Particle and Fibre Toxicology, 2006; 3: 4-4 (más artículos en esta revista)

Expresión de citoquinas en ratones expuestos a partículas de los motores diesel por inhalación. Papel de factor de necrosis tumoral

BioMed Central
Anne T Saber (ats@ami.dk) [1], Nicklas R Jacobsen (nrj@ami.dk) [1], Jette Bornholdt (jbo@ami.dk) [1], Sanna L Kjær (slk@ami.dk ) [1], Marianne Dybdahl (mdy@ssi.dk) [1], Lotte Risom (lotte.risom @ farmakol.ku.dk) [2], Steffen Loft (s.loft @ pubhealth.ku.dk) [2 ], Ulla Vogel (ubv@ami.dk) [1], Håkan Wallin (hwa@ami.dk) [1]
[1] National Institute of Occupational Health, Lersø Parkallé 105, 2100 Copenhagen, Denmark
[2] Instituto de Salud Pública, Universidad de Copenhague, Øster Farimagsgade 5, opg. B, 2.sal; postbox 2099 1014 Copenhague K, Dinamarca

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Resumen
Antecedentes

Contaminación atmosférica por partículas se ha asociado con cáncer de pulmón y de enfermedades cardiovasculares, de la inflamación pulmonar, que puede ser un mecanismo de conducción. Las citoquinas pro-inflamatorias, factor de necrosis tumoral (TNF) ha sugerido a tener un rol fundamental en la inflamación inducida por partículas.

Se estudió el curso temporal de la expresión génica de los marcadores de inflamación en los pulmones de los ratones de tipo salvaje y Tnf-/ - ratones después de la exposición a partículas de los motores diesel (DEPs). Los ratones fueron expuestos a una o varias dosis de la DEP por inhalación. Se midió el nivel de ARNm de citoquinas Tnf y la interleucina-6 (IL-6) y las quimiocinas, monocitos chemoattractant proteína (Mcp-1), la proteína inflamatoria de macrófagos-2 (Mip-2) y de queratinocitos derivados de quimioquinas (Kc) en el Tejido pulmonar en diferentes puntos de tiempo después de la exposición.

Resultados

Tnf aumento de los niveles de mRNA expresión tardía DEP-después de la inhalación, mientras que los niveles de expresión de Il-6, Mcp-1 y el aumento de Kc temprana. La expresión de Mip-2 es independiente de TNF si la dosis está por encima de un cierto nivel. Los niveles de expresión de las citocinas Kc, Mcp-1 y Il-6, se incrementaron en ausencia de TNF.

Conclusión

Nuestros datos demuestran que Tnf no es importante a principios de la inflamación inducida por DEP, y no ejerce influencia negativa en Mcp-1 y los niveles de mRNA Kc. Esto sugiere que otras vías de señalización son importantes, un candidato que es uno de Mcp-1.

Antecedentes

Cuando depositado en el pulmón, las partículas ultrafinas, es decir, las partículas de un diámetro inferior a 100 nm, son probablemente más peligrosas que las partículas grandes. Las más pequeñas son las partículas, mayor es la superficie que tienen por unidad de masa: Esto implica que tienen una mayor actividad de los productos químicos, pueden llevar más PAH y otros productos químicos adsorbidos, y reaccionan con más fuerza con el tejido pulmonar, lo que ha provocado más de la inflamación Las partículas más grandes [1].

Varias citoquinas han sido propuestos para participar en la inflamación inducida por partículas. Focus ha sido dirigida principalmente a las citocinas factor de necrosis tumoral (TNF) y la proteína inflamatoria de macrófagos (MIP-2, también llamado CXCL2), que se han propuesto para desempeñar un papel importante en la inflamación inducida por partículas en el pulmón [2]. TNF en sí no tiene efecto quimiotaxis de los neutrófilos. Así, el efecto de la quimiotaxis TNF se piensa que es mediado a través de la inducción de la quimiotaxis citoquinas, las llamadas quimiocinas. Las quimiocinas, MIP-2 y de queratinocitos derivados de quimioquinas (KC, también llamado CXCL1) se cree que son responsables de la contratación de los neutrófilos en ratones y ejercen su efecto a través de su unión a los receptores de la misma CXCR2 [3]. MIP-2 y KC se consideran murino homólogos humanos de la interleucina-8 [4]. Además, la proteína de quimioquinas quimiotaxis de macrófagos 1 (MCP-1, también llamado CCL2) Recientemente se ha sugerido que participan en la inflamación inducida por DEP [5]. MCP-1 por los actos vinculantes a la MCP-1 receptor (también llamado CCR2), que promueve tanto la maduración de los monocitos a macrófagos, así como su quimiotaxis de contratación [6]. Por último, la expresión de la interleucina-6 (IL-6), ha sido informado de que el aumento de partículas en la inflamación inducida [7, 8].

