Plant Methods, 2006; 2: 3-3 (más artículos en esta revista)

Aislamiento de factores de transcripción de plantas modificadas usando una levadura de un sistema híbrido

BioMed Central
Sergiy Lopato (sergiy.lopato @ acpfg.com.au) [1], Natalia Bazanova (natalia.bazanova @ acpfg.com.au) [1], Sarah Morran (sarah.morran @ acpfg.com.au) [1] , Andrew Milligan S (andrew.milligan @ acpfg.com.au) [1], Neil Shirley (neil.shirley @ acpfg.com.au) [1], Peter Langridge (peter.langridge @ acpfg.com.au) [ 1]
[1] Australian Centre for Plant Functional Genomics, The University of Adelaide, PMB 1, Glen Osmond, SA 5604, Australia

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Resumen
Antecedentes

La preparación de expressional bibliotecas de cDNA para su uso en la levadura de dos híbridos sistema es rápido y eficiente cuando se utiliza el producto dedicado Clontech ™, la Biblioteca de Obras y MATCHMAKER Screening Kit 3. Este equipo emplea la tecnología de SMART para la amplificación de ADNc de longitud completa, en combinación con la clonación mediante recombinación homóloga.

Lamentablemente, esas bibliotecas de cDNA preparado directamente en la levadura no puede utilizarse para la recuperación eficiente de los plásmidos purificados y, por tanto, son incompatibles con levaduras existentes de un sistemas híbridos, que utilizan levaduras de transformación para la biblioteca pantalla.

Resultados

Aquí proponemos una adaptación de la levadura de un sistema híbrido para la identificación y clonación de factores de transcripción utilizando una biblioteca de cDNA MATCHMAKER. El procedimiento se demuestra mediante una biblioteca de cDNA preparado a partir de la parte líquida de la multinucleadas coenocyte endospermo de trigo. El método es una modificación de una norma de un protocolo de híbridos, que utilizan un apareamiento paso para introducir la construcción de la biblioteca y reportero construir en la misma celda. Varios novela longitud completa de los factores de transcripción homeodomain, AP2 y dominio E2F familias de los factores de transcripción fueron identificados y aislados.

Conclusión

En este trabajo se propone un método para ampliar la compatibilidad de las bibliotecas de cDNA MATCHMAKER levadura híbrido de dos pantallas a un híbrido pantallas. La utilidad de la levadura de un nuevo híbrido de la tecnología queda demostrado por el éxito de la clonación de trigo de ADNc de longitud completa codificación de varios factores de transcripción de tres familias diferentes.

Antecedentes

Desarrollo de la planta de órganos está determinada por la expresión génica diferencial que se puede regular en muchos niveles diferentes. El principal mecanismo de diferencial de la expresión génica es la regulación transcripcional [1], que está controlada por factores de transcripción que se unen al ADN cis-elementos situados en los promotores de genes y / o intrones. Análisis de los genomas secuenciados factores de transcripción reveló que componen hasta el 10% de metazoos genomas [2] y más de un 5% de los genes de Arabidopsis se han identificado como factores de transcripción [3]. La utilización de los microarrays de datos y algoritmos de agrupación permite la identificación de los genes con similares perfiles de expresión que pueden intervenir en los procesos biológicos similares [4]. Análisis de los promotores de dichos genes pueden identificar elementos comunes cis-, responsable de su co-expresión [5]. Sin embargo, estos datos no revelan los mecanismos de regulación transcripcional debido a la complejidad de las secuencias de promotor, el número relativamente pequeño de elementos reguladores cis-y factores de transcripción que se han caracterizado, y la falta de datos sobre cooperación regulación de la expresión genética en plantas por Varios factores de transcripción simultánea. Para entender transcripcional mecanismos que conducen a la expresión diferencial de genes, los genes tienen que ser experimentalmente coordinados con los correspondientes TFs que regulan su expresión.

Un potente método de identificación de las interacciones proteína-DNA es la levadura de un híbrido (Y1H) sistema que es una variante de la levadura sistema híbrido de dos (Y2H) [6 - 8] Al igual que el Y2H, la Y1H se basa en la estructura de dominio De los factores de transcripción eucariótica, que consiste en una transcripción de activación de dominio (DC) y un dominio vinculante ADN (BD). Una parte de la promotora o putativo tándem copias de la transcripción de ADN elementos de regulación aguas arriba son clonados de un reportero de genes en un vector reportero. En la última versión del método, parte de la reportera vector que contiene el cis-elemento de interés aguas arriba del reportero gen se introduce en el ADN genómico de levadura a través de recombinación homóloga con un gen no esenciales [9]. Esto estabiliza los resultados de la Y1H pantalla y trae la interacción proteína-DNA en el entorno natural del núcleo. El segundo componente del sistema Y1H se comparte con la Y2H sistema. Se trata de una biblioteca de cDNA que expresa una proteína de fusión que la activación constitutiva de un dominio y una variable de dominio vinculante ADN codificado por el correspondiente cDNA. El reportero Y1H cepa se transforma con una biblioteca de cDNA de vectores, y la interacción entre el ADN diana y la proteína híbrida es detectado por reportero de la expresión de los genes [10].

