinético en ausencia de orgánicos Disolventes para cetona 6 como sustrato. [45]

Por lo tanto, la adición del disolvente orgánico no reducir significativamente la estabilidad de la enzima cuando el buffer se utiliza optimizado. Esto no se logró previamente relacionados con los sistemas y sobre todo no es posible al utilizar enzimas inmovilizadas, un método estándar para la estabilización de ellos. Consideramos que este estudio como paso fundamental hacia una práctica BVMOs, porque PAMO, la P1-P3 mutantes y presumiblemente futuro PAMO variantes-Ahora se puede utilizar en una simple escala preparativa procedimiento.

Se comparó el sistema desarrollado en este estudio a un análogo sintético de la organocatalyst enantioselectiva BV-oxidación, tal como se describe por Murahashi et al. En el año 2002. [13] El Murahashi sistema está relacionado con PAMO, ya que también utiliza un derivado de la flavina dentro de un catalizador quiral medio ambiente. Por supuesto, los pesos moleculares de los catalizadores difieren enormemente. Sin embargo, la comparación muestra que el PAMO-BV-oxidación catalizada es, de hecho, en la práctica de laboratorio en términos de escala stereoselectivity, catalizador de la productividad y la estabilidad y, por último, también en la facilidad de llevar a cabo estas reacciones (Tabla 3].

Conclusión

En conclusión, este estudio representa el primer protocolo para realizar stereoselective biocatalíticos Baeyer-Villiger oxidaciones in vitro en un laboratorio de química orgánica. A raíz de las técnicas de producción estándar de la fermentación de las enzimas es straighforward. Tediosos pasos de purificación de las enzimas resultado ser innecesario.

Más experimentos acerca de una alternativa de reciclaje sistema NADPH-Se están realizando actualmente en nuestro laboratorio, en concreto, con el propósito de eliminar la indeseable reducción del sustrato cetonas. El trabajo futuro se centrará también en la evolución dirigida de PAMO-mutantes con el objetivo de ampliar aún más la gama de sustrato aceptación tiempo que se mantiene alta estabilidad térmica. Verdaderamente práctico y versátil catalizadores de la BV-selectiva reacciones pueden surgir entonces, hacer una comercialización de estas enzimas posible sobre la base del trabajo que aquí se presenta.

Material suplementario
Archivo Adicional 1
Sección Experimental.
Agradecimientos

Reconoce agradecidamente un regalo del plásmido pADHB1M1-kan codificación 2 ° ADH de JG Zeikus y C. Vieille (Universidad del Estado de Michigan, EE.UU.), junto con útiles debates. El apoyo financiero de Alemania y de Israel de Proyectos de Cooperación (DIP) y Fonds der Chemischen Industrie Se agradece.