Recientemente hemos informado de la inhalación de un estudio, que el TNF no era necesario para la inflamación inducida DEP-cuando evaluamos el efecto inflamatorio inhalación repetida después de cuatro exposiciones en Tnf - / - y Tnf + / + ratones [7]. El objetivo del presente estudio fue evaluar los efectos a corto plazo de la exposición DEP, es decir, los efectos que hasta dos días después de la exposición. Esto se hizo 1), mediante la evaluación de la importancia de Tnf y otros marcadores de inflamación después de la exposición y 2) mediante la investigación de la deficiencia de Tnf si induce un cambio en el curso temporal de la inflamación inducida por la DEP. Se evaluó la respuesta inflamatoria en el ARNm, porque la expresión de citoquinas parece ser regulada a nivel transcripcional en el ARNm y por la estabilidad. Además convenientemente mRNA puede ser cuantificada en los tejidos. Se ha demostrado que hasta DEP-regula varios genes implicados en la respuesta inflamatoria, tanto en el nivel de ARNm y proteínas en ratas [5].

Resultados
Los cambios en la expresión de citoquinas a través del tiempo

Para evaluar el tiempo curso de la inflamación inducida por partículas, que mide la expresión de citocinas cinco (Tnf, Il-6, Mip-2, y Kc Mcp-1) en el tejido pulmonar de BALBcJ (estudio 1) y C57xCBA ratones (estudio 2) expuesto a una dosis única de DEP por inhalación en diferentes puntos temporales. Estudio 1 consiste en experimentos con ratones que han informado previamente de [8], y para que los tejidos de los pulmones en este estudio fue reanalizamos para más citoquinas. 2 de estudios no se ha informado de antes. Los resultados del estudio BALBcJ y C57xCBA ratones estudio se resumen en el cuadro 1 y el cuadro 2, respectivamente.

Tnf La respuesta se produjo relativamente tarde. Sin cambios en los niveles de mRNA Tnf se observó 1 hora después de la exposición a 80 mg / m 3 SRM1650 en BALBcJ ratones en comparación con el nivel de mRNA en ratones expuestos al aire filtrado, mientras que el nivel fue de aproximadamente 3 veces elevados (p <0,01) 1 Días más tarde (Cuadro 1]. Un marginal respuesta también fue visto sólo 1 día después de la inhalación de 20 mg / m 3. Del mismo modo, en el experimento con el C57xCBA ratones expuestos a 80 mg / m 3 SRM2975 nivel de la expresión Tnf se incrementó 1 día después de la exposición (3 veces, p <0,01), mientras que el nivel de expresión Tnf fue el mismo que en El aire de ratones expuestos en el plazo de tiempo de 1-6 horas después de la exposición (Tabla 2].

El nivel de expresión de la citoquina pro-inflamatoria, Il-6 fue elevado durante todo el período, en tanto el BALBcJ y C57xCBA ratones después de la exposición a 80 mg / m 3 SRM1650 o SRM2975 (p <0,01, Tabla 1 y 2]. El más alto nivel de expresión fue visto poco después de la inhalación DEP (9-11 veces dentro de las seis horas, p <0,01) en comparación con el aire expuesto, en tanto que el nivel de expresión se incrementó en 4 veces (p <0,01) 1 día Después de la exposición a 80 mg / m 3. Poco después de la exposición de 20 mg / m 3 SRM1650 Il-6 se elevó temporalmente por 2,5 veces, que muestran una clara relación dosis-respuesta (Tabla 1].