La ventaja de la pantalla Y1H bioquímicas en comparación con las técnicas in vitro, como la cromatografía de afinidad de ADN, o la identificación de las proteínas ADN vinculante visto en los ensayos de cambio de movilidad electroforética utilizando alta resolución electroforesis en dos dimensiones junto con MS [11], es que el Procedimiento no requiere de la optimización específica de las condiciones in vitro. Este método permite el examen de las interacciones proteína-DNA in vivo en las condiciones en el interior del núcleo de la célula eucariótica. Este entorno ofrece a menudo correcto plegamiento y modificaciones de la presa de proteína [12]. Y1H El sistema también permite el uso de elementos conocidos cis-, así como de no caracteriza fragmentos de los promotores para buscar específicamente la interacción ADN-proteínas vinculantes en expressional cDNA bibliotecas [10, 13]. ADN vinculante proteínas que no funcionan en la transcripción y la falta nativo AD (como la remodelación de la cromatina, la replicación del ADN y las proteínas de reparación, y de las enzimas que participan en elementos trasladables movimiento) también se puede encontrar utilizando este enfoque, como un fuerte, es heteróloga AD Añadido a la presa de proteínas [14, 15]. Este método permite la clonación de las familias de los factores vinculantes con ADN conservado dominios que pueden interactuar con la misma cis-elemento de activación del ADN [16 - 19]. El examen de varios millones de las colonias al mismo tiempo hace que el sistema Y1H extremadamente sensible, que permite la clonación de muy baja abundancia de factores de transcripción que puede ser incluso muy ausente de las grandes bases de datos de EST.

Para clonar un grupo de factores específicos se puede hacer de la biblioteca de un determinado tejido, parte de un tejido o de un grupo de células. Métodos para la preparación de esas bibliotecas, de las cantidades limitadas de material de partida, se desarrollaron recientemente [8, 20] y kits para su preparación están disponibles comercialmente. Uno de estos kit, la Biblioteca MATCHMAKER Construcción Kit 3 (Clontech ™, Palo Alta, CA), ofrece un método sencillo para la construcción de bibliotecas de cDNA de expresión Y2H cribado. La biblioteca construcción protocolo integra la eficiencia de la síntesis de la tecnología SMART cDNA [8, 20, 21], con la sencillez de uso de la clonación con fines de recombinación homóloga en levaduras [22].

A pesar de que el Kit de Construcción MATCHMAKER Biblioteca proporciona un método fácil para Y2H selección, la solicitud de pre-hechos MATCHMAKER bibliotecas de cDNA a la Y1H método no ha sido propuesto. Aquí describimos una adaptación de un sencillo y eficaz versión de la Y1H método [9], que permite la proyección de MATCHMAKER bibliotecas de cDNA para la proteína / DNA. La biblioteca de cDNA utilizado en la pantalla Y1H fue preparado a partir de una pequeña cantidad del total de ARN aislado de la parte líquida de trigo endospermo antes y durante la celularización. Se demuestra la eficiencia del método de clonación por varios factores de transcripción trigo utilizando tres diferentes repeticiones en tándem de una conocida de ADN cis-elemento como cebo.

Resultados
Adaptación de la Y1H sistema de bibliotecas de cDNA pantalla expressional preparado de la levadura

Para facilitar la clonación y caracterización de los factores de transcripción de trigo, una planta con un gran y unsequenced genoma, que combina uno de los sistemas existentes Y1H con una rápida y relativamente simple método de preparación de cDNA expresión bibliotecas

La biblioteca de cDNA fue preparado a partir de 2 μ g de RNA total aislado de la parte líquida del endospermo de trigo coenocyte recogidos antes y durante la celularización, de 3 a 7 días después de la polinización (DAP), y fue originalmente diseñado para la pantalla de dos híbridos basados en Levadura de apareamiento. Se prepara usando la levadura MATCHMAKER Sistema 3, que permitió la rápida y relativamente fácil construcción de bibliotecas representante de una pequeña cantidad de tejido mediada por recombinación homóloga en la clonación de levadura.

Como el primer bibliotecas preparado de acuerdo con el manual de Clontech ™ contiene demasiadas inserciones de menos de 600 pb, hemos introducido un pequeño cambio en el método utilizado y CHROMA SPIN + TE-1000 (Clontech ™) en lugar de CHROMA SPIN + TE-400 columnas para CDNA tamaño de fraccionamiento. Según el CHROMA SPIN Columnas Manual de Usuario (PT1300-1), un solo de depuración en la TE-1000 columna elimina aproximadamente el 60% de cDNA de menos de 1 kb. Este cambio en el protocolo aumentado sustancialmente la longitud media de ADNc y, por tanto, la frecuencia de ADNc de longitud completa en la biblioteca en comparación con el método original, sin dejar de preservar la buena representación de corto ADNc. Los resultados de los análisis de PCR de la duración de las inserciones de ADNc seleccionados al azar 24 clones de la biblioteca se muestra en la Fig. 1. La biblioteca se preparó sin amplificación y se almacena como partes alícuotas de la levadura glicerol cultura. Se ha utilizado para Y2H y Y1H pantallas durante más de 4 años después de la preparación, sin cambios notables en la calidad.

Y1H reportero cepas fueron preparados por la clonación de tres a cuatro repeticiones en tándem de: 1) la cis-elementos específicos para dos clases de factores de transcripción homeodomain (HDZipI-II) [23, 24], 2) la Sequía de elemento de respuesta (DRE) de la Rd29A promotor del gen de la Arabidopsis thaliana, específico para la DREB / CBF subfamilia de dominio único AP2-proteínas [25], y 3) la E2F vinculante cis-elemento de la promotora de la ribonucleótido reductasa (RNR) de genes de tabaco [26 ].

El uso de las repeticiones de elementos cis-ayuda a optimizar la distancia entre la planta de regulación y el mínimo elemento promotor de los genes de levadura GAL4.

Oligonucleótidos con secuencias complementarias para cada uno de los tándem cis-elementos (Tabla 1] fueron diseñados de manera que después de recocido que habían extremos protuberantes que se utilizaron para la clonación en NotI NotI-SpeI SpeI sitios de la pINT1-HIS3NB vector binario (inédito, amablemente prestada por Dr PBF Ouwerkerk). El pINT1-HIS3NB vector se obtuvo mediante la clonación NotI NotI-BamHI BamHI fragmento de la pHIS3NB clonación en el vector NotI NotI-BclI BclI sitios de la integración pINT1 vector [9, 12]. Esto permitió solo paso de la clonación con fines de elementos en cis-NotI y la única restricción SpeI SpeI sitios de la vector binario. Constructores de las inserciones que contiene fueron seleccionadas por PCR usando primers del vector. Vaciar vector sirve como una plantilla para el control de los fragmentos de tamaño.

Con el fin de simplificar el análisis electroforético de las pequeñas inserciones, PCR primers fueron diseñados para anneal aproximadamente 50 pb cada lado de la clonación de sitios, dándole la amplificación de vacío de vectores de unos 100 bp. Plásmidos con inserciones posteriormente fueron analizadas por secuenciación utilizando el mismo primers. Integración de la construcción de la levadura en el ADN genómico se realizó tal como se describe en [12]. Reportero cepas, designadas yHDZipI-II, yDRE, y yE2F, respectivamente, se incubaron durante la noche en los medios de comunicación ricos, y se almacena como 1 ml alícuotas de la cultura en glicerol -80 ° C hasta su uso. Antes de cribado, una levadura glicerol cultura fue descongelado a temperatura ambiente y se incubaron durante varias horas en 50 ml YPDA medios de comunicación a 30 ° C, con agitación, para reactivar las células de levadura. Este aumento de la eficiencia de apareamiento de la cepa reportero con la cepa que contiene la biblioteca expressional.

CDNA expresión Y1H bibliotecas de la pantalla por lo general se hizo en E. Coli usando vectores binarios que son capaces de replicar tanto en bacterias y levaduras. Para hacer una pantalla, piscinas de la biblioteca de ADN plásmido purificado de bacterias se transformó en la cepa de levadura reportero. Lamentablemente, bibliotecas de cDNA preparado directamente en la levadura no puede ser utilizado para el aislamiento de grandes volúmenes de la biblioteca de ADN plásmido, y por lo tanto la pantalla Y1H no puede realizarse utilizando el plásmido transformación. Para realizar la Y1H pantalla, acoplada cada cebo reportero cepa de levadura, sobre la base de Y187 (MATa), con la levadura MATCHMAKER Sistema de biblioteca de cDNA 3 preparado en la cepa de levadura AH109 (MAT α). Este enfoque nos ha proporcionado la capacidad de uso, en la levadura de un híbrido pantallas, bibliotecas de cDNA preparado de acuerdo con el método propuesto por Clontech ™. Además, el apareamiento con la cepa AH109 permitido omitir la laboriosa β-galactosidasa filtro de ensayo. En lugar de ello, utiliza MEL1 [27], uno de los genes reportero de esta cepa, junto con la adición directa de la α-galactosidasa sustrato X-α-GAL en medios selectivos, a la tinción de falsos positivos (azul de las colonias) en los platos durante la segunda Ronda de la selección de clones positivos. El promotor de la planta de MEL1 no contiene elementos cis-y no interacciona con los factores de transcripción en concreto, pero sí con un gran grupo de falsos positivos, que interactúan con el promotor MEL1 mínima (Fig. 2].

Una ventaja adicional de este método es que la misma biblioteca de cDNA, preparado a partir de endospermo, posteriormente fue utilizado para la caracterización de los más aislados factor de transcripción de genes. Después de volver a la clonación con fines de ADNc seleccionados factor de transcripción en la pGBKT7 vector (Clontech ™), que se utilizaron como cebo para la identificación de sus socios que interactúan a través de la pantalla Y2H (datos no presentados). La estrategia de la Y1H pantalla, así como la selección y el análisis de los clones positivos se muestra en la Fig. 3.

Resultados de la Y1H pantallas

Para probar el método, optamos específicas cis-elementos reguladores para las familias de factores de transcripción que son de interés en nuestro laboratorio. Estos son factores que se sabe están involucrados en la regulación del destino celular (HDZip TF), la proliferación de las células y tamaño de la celda (E2F), y los factores que pueden estar implicados en la protección de la elaboración de cereales de la sequía o frío estrés (DREB / CBF TF). Algunos de estos elementos-cis se utiliza con éxito como cebo en Y1H pantallas para clonar HDZip y DREB factores de otras especies vegetales [13, 19, 28, 29]. Para otros, como E2Fs, específica interacción entre cis-elementos y factores de transcripción sólo se ha demostrado in vitro, usando gel de ensayos de cambio [26, 30, 31]. La lista de cis-elementos utilizados en el presente documento se muestra en la Tabla 1.

Más de 100 clones positivos fueron aislados en la pantalla con la yHD-ZipI-II cebo cepa. Los clones codificada de longitud total y parcial de ADNc tres diferentes proteínas. Dos de ellos fueron designados TaHDZipI TaHDZipI-1 y TaHDZipI TaHDZipI-2 y representa el 20% y el 76% de todos los clones, respectivamente. Análisis de la secuencia más larga clones mostró el ADNc a ser 1,0 y 1,1 kb, la codificación de las proteínas de 267 y 333 aminoácidos, respectivamente. Comparado con siete alineaciones secuencia HDZip (Oshox Oshox) de las proteínas del arroz [13, 32] se utiliza para confirmar que el de larga duración marcos de lectura abierta de cada gen había sido clonado. Estos alineamientos reveló TaHDZipI TaHDZipI-1 y TaHDZipI TaHDZipI-2 a ser más similar a la del arroz Oshox4 Oshox4 y Oshox6 Oshox6, respectivamente, y determinó TaHDZipI TaHDZipI-1 y TaHDZipI TaHDZipI-2 como homeodomain-leucina cremallera subfamilia I proteínas (Fig. 4A] .