Se midió la expresión de la quimiotaxis de neutrófilos, quimiocinas, Mip-2 y Kc BALBcJ en ratones expuestos a una dosis única de SRM1650 y C57xCBA ratones expuestos a una dosis única de SRM2975. Mip-2 se aumentaron los niveles de mRNA en los ratones expuestos BALBcJ A 80 mg / m 3, ambos 1 hora (p <0,05, 3 veces) y 1 día (p <0,01, 8 veces) después de la exposición, mientras que no ha habido cambios en los niveles de expresión se observó en los ratones expuestos a 20 mg / M 3 en cualquier punto del tiempo (Tabla 1]. En el C57xCBA ratones, la expresión nivel de Mip-2 se aumentó sólo 1 día después de la inhalación (5 veces, p <0.05) (Tabla 2]. El nivel de expresión Kc fue estadísticamente significativa en el aumento de la BALBcJ ratones expuestos a dosis de 20 mg / m 3 1 hora y 1 día después de la exposición, y no había un aumento 3 horas después de la exposición (Tabla 1]. En ambos BALBcJ y C57xCBA ratones expuestos a 80 mg / m 3, el nivel de expresión Kc fue estadísticamente significativa, tanto en el aumento de 1-6 horas y 1 día después de la exposición (Cuadro 1 y 2]. El nivel de la expresión de quimioquinas, Mcp-1 se aumentó aproximadamente 3 veces en la C57xCBA ratones 1 a 6 horas (p <0,01) y 1 día (p <0,05) después de la exposición (Tabla 2]. El nivel de expresión Mcp-1 se incrementó en el BALBcJ ratones expuestos a 80 mg / m 3, ambos 1 hora (7 veces) y 1 día (9 veces) después de la exposición (p <0,01 yp <0,05, respectivamente ), Mientras que ningún aumento en el nivel de expresión, se observó en todo momento el punto en ratones expuestos a 20 mg / m 3 (Tabla 1].

TNF deficiencia

En un segundo grupo de experimentos, se determinó el efecto específico del TNF. Esto se hizo mediante la comparación de la respuesta inflamatoria en Tnf + / + y-Tnf / - ratones, ya sea después de una dosis única de 20 mg / m 3 SRM2975 (estudio 3) o dosis múltiples de 20 mg / m 3 SRM2975 (estudio 4). Estudio 3 es un nuevo experimento con animales, que nos han informado de la experimentación con animales en estudio 4 antes de [7], sin embargo, para que el tejido pulmonar se reanalizamos de nuevas citocinas en este estudio.

Estudio de dosis única en ratones deficientes Tnf

Se estudió el tiempo de la inflamación de la medición de los niveles de la expresión de las citocinas Tnf, Il-6, Mip-2, y Kc Mcp-1 en los pulmones de la Tnf + / + y-Tnf / - ratones en 1 hora, 1 y 2 días después de terminada la exposición a una dosis única de 20 mg / m 3 SRM2975. Además, evaluamos el reclutamiento de células inflamatorias en el pulmón lumen. Elegimos para evaluar el curso de tiempo después de una dosis única de 20 mg / m 3 SRM2975 en Tnf + / + y-Tnf / - ratones en el fondo de nuestros resultados previos, que puso de manifiesto que Il-6 expresión fue significativamente mayor en el BALB / CJ Ratones expuestos a una dosis única de 20 mg / m 3 SRM1650 [8]. Los resultados del estudio de dosis única utilizando Tnf competente y ratones deficientes se resumen en el cuadro 3.