El resto de los clones están representados por cuatro clones independientes (4%), que contiene 1,2 kb codificación de las inserciones en la región de codificación de longitud completa (279 aminoácidos) de una clase II HDZip factor. Esta fue designado TaHDZipII TaHDZipII-1. Tiene el más alto nivel de secuencias de proteínas de identidad con Oshox2 Oshox2 de arroz.

Cerca de 25 colonias fueron aisladas en la pantalla usando repetidas Y1H DRE como cebo. ADNc (con toda la longitud de codificación de las regiones) de los tres factores de transcripción fueron aisladas de las colonias de blancos después de una segunda ronda de selección. Dos factores DREB novela, designado TaDREB2 TaDREB2 y TaDREB3 TaDREB3 fueron clonados a partir de la biblioteca de cDNA preparado a partir de la parte líquida de la sincicial endospermo de trigo. La primera era o bien un orthologue o cerrar homólogo (38,8% de identidad en las secuencias de aminoácidos), de TINY de Arabidopsis. Se trata de un único dominio AP2 factor involucrado en el desarrollo de plantas [33]. TaDREB3 TaDREB3 es una novela único factor de transcripción AP2 dominio con 77,7% de identidad de secuencia de aminoácidos a la HvCBF5 HvCBF5 [34]. La relación entre estas secuencias se muestra en la Fig. 4B. Curiosamente, el tercer factor de transcripción aislado en esta pantalla es un factor de transcripción Myb putativo, designado TaMyb1 TaMyb1. El 1182 bp insertar codifica una proteína de 298 aminoácidos que pertenece a la R2R3 grupo de Myb factores. Dos clones independientes de la misma codificación TaMYB TaMYB se encontraron en la pantalla. Como MYB factores no han sido previamente asociados con el elemento DRE, hemos decidido realizar más pruebas para confirmar que en efecto, esta proteína interactúa con la sequía elemento sensible. Para demostrar esto, Y187, AH109 y cada una de las tres cepas de levadura se describe en este documento, con diferentes elementos vegetales cis-, se transformaron utilizando el plásmido conteniendo TaMYB TaMYB cDNA; encontramos que la expresión de TaMYB TaMYB apoya en el crecimiento selectivo de los medios de comunicación YDRE la cepa sólo, y no es compatible con el crecimiento de los otros cuatro cepas. La interacción de DREB aislados y MYB factores de la DRE Y1H elemento en el sistema se muestra en la Fig. 5.

Varios cientos de colonias fueron seleccionadas en la pantalla con el Y1H cis-E2F elemento como cebo (yE2F cepa). Noventa y seis colonias se utilizaron para la segunda ronda de selección y 94 fueron blanco de los medios de comunicación con X-GAL. El ADNc de las inserciones en blanco colonias se analizaron por PCR y restricción HaeIII HaeIII utilizando para demostrar que todas las 94 colonias figuran los plásmidos con la misma documentación. El codificada insertar un factor de transcripción E2F con el más alto nivel de aminoácidos identidad a E2Fe (DEL1) de Arabidopsis. Este es un importante inhibidor de la endocycle, que preserva el estado mitótico de las células que proliferan por la represión de la transcripción de los genes que se requieren para las células para entrar en el ciclo de ADN endorreduplicación [35, 36]. Todos los clones que figura toda la longitud de codificación de la región, la longitud de la aislados cDNA es bp 1508 y codifica una proteína de 423 aminoácidos, designado TaE2Fe TaE2Fe. El ajuste de la secuencia de aminoácidos de TaE2Fe TaE2Fe a E2Fe factor de Arabidopsis se muestra en la Fig. 4C.

Q-PCR análisis de los niveles de expresión de las proteínas identificadas

La expresión espacial y temporal de los patrones aislados de trigo homeobox que contienen proteínas y DREB proteínas se determinaron por tiempo real o PCR cuantitativa (Q-PCR). ADNc utilizados para estos análisis se deriva de una variedad de tejidos vegetativos y florales, de grano en diferentes etapas de desarrollo (1-20 DAP), y las fracciones de los granos a las 5 de DAP enriquecido ni para el embrión, la parte líquida de la sincicial endospermo O de las capas exteriores del grano (la testa, pericarpio, etc.).

Los datos demuestran una correlación entre la abundancia de mRNAs de clonado factores de transcripción en la planta muestra de tejido y el número de clones independientes de los respectivos ADNc obtenido de la biblioteca de cDNA preparadas a partir de este tejido.

Discusión
Método mejora

Desde el desarrollo de la transcripción reversa y reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) y la genómica y de las bases de datos de EST varias plantas, el aislamiento de genes objetivo se ha convertido en un procedimiento de rutina. Lamentablemente, uno de los problemas es que la aplicación de la RT-PCR se limita a las instalaciones para las que existen amplias bases de datos de EST y donde mRNAs de los genes de interés son suficientemente abundantes como para poder estar representados en las bases de datos de varias tecnologías ecológicamente racionales. Esto no es siempre el caso con las transcripciones raras como los de muchos factores de transcripción. Otro problema que se plantea en el trabajo con las plantas que contienen gran poliploides o genomas, como el pan de trigo, es el aislamiento completo de las secuencias de larga duración ADNc. La aplicación de ambos RACE-PCR y Genoma Caminar es intensiva en mano de obra y no suele ser muy eficaz. Otros métodos de la clonación con fines de cDNA se basan en la utilización de las propiedades del ADN y las proteínas que reconocen y se unen a otras moléculas a través de la proyección de bibliotecas de cDNA de expresión. Entre estos métodos es la levadura de un sistema híbrido que entre otras cosas puede ser usado para el aislamiento de nuevos genes, que codifican proteínas que se unen a una secuencia de ADN objetivo, como elementos reguladores cis-.