En el Tnf + / + ratones de la fracción de los neutrófilos en el BAL células se aumentó 1 (alrededor de 15 veces, p <0.01) y 2 días después de la exposición (alrededor de 30 veces, p <0.01) (Tabla 3]. En el DEP expuestos Tnf-/ - ratones hubo 2-3 veces más en comparación con los neutrófilos expuestos al aire. Esto no fue significativamente diferente, pero también existe ninguna diferencia entre stastistical sacude ratones de tipo salvaje y en cualquier momento. Se midió la expresión de las citocinas Tnf, Il-6, Mip-2, y Kc Mcp-1 en el tejido pulmonar. DEP exposición provocó un aumento de 2 veces en los niveles de mRNA Tnf en el Tnf + / + ratones 1 día después de la exposición en comparación con los ratones expuestos al aire, aunque no estadísticamente significativa. Como era de esperar, no expresión de Tnf se detectó en la Tnf-/ - ratones. DEP exposición causado ningún cambio significativo en los niveles de expresión de Il-6, Mcp-1 y Kc ni en la Tnf + / + ni el Tnf-/ - ratones, en cualquier momento y punto. Aunque la diferencia no fue estadísticamente significativa, los niveles de Mcp-1 fueron mayores en la Tnf-/ - Tnf que los ratones + / + al mismo tiempo puntos. El nivel de Mip-2 en la expresión DEP expuestos Tnf + / + ratones aumentó 1 día (p <0,05) después de la exposición en comparación con los ratones expuestos al aire. El Tnf-/ - ratones no respondió a la DEP, la exposición con un mayor Mip-2 de expresión.

Estudio de dosis repetidas en ratones deficientes Tnf

Se estudió la respuesta inflamatoria en Tnf deficiente y dominar a los ratones por dosis repetidas DEP medición de los niveles de la expresión Mip-2, y Kc Mcp-1 en el tejido pulmonar de ratones expuestos a cuatro episodios de la inhalación de 20 mg / m 3 SRM2975 ( Cuadro 4]. En tanto el Tnf + / + y el Tnf-/ - ratones, la exposición DEP aumento de la expresión de los niveles de Mip-2 alrededor de 3 veces (p <0,5, p <0,01). El nivel de expresión de Kc, fue significativamente superior en la Tnf - / - ratones (p <0,01), pero no hay aumento del nivel de expresión en el Tnf + / + ratones. El Mcp-1 se aumentaron los niveles de expresión de 5 veces en los ratones deficientes Tnf (p <0,01), y 1,5 veces en el Tnf + / + ratones aunque esta última no fue estadísticamente significativa. En nuestra reciente publicación [7], analizamos los niveles de expresión y Tnf Il-6 mRNAs en el tejido pulmonar y se determinó la fracción de los neutrófilos en el BAL células. Los resultados de este estudio y en el presente se resumen en el cuadro 4.

Discusión

Se ha sugerido que el TNF es un jugador clave en la inflamación inducida por partículas [2], y que el TNF es un mediador inflamatorio aguas arriba del MIP-2 y KC [9]. Sin embargo, en un estudio anterior, estamos expuestos Tnf + / + y ratones-Tnf / - ratones a DEP por inhalación, y demostraron que el TNF no es necesaria para la inflamación inducida DEP [7]. En el presente estudio se proporcionan nuevas pruebas de que el TNF no es importante a principios de la inflamación inducida por DEP. La exposición a dosis elevadas de aumento de la expresión DEP nivel de Mip-2, independientemente de la condición de Tnf, mientras que una mayor expresión Kc precedida Mip-2 sólo en la expresión-Tnf / - ratones, lo que sugiere que Kc pueden compensar la deficiencia de Tnf, o Que TNF ejerce comentarios negativos sobre KC señalización. El DEP de la expresión inducida por Mcp-1 y Il-6 ocurrido en ausencia de Tnf. Nuestros resultados indican que otras vías de señalización, tal vez la participación de MCP-1, son importantes para la pronta DEP inducida por inflamación neutrofílica.

Así, se evaluaron otros señalización patways con la expresión de citocinas otros cuatro, Il-6, Mip-2, y Kc Mcp-1, en la fase temprana y tardía de la DEP inducida proceso inflamatorio. Los resultados de la BALBcJ [8] y los estudios C57xCBA ratones, demuestran muy claramente que la Il-6 se expresa en los principios de la inflamación (1-6 horas después de la exposición), y que la expresión de Il-6 se ha reducido un día después de la exposición, aunque También es elevada después de repetidas exposiciones.

Las quimiocinas Mip-2 y Kc están fuertemente unidas a la llegada de los neutrófilos en el pulmón de roedores [4], mientras que MCP-1 es quimiotaxis de los monocitos. MIP-2 y MCP-1 han sido vinculados al proceso inflamatorio en respuesta a las partículas [2, 5]. Todas estas tres citoquinas se expresó más 1 hora después de la exposición a una dosis alta (80 mg / m 3) independientemente de ratón o el tipo de cepa DEP. Mip-2 aumento de los niveles más 1 día después de la exposición y esto incluye también la baja dosis de SRM2975, mientras que un nuevo aumento de Mcp-1 mRNA niveles sólo se produjo después de SRM1650 en BALBcJ ratones y no con SRM2975. Los niveles de mRNA de Kc fueron máximas en 1 hora después de la exposición a SRM1650 e incluso mostró una disminución 3 horas después de la exposición a 20 mg / m 3, aunque hubo un ligero aumento adicional 1 día después de la exposición a 80 mg / m 3 SRM2974. Sólo el Kc nivel aumentó significativamente 1 hora después de la dosis baja de 20 mg / m 3 SRM1650 en BALBcJ ratones. En consecuencia, Il-6, Mip-2, Mcp-1 y Kc son citocinas inducida en la fase temprana de la inflamación inducida por DEP, en tanto que Tnf se expresa en la tarde sobre un día después de la exposición. Mip-2 puede tener un papel más importante en La fase más tarde como a juzgar por el incremento en la expresión más 1 día después de la exposición. Los resultados pueden ser compatibles con DEP que se activa como receptor Toll 4 (TLR4) Tnf señalización porque la respuesta se produce a finales de este itinerario. De hecho, hay indicios de que la contaminación del aire partículas de estimular la vía TLR4 [10 - 12]. Bacteriana lipopolisacárido (LPS), la mejor estudiada TLR4 estimulador de la vía, se une a la TLR4 y activa el factor nuclear κ B (NF-κ B), la inflamación mediada por neutrófilos. El TLR4 señales en dos vías paralelas, tanto conduce a la activación de NF-κ B. El adaptador MyD88 dependen directamente vía activa NF-κ B, mientras que en una vía más tarde, depende de interferón β-adaptador molécula y probablemente el factor regulador de interferón-3, NF-κ B, la activación depende de la síntesis de novo, secreción, y por la señalización autocrina TNF largo de los receptores de TNF [13, 14]. Por otra parte, algunos estudios apoyan nuestros resultados TNF que no es de menor importancia o en el de partículas inducida por inflamación en los pulmones de los roedores. Por ejemplo, recientemente, un gran aumento de los niveles de expresión de las quimiocinas, Mcp-1 y Mip-2, pero no ha habido cambios en Tnf, se encontró en las células aisladas de BAL DEP (SRM2975) ratas expuestas [5]. Esto está de acuerdo con que BALF de ratas expuestas a cuarzo por instilación intratraqueal figura MIP-2 aumento de los niveles de proteína durante el período de tiempo medido a partir del 3 a 90 días después de la exposición, mientras que los niveles de proteína TNF se mantuvo bajo el límite de detección [15]. Sin embargo, al comparar nuestro estudio con los estudios antes mencionados, hay que hacer notar que el que describen los efectos a largo plazo de las partículas, es decir, los efectos en una ventana de tiempo de 1-30 y 3-90 días después de la exposición, respectivamente, mientras que este estudio Describe efectos a corto plazo de las partículas, es decir, 1 hora a 2 días después de la exposición.

Como hemos informado anteriormente, Il-6 se upregulated a repetirse tanto en la exposición DEP Tnf + / + y-Tnf / - ratones [7]. Esto podría ser compatible con un informe que muestra que SRM2975 aumento de IL-6 en BALF, mientras que no ha habido cambios en los niveles de proteína TNF se observaron [16]. Aunque no es estadísticamente significativa, la Il-6 expresión fue mayor nivel 1 hora después de la exposición en ambos Tnf + / + y ratones-Tnf / - ratones después de una sola dosis de exposición.