Y1H El ensayo es altamente sensible debido a la detección de las interacciones entre las proteínas y el ADN blanco se producen mientras que las proteínas son en su configuraciones in vivo. Las más conservadas evolutionally cis-elementos caracterizan a través de varias especies de plantas (por ejemplo, la Arabidopsis, de arroz o de maíz) puede ser utilizado para el aislamiento de orthologues y homólogos filogenéticamente distantes de las plantas, así como las plantas con genomas complejos o múltiples, especialmente cuando son los métodos de PCR No eficiente debido a la ausencia de datos in silico.

En este trabajo se utilizó con éxito DRE de Arabidopsis y E2F cis-elemento de tabaco para aislar trigo factores de transcripción. Ya que este método permite la detección de varios millones de las colonias al mismo tiempo, la Y1H sistema permite la clonación de ADNc de longitud completa de ADN vinculante proteínas que tienen muy bajos niveles de expresión. Sobre la base de estas ventajas, la Y1H método fue elegido para clonar longitud completa de los factores de transcripción en desarrollo endospermo de trigo.

Para obtener el máximo beneficio de este método, el protocolo Y1H original fue modificado. La primera mejora se introdujo en el método de cribado. El Y1H suele ser intensiva en mano de obra, pues se basa en el aislamiento de la biblioteca de plásmidos de la cepa bacteriana biblioteca de acogida seguida de la transformación de la biblioteca de los plásmidos aislados en el reportero cepa de levadura para permitir la interacción proteína-DNA. Aunque Lambda basada E. Coli, la levadura de lanzadera vector bibliotecas tienen sus ventajas, por ejemplo la posibilidad de introducir la biblioteca en diferentes cepas de levadura, hay varios inconvenientes: 1) los métodos de preparación de bibliotecas en las bacterias suelen ser más laborioso que directamente en la levadura, 2) la Necesidad de ampliar las bibliotecas para el aislamiento de grandes cantidades de plásmidos, que reduce la calidad de las bibliotecas, y 3) la laboriosa y no siempre eficiente levadura de transformación a gran escala deben ser repetidas para cada pantalla.

La modificación del protocolo para la detección Y1H presentan aquí implica la utilización de una levadura de apareamiento paso para introducir la biblioteca plásmido reportero y construir en la misma celda. Esta modificación mejora la eficiencia de la pantalla, impide innecesaria amplificación de la biblioteca de cDNA y elimina la mano de obra medidas de fagos infecciones, el aumento de E. Coli culturas y hacer plásmido maxipreparations. Un representante biblioteca de cDNA de longitud completa enriquecido ADNc puede ser preparado a partir de unos pocos μ g de RNA total directamente en la cepa de levadura (MATa) como se propone en el Clontech ™ MATCHMAKER manual. La biblioteca es luego seleccionadas por el apareamiento con un reportero tensión (MAT α). El uso de la biblioteca sin amplificación conduce, como se demuestra en este trabajo, a una correlación entre la abundancia de mRNAs particular en el ARN original y en la biblioteca preparado a partir de esta muestra.

Una segunda modificación del método se introdujo en la biblioteca de cDNA preparación. Ejecución de cDNA tamaño de las columnas de fraccionamiento distintos de los propuestos en el protocolo Clontech ™ sustancialmente enriquecido la biblioteca con secuencias de longitud completa. Todos ADNc informó aquí estuvieron representados por tanto parcial y total longitud clones. Sólo uno de cDNA a partir del 15 de ADNc de los factores de transcripción clonado en nuestro laboratorio de esas bibliotecas parcial tuvo un marco de lectura abierta. El más largo de toda la longitud del cDNA de largo fue de 3,2 kb (datos no presentados).

La tercera mejora proviene de la utilización de la cepa AH109, que contiene el gen reportero MEL1 en virtud de su propio promotor que contiene un sitio de unión Gal4p. MEL1 codifica el gen α-galactosidasa, que en contraste con β-galactosidasa se secreta de las células de levadura y su actividad puede ser fácilmente detectado por la adición del substrato directa selectiva a los medios de comunicación en vez de la mano de obra filtro de ensayo para levantar β-galactosidasa. El MEL1 gen se utilizó con éxito como reportero negativo para eliminar el grupo de las proteínas que interactúan con el mínimo de GAL4 promotor, que se encuentra en el cebo construir aguas abajo del cis-elemento de interés. Sin embargo, en algunos raros casos, la planta de factores de transcripción pueden activar débilmente GAL4 el promotor y colonias de interés pueden llegar a ser ligeramente azul después de varios días de crecimiento en los medios de comunicación con el sustrato. Se recomienda incluir esas nuevas colonias en la caracterización de secuencias clonadas.

Resultados de la pantalla Y1H

Repite una de las nueve secuencias de base par 5'-CAATNATTG-3 ', ya sea con A / T de la clase I HDZip o G / C para HDZip clase II en la posición [23, 24] se utiliza con éxito anteriormente en una pantalla de un Y1H Biblioteca de cDNA de arroz preparado a los 6 embriones DAP [13]. Si bien, hemos encontrado que tanto la clase Iy clase II HDZip factores de transcripción reconocen cada uno de los cuatro secuencias en la pantalla de Y1H (datos no presentados), cebos utilizados en el presente trabajo contiene cuatro elementos-cis repetido, cada vez con diferentes nucleótidos en el Posición intermedia. Abundancia del clon para cada factor aislado HDZip en la biblioteca de cDNA se correlacionó con la abundancia de ARNm en el tejido utilizado para la preparación de biblioteca. Esto confirma la buena calidad de la biblioteca.