En el estudio de dosis repetidas de TNF, tanto el Tnf + / + y-Tnf / - ratones respondieron con un aumento de la respuesta Mip-2 en los pulmones. El Mip-2 fue similar en la inducción Tnf + / + y-Tnf / - ratones. Esto es sorprendente porque el MIP-2 se considera como un marcador inflamatorio abajo del TNF [9]. MIP-2 ha sido fuertemente ligada a la llegada de los neutrófilos [2]. En el estudio de dosis única TNF, el nivel de expresión de Mip-2 se incrementó en el Tnf + / + ratones 1 día después de la exposición y el importante límite 2 días después de la exposición. Mip-2 La expresión tiende a correlacionarse con la afluencia de neutrófilos, debido a la afluencia de neutrófilos fue estadísticamente significativa 1 día y 2 días después de la exposición. Del mismo modo, TNF receptor 1 ratones deficientes tenía un recuento de neutrófilos intacta después de la infiltración pulmonar, la exposición a sílice [17]. No Mip aumento de los niveles de ARNm-2 se observó en la dosis única expuestos Tnf - / - ratones en cualquier momento: Posiblemente, existe un umbral para la inducción de Mip-2 en el Tnf - / - ratones, debido a la exposición repetida en Tnf los ratones deficientes dio lugar a una respuesta Mip-2. En el experimento de dosis repetidas, la expresión de Kc sólo fue aumentado en la Tnf - / - ratones, que junto con los resultados de la BALBcJ y C57xCBA ratones sugiere que TNF ejerce un efecto inhibitorio sobre la expresión Kc.

MIP-2 y KC son a la vez quimiotaxis de neutrófilos y se han sugerido a ser redundante [18]. MIP-2 tiene una mayor afinidad por el receptor CXCR2 inducida por citoquinas que chemoattractant neutrófilos (CINC), la rata analógica a KC, y es un factor más potente quimiotaxis de neutrófilos [19]. El aumento de la expresión de Kc antes de Mip-2. Esto es coherente con un informe reciente que CINC (KC) aparentemente funciona como una señal de cebar a los neutrófilos, que después se sienten atraídos por el más potente pero chemoattractant local MIP-2 en el pulmón [20]. Nuestros resultados muestran que ambos Mip-2 y Kc se incrementan ante la falta de Tnf. Ambos Mcp-1 y los niveles de mRNA Kc fueron inducidos a menor medida por DEP en el Tnf + / + que en el Tnf-/ - ratones. Esto podría indicar TNF ejerce retroalimentación negativa sobre estas citocinas.

Recientemente, se informó de que la principal embrionarias de fibroblastos-Tnf / - ratones habían intacta LPS inducción de la Mcp-1 los niveles de expresión [13]. Knock a cabo con ratones derogado MCP-1 de señalización han perjudicado la infiltración de macrófagos y neutrófilos a algunos estímulos tóxicos para el pulmón [9 - 11]. Esto requiere una mayor investigación en la importancia de TLR4, MCP-1 y otros de señalización en la respuesta temprana de partículas inducida por inflamación.

En uno de nuestros experimentos hemos utilizado el material que se SRM1650 partículas recogidas de un pesado de motor diesel. Debido a que este no está disponible ninguna más, hemos utilizado en el resto SRM2975. SRM2975 es una preparación DEP recogido de un motor diésel industrial montacargas. El DEP materiales difieren en su composición química. Por ejemplo, SRM 1650 contienen una mayor cantidad de metales y HAP que SRM 2975 [21, 22]. Aunque no hemos comparado en esta profundidad, respuestas similares fueron obtenidos en las dos preparaciones diferentes DEP aunque el SRM1650 parecía dar una respuesta más enérgica en particular con respecto a MCP-1.

Estos experimentos se realizaron con diferentes cepas de ratón. Existen pequeñas diferencias en los patrones de expresión, que son atribuibles a la cepa o material DEP efectos. El panorama general es uniforme en todas las cepas de ratón, lo que indica que los efectos observados no son específicos de la cepa.

Conclusión

En resumen, hemos demostrado que el TNF no es importante a principios de la inflamación inducida por DEP. La exposición a la DEP por inhalación provocó un incremento en la expresión nivel de Mip-2, que es independiente de la condición de Tnf, si la dosis está por encima de un cierto nivel. Kc expresión parecía preceder a la Mip-2 Kc expresión y sólo se expresó en un nivel superior En el DEP-expuestas-Tnf / - ratones, lo que sugiere que KC pueden compensar la deficiencia de TNF, TNF o que ejerce un voto negativo sobre KC señalización. El DEP de la expresión inducida por Mcp-1 y Il-6 se incrementó en ausencia de Tnf. Nuestros resultados indican que el TNF señalización no es importante para la pronta DEP inducida por inflamación neutrofílica. La atención debe centrarse en otras vías, un posible candidato que es uno de MCP-1.