Debido a la relativamente alta abundancia de TaHDZipI TaHDZipI-1 y TaHDZipI TaHDZipI-2 en la biblioteca y la fuerte interacción de las proteínas con el HDZip cis-elemento específico, la aparición de falsos positivos fue muy bajo. Lamentablemente, debido a la relativamente abundantes secuencias, decenas o incluso cientos de clones tienen que ser analizadas para encontrar extremadamente raro ADNc. Por ejemplo, sólo tres TaHDZipII TaHDZipII clones-1 se encuentra en alrededor de 100 colonias analizadas. Ni el uso de cebos con otras secuencias ligeramente cambiado ni análisis de PCR más clones reveló HDZip otros factores de clase Iy II en el trigo sincicial cellularising endospermo y en el 3 al 7 de DAP (datos no presentados).

Varios AP2 de dominio que contienen factores de transcripción de la DREB / CBF subfamilia fueron aisladas de Arabidopsis [28, 29] y [19] de maíz con la ayuda de theY1H sistema. El triple DRE cis-elemento de Arabidopsis ha sido utilizado con éxito en el sistema de Y1H para confirmar la interacción de TaDREB1 TaDREB1 con la sequía de elemento de respuesta de Arabidopsis [37]. Aquí demostramos con éxito el aislamiento de dos proteínas de trigo DREB endospermo Arabidopsis utilizando el mismo elemento de repetición cis-5'-TACCGACAT-3 '. Esto implica que la DRE elemento puede ser utilizado para obtener DREB ADNc de las proteínas de diferentes especies de plantas, ya que la misma es motivo DRE altamente conservadas en todas las plantas estudiadas [38].

Aunque DREB proteínas son inducidas por diferentes tensiones ambientales, niveles muy bajos de sus mRNAs a menudo pueden ser encontrados en este tejidos [39]. Esto puede explicarse tanto por la participación de algunos de estos factores de transcripción en el desarrollo de las plantas, o, naturalmente, la baja cantidad de DREBs puede ser importante para la regulación positiva de su propia expresión. También puede ser que el bajo monto de DREB algunos factores negativos es importante para la regulación de la expresión de otras proteínas DREB durante el estrés [40]. Por consiguiente, no es de extrañar que uno de los factores aislados es, o bien un orthologue o cerca de TINY homólogo de Arabidopsis, un DREB factor que interviene en los procesos de desarrollo. Un mutante de Arabidopsis overexpressing TINY demostrado disminución de tamaño de la celda resultante en el "diminuto" tamaño de la planta en su conjunto [33]. Otro factor aislado en la pantalla, TaDREB3 TaDREB3, tiene algún nivel de identidad al frío inducida CBF factores, aunque su función es aún desconocida. Actualmente, ambos factores se están probando para su inducción en respuesta a estrés ambiental.

El pequeño número de clones obtenidos en la pantalla de la DRE se correlaciona con la extremadamente baja cantidad de mRNAs de codificación DREB2 este factor en el endospermo sincicial detectadas por Q-PCR (Fig. 6]. La abundancia de DREB3 en el cDNA está por debajo de la sensibilidad del método PCR-Q en todos los tejidos analizados y no se muestra aquí. DREB baja abundancia de secuencias en la biblioteca de cDNA dado lugar a un número menor de clones positivos y mayor número de falsos positivos azul, los principales tipos de los que se analizará a continuación.

Sorprendentemente, utilizando como cebo elemento DRE, también aislados varios clones independiente de la MYB factor de transcripción designado TaMYB1 TaMYB1. Uso de la Y1H ensayo y reportero de diferentes cepas se confirmó que TaMYB1 TaMYB1 interactúa con cualquiera de DRE o parte de la DRE. Varios MYB-al igual que las proteínas se encontraban aisladas de las plantas utilizando una pantalla Y1H [41 - 43]. Sin embargo, ninguno de los cis-elementos que se utilizaron como cebo tiene un alto nivel de identidad a la DRE.

TaMYB1 TaMYB1 pertenece a la R2R3 grupo de MYB factores, ya que contiene dos dominios de ADN vinculante en la región N-terminal de la proteína. R2R3 El grupo es el más grande de plantas con más de 100 estimado TFs en Arabidopsis [44]. Los miembros de este grupo se encontraron involucrados en la regulación del metabolismo secundario, la planta de la morfogénesis, la transducción de señales en el crecimiento de las plantas, estrés abiótico y defensa de patógenos [45]. Diferentes objetivo se identificaron los sitios de reconocimiento para los diferentes grupos de MYB proteínas, así como dentro del mismo grupo [45]. Las secuencias de la mayoría de los sitios de unión son MYB diferente de la de DRE. Sin embargo, MYB proteínas se sabe que tienen una considerable flexibilidad inherente en su capacidad para reconocer los sitios objetivo [46].

El tacto rectal está presente en muchos genes de la respuesta de estrés abiótico y es concebible que algunos miembros de la familia MYB de factores de transcripción regulan la coordinación de la respuesta de las plantas a la sequía mediante el mismo elemento. Un MYB factor AtMYB2 AtMYB2 se ha demostrado que se interviene en la regulación de la sequía y la ABA respuesta de estrés en Arabidopsis [47]. AtMYB2 AtMYB2 es inducida por la sequía y también las semillas durante la maduración in vitro e interactúa con el ADN que contiene los elementos de un consenso MYB reconocimiento Secuencia 5'-TAACTG-3 '. Aunque pertenece a la misma subfamilia de proteínas Myb como TaMYB TaMYB, no se trata de una estrecha homólogo de TaMYB TaMYB (23,8% de identidad de secuencia de aminoácidos). También es posible que TaMYB TaMYB estrés no es una proteína inducible, pero que participan en la regulación de los procesos de desarrollo en ausencia de estrés a través de la DRE o parte de la DRE de varios genes. Podría ser canjeados por más abundantes o más factores específicos DREB tan pronto como la planta está expuesta al estrés. Aunque todavía no hemos identificado las secuencias específicas de ADN que interactúa con TaMYB TaMYB, no creemos que es el núcleo secuencia de la DRE, pero probablemente la secuencia generada entre las fronteras de DRE repite.