Métodos
Animales

- Tnf / - ratones (B6, 129S-Tnftm1Gk1) se obtuvieron a partir de JAX Ratones (EE.UU.). C57 BL/6J ratones fueron utilizados como Tnf + / + ratones. C57 BL/6J y se compraron BALBcJ ratones Taconic de Europa, Dinamarca. C57xCBA ratones que expresan luciferase bajo el control de NF κ B [23] se obtuvieron de Rune Blomhoff, Noruega (en lo sucesivo denominado C57xCBA ratones). Los ratones se les permitió aclimatarse por 2 semanas y se les dio alimentos (Altromin 1324) y agua ad libitum. El grupo de ratones fueron alojados en jaulas de polipropileno con aserrín de cama control de la temperatura en 21 ± 1 ° C y la humedad de 50 ± 10% con una luz de 12 h :12-h oscuro ciclo. Mujeres-Tnf / - y Tnf + / + ratones fueron estudiados en 9-11 semanas de edad. Tanto hombres como mujeres, se estudiaron ratones C57xCBA en 7-8 semanas de edad. Mujeres BALBcJ se estudiaron ratones a las 8 semanas de edad.

Partículas

DEP se Standard Material de referencia 2975 y 1650 del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) (Gaithersburg, MD, EE.UU.). SRM1650 son partículas de combustión de un motor diesel de servicio pesado. SRM2975 se DEP recogido de un motor diésel industrial montacargas. Una descripción detallada de las partículas puede ser visto en [22].

La exposición de ratones

El estudio consta de cuatro partes: 1) una sola exposición de los ratones BALBcJ a 20 o 80 mg / m 3 SRM1650, 2) una dosis única C57xCBA exposición de los ratones a 80 mg / m 3 SRM2975, 3) una dosis única de la exposición Tnf -- / - Ratones y Tnf + / + ratones a los 20 mg / m 3 SRM2975, y 4) cuatro exposiciones repetidas de Tnf - / - Tnf ratones y Tnf + + / + ratones a los 20 mg / m 3 SRM2975. En las cuatro partes, los ratones fueron expuestos a la inhalación durante 90 minutos, ya sea una sola vez (estudio 1, 2 y 3) o repetidas en cada uno de cuatro días consecutivos (estudio 4), en un recorrido de 18 l nariz-sólo la exposición de cámara.

1) El diseño de la dosis única BALBcJ exposición de los ratones se ha descrito en otra parte [8]. En resumen, los ratones fueron expuestos a cualquiera de 20 mg / m 3 o 80 mg / m 3 SRM1650 y se analizaron los criterios de valoración de 1 hora, 3 horas o 1 día (22 horas) después de la exposición.

2) C57xCBA ratones fueron expuestos a una dosis única de 80 mg / m 3 SRM2975. Puntos finales fueron analizados en diferentes puntos temporales.

3) En el tercer estudio, los ratones fueron expuestos a un solo tiempo de 20 mg / m 3 SRM 2975 en similares condiciones que la exposición repetida. Puntos finales fueron analizados 1 hora, 1 y 2 días después del final de la última exposición. Estudio 2 y nuestros estudios anteriores muestran que los niveles de expresión de citoquinas inflamatorias, no se han modificado con el tiempo en el aire-ratones expuestos [8]. Sobre ese telón de fondo, y por consideraciones éticas, elegimos sólo para evaluar el aire de ratones expuestos a un solo punto de tiempo.

4) El diseño de la exposición repetida ha sido descrito en detalle en otra parte [7]. En resumen, estamos expuestos-Tnf / - ratones y Tnf + / + ratones por inhalación de 20 mg / m 3 DEP o aire filtrado durante 90 minutos en cada uno de los cuatro días consecutivos. Una hora después de la última inhalación de los ratones murieron y fueron broche de órganos congelados en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. Puntos finales fueron analizados.