El cis-E2F elemento de las proteínas es muy conservadas en todos los organismos. Se informó de que el elemento canónico cis-de los promotores humanos interactúa con factores E2F plantas in vitro [48]. E2F factors from Arabidopsis interact in vitro with the cis -element from a tobacco promoter [ 30 ]. The Y1H system has not been used previously for isolation of E2F cDNAs. However, it was used to demonstrate interaction of human E2F-1 with the WDV2 cis -element from the large intergenic region of the wheat dwarf virus (WDV) [ 49 ]. We could not isolate any E2F factors from wheat endosperm using the WDV element as bait (data not shown). A screen with the E2F cis -element from the promoter of the ribonucleotide reductase gene (RNR1b) from tobacco was more successful. The strong interaction of the human E2F5 protein with this element was demonstrated in vitro [ 26 ]. The fact that the first 94 quickly growing colonies selected in our screen with a triple repeat of the tobacco cis -element contained the full length sequence of the cDNA encoding the same TaE2Fe TaE2Fe factor reflects the very strong interaction of this factor with the bait. Unfortunately, it is not clear yet if other wheat E2F factors are unable to recognise this sequence or simply are not represented in the cDNA library or in the liquid endosperm fraction from which the library was prepared.

False positives

Traditionally, Y2H screens are known to give a large amount of false positives [ 50 , 51 ]. The method of preparation of cDNA libraries and screening strategy for Y2H proposed by Clontech™ has several important improvements in comparison with other strategies. These eliminate some groups of false positives and sometimes give unambiguous results, but there is still no complete solution to the problem. Surprisingly, the Y1H screens of the same expressional cDNA libraries using known cis -elements give fewer false positives. In the case of strong protein-DNA interactions or the relatively high abundance of the cDNAs in the library (for example TaE2Fe TaE2Fe and TaHD TaHD-ZipI TFs), most of the largest colonies were white in the α-galactosidase assay and encoded the expected type of transcription factors.

The blue colonies, which start to grow 3 to 4 days after appearance of quickly growing colonies, contain abundant cDNAs encoding some ribosomal proteins, histones, abundant housekeeping enzymes, etc . Some of these proteins appear to have the ability for non-specific interaction with a minimal promoter of all reporter genes; others (usually the latest colonies) are the result of the "leaky" growth on the -His medium because of non-optimal selection of the 3-AT concentration.

A further type of false positive specific for wheat grain cDNA libraries is a Zn-finger transcription factor which appears as the most abundant clone in the first portion of white colonies when specific protein-DNA interactions are weak or abundance of the cDNAs of interest is very low in the cDNA library (such as the screen of the cDNA library prepared from unstressed material with DRE cis -element).

This factor is a homologue of AtVOZ1 AtVOZ1 and AtVOZ AtVOZ 2 proteins from Arabidopsis , which specifically interact with a 38 bp region of the promoter of the vacuolar H + -pyrophosphatase (V-PPase) gene [ 52 ]. AtVOZ2 AtVOZ2 binds as a dimer to the specific palindromic sequence, GCGTNx7ACGC. At least a few colonies containing the clone of the same wheat AtVOZ AtVOZ-like protein were found in screens with several different reporter strains (data not shown). This result, and the finding that the expression of wheat AtVOZ AtVOZ-like protein does not support growth of the non-modified Y187 strain on selective media, led us to conclude that part of the vector sequence that introduced into the yeast genome together with the bait sequence is recognised by this factor. As soon as the size and restriction pattern of the insert which encodes AtVOZ AtVOZ-like protein is known, clones encoding this protein can be easily eliminated before plasmid purification and sequencing.

Conclusión

In this paper an efficient way to use MATCHMAKER cDNA libraries for the yeast one-hybrid screen is proposed and demonstrated by cloning full length cDNAs of seven wheat transcription factors from several different families. Good correlation was found between abundance of particular clones in the cDNA library and the abundance of respective mRNAs in the RNA isolated from the liquid endosperm. The advantages of the method and possible false positives are discussed.

Métodos
Generation of yeast reporter strains

Y1H reporter constructs were prepared by the cloning of tandems containing 3 to 4 repeats of the cis -elements for HDZipI-II, DREB/CBF, and E2F transcription factors into the pINT1-HIS3NB vector (see Table 1 for the DNA oligonucleotides used for cis -element preparation). The oligonucleotides with partially complementary sequences were annealed using Annealing Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) and the resulting overhangs were used for cloning into the SpeI SpeI- NotI NotI sites of the pINT1-HIS3NB vector. pINT1-HIS3NB vector (unpublished, kindly provided by Dr. PBF Ouwerkerk) was generated by cloning the NotI NotI - BamHI BamHI fragment of the pHIS3NB vector into the NotI NotI- BclI BclI unique sites of pINT1 [ 12 ]. Two unique restriction sites, NotI NotI and SpeI SpeI, can be used for single step directional cloning of DNA fragments of interest into the binary vector. Constructs with inserts were selected by PCR using primers derived from the vector primers pINTseq and pINTseqr (Table 1 ) and sequenced using the same primers. Before yeast transformation, a fragment lacking the pUC29 sequence was isolated after restriction with NcoI NcoI- SacI SacI. Integration of the construct into the PDC6 locus of yeast genomic DNA via double crossover was performed as described in [ 12 ]. Reporter strains, designated yHDZipI-II, yDRE, and yE2F, were incubated overnight in the rich YPDA media, mixed with glycerol to 25% final concentration, and stored as 1 ml aliquots at -80°C until use.

cDNA library construction

Bread wheat ( Triticum aestivum L. cv. Chinese Spring) plants were grown in glasshouses with day temperatures of 18–25°C and night temperatures of 18–21°C, with a 13 h photoperiod. Spikes were labelled at anthesis. Pooled samples of liquid endosperm were collected at 3 to 7 DAP by pipette aspiration from the embryo sacs of dissected micropylar tips of the grain. Total RNA was isolated from wheat samples using TRI REAGENT (Molecular Research Centre, Inc., Cincinnati, OH), and 2 μg total RNA was used for the preparation of MATCHMAKER Two-Hybrid System 3 (Clontech, Palo Alta, CA) cDNA libraries according to the supplied manual, with the following modification: CHROMA SPIN+TE-1000 columns were used for the cDNA size fractionation, instead of the suggested CHROMA SPIN+TE-400 columns. The cDNA library was washed out from 100 plates with 300 ml YPDA containing 25% glycerol and 25 μg/ml kanamycin, and incubated for 30 min at 30°C with rotation (220 rpm). 1.5 ml aliquots of the cDNA library were frozen on dry ice and stored at -80°C until use.

cDNA library screen

The conditions used for the one-hybrid screen are described in [ 12 ], with the following modification: instead of transformation of the reporter strain with plasmids prepared from an amplified cDNA library, we used overnight yeast mating with the AH109 strain, containing the library , prepared according to the protocol for the MATCHMAKER Two-Hybrid System Kit (Clontech™). 50 ml of overnight culture (alternatively, 1 ml of glycerol culture, thawed in a water bath at room temperature and diluted to 50 ml with YPDA) of each reporter strain were centrifuged for 5 min at 2000 rpm (Rotanta 460R table centrifuge, Hettich) . The pellet was resuspended in 50 ml of 2 × YPDA medium containing 25 μg/ml kanamycin, mixed with a 1.5 ml aliquot of pre-made cDNA library in the AH109 yeast strain and incubated in a 2 l conical flask at 30°C overnight with slow (30–50 rpm) rotation. After 17–24 h of mating, the yeast cells were harvested, washed with 1 × TE buffer, pH 8.0, containing 25 μg/ml kanamycin, resuspended in 5 ml of the same buffer and spread on plates with selective media (-Leu, -His) containing 5–10 mM 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) to reduce possible leaky expression of HIS3 gene. The optimal concentration of 3-AT was determined before the screen as described in [ 12 ]. Library plasmids were isolated from positive colonies and analysed as described [ 9 , 12 ], except that the use of the α-galactosidase reporter gene ( MEL1 ) allowed the selection of false positives (blue colonies) to be carried out directly on plates with the substrate X-α-GAL (25 μg/ml, Clontech™), as opposed to the filter assay required for strains with β-galactosidase gene as a reporter.

Further characterisation of positive clones

Standard techniques were used for the manipulation of yeast cells (Yeast Protocols Handbook, PT3024-1, Clontech™ and as described elsewhere). Clones were grouped based on the length of PCR fragments obtained with T7 and 3' AD sequencing primers (pGADT7 vector information, PT3249-5, Clontech™) and restriction analysis of fragments with the same length. Yeast DNA of selected representatives of subgroups was transformed by electroporation into the strain DH5α of E. coli , plasmids were amplified and purified, and inserts were sequenced using T7 and 3'AD primers (pGADT7-Rec vector information, PT3530-5, Clontech™). In some cases, protein-DNA interactions were confirmed by retransformation of the reporter and control strains.

Multiple alignments of related protein sequences and the resulting dendograms (Fig. 4 ) were calculated using AlignX (Vector NTI Suite; Invitrogen, VIC, Australia). The Clustal W algorithm was used, with a gap opening penalty of 10 and a gap extension penalty of 0.05.

Real Time PCR

Q-PCR was carried out according to [ 53 ] using the primer combinations shown in Table 2 . The raw expression of the genes of interest was normalised with respect to the expression of a combination of three control genes, Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPdH), Cyclophilin (CyP) and Elongation factor alpha (eF-1 alpha) after the manner of [ 54 ].

Availability of materials

The pINT1-HIS3NB vector will be made available for non-commercial purposes on written request to Dr PDF Ouwerkerk (E-mail: ouwerkerk@rulbim.leidenuniv.nl O pbfouwerkerk.2@umail.leidenuniv.nl ). Other materials needed for cDNA library preparation can be purchased from Clontech (Palo Alta, CA).

List of abbreviations used

AD – activation domain of GAL4

BD – binding domain of GAL4

CyP – Cyclophilin

DAP – days after pollination

eF-1 alpha – elongation factor alpha

GAPdH – glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

Q-PCR – quantitative (real-time) PCR

RT-PCR – reverse transcription – PCR

SD – selective media

TE – Tris-EDTA buffer, pH 7.5

UAS – upstream activator sequence

Y1H – yeast one-hybrid

Y2H – yeast two-hybrid

3-AT – 3-amino-1,2,4-triazole

Competing interests

The author(s) declare that they have no competing interests.

Contribuciones de los autores

SL prepared the cDNA libraries and bait strains, adapted the Y1H method to screen yeast expressional cDNA libraries, prepared the yHDZip strain, screened for HDZip proteins, coordinated the work, and prepared the manuscript. NB prepared yDRE and yE2F bait strains, screened for E2F factors and performed all technical work like media preparation, plasmid isolation, sequencing reactions, etc . SM isolated DREB/CBF and MYB factors using the Y1H screen during her Honours project. ASM prepared the RNA tissue series for Q-PCR experiments and contributed to the manuscript. NS generated all Q-PCR data and worked on the manuscript.

PL, the author of the project, coordinated the work and contributed to the manuscript. All authors have read and approved the final manuscript.

Agradecimientos

The authors are grateful to Dr. PDF Ouwerkerk, who kindly provided the pINT1-HIS3NB vector.