Las partículas aerosolizadas son por un microfeeder con boquilla de dispersión (Fraunhofer Institut für Toxikologie y Aerosolforschung, Hannover, Alemania). El número de partículas fue medida por un contador de partículas de condensación (ETI modelo 3022A). El número de partículas en el estudio de dosis única TNF y C57xCBA estudio fueron alrededor de 9,1 10 5 / cm 3 y 3,0 10 6 / cm 3, respectivamente. En el número de partículas de las dosis múltiples de TNF BALBcJ estudio y el estudio se describen en otra parte [7, 8]. La concentración de partículas se midió cuatro veces durante la exposición por el pesaje de los filtros. Las concentraciones de partículas en el estudio de dosis única TNF y C57xCBA estudio fueron, aproximadamente, 20 mg / m 3 y 80 mg / m 3, respectivamente.

Después de la exposición, los tejidos y las células del BAL ratones para todos los estudios fueron preparados como se describe anteriormente [7, 8].

Preparación de RNA y cDNA de tejido pulmonar

RNA de la dosis múltiples experimento fue preparado mediante kit NucleoSpin RNA 96 (Macherey-Nagel), tal como se describe anteriormente [7]. RNA de una dosis única de los tres experimentos se prepararon utilizando ARN de sangre QIAamp ® Mini Kit (Qiagen, EE.UU.), como se describe por el fabricante. CDNA fue preparado a partir de la ADNasa tratados ARN usando reactivos TaqMan transcripción reversa (Applied Biosystems, EE.UU.), como se describe por el fabricante.

Tiempo real RT-PCR

El Tnf, Mip-2, Kc, Il-6 y Mcp-1 se determinó la expresión de genes en tiempo real mediante RT-PCR con el RNA 18S como la referencia de genes. Cada una de las muestras se realizó por triplicado en el ABI PRISM 7700 detector de secuencia (PE Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Por TNF, IL6 y MCP-1, TaqMan antes de la reacción de los kits desarrollados (Applied Biosystems, EE.UU.) se utilizaron. Lamentablemente, el TaqMan antes de la reacción kit desarrollado para la determinación de TNF, utilizado anteriormente [7], no es comercialmente disponibles en el almacén. Por lo tanto hemos tenido que cambiar a otra carpeta de TNF: n º 4331182 (Applied Biosystems, EE.UU.). Esto significa que no es posible comparar los resultados de TNF en esta publicación con los resultados publicados en nuestra publicación anterior [7]. Los niveles de expresión de Tnf son aproximadamente 5 veces más altos que cuando se utiliza el nuevo kit. Para el MIP-2 y KC, primers y sondas fueron diseñadas como se describe anteriormente [24]. Sin embargo, el primer KC sentido se modificó en dos posiciones de nucleótidos a: 5'-gtg tct agt tgg etiqueta en ggc ata-3 ', ya que el ensayo no funcionó con el primer publicado [24]. Esto se debe probablemente a las variaciones entre. En todos los ensayos TaqMan pre-desarrollados mezcla (Applied Biosystems) se utilizó. Para el KC-MgCl 2 ensayo de la concentración se ajustó a 3,0 mM. Objetivo y 18S del RNA se cuantificaron los niveles en tubos separados. El objetivo de los genes se normalizaron (Δ C t) a 18S del RNA restando el ciclo valor umbral de ARN 18S (C treference) de la Ct valor de los genes de interés (ttarget C), es decir, Δ C t = C ttarget - C treference. La relativa de la expresión de genes objetivo fue calculado por el método comparativo 2 - Δ Ct [25]. El promedio de la desviación estándar se triplica en el 15%. La desviación típica de mediciones repetidas de la misma muestra (el control) en distintos experimentos fue de 20%, lo que indica que el día a día en la variación del ensayo fue de 20%. La primers y sondas han sido validados y de la PCR demostró ser cuantitativos en un radio de 32 ó 64 veces gama. ARN mensajero mediciones fueron excluidos si el contenido 18S cayó fuera de la gama en la que se encontró la PCR cuantitativa a ser definido por la validación de los experimentos. Controles negativos, cuando no se convierte ARN a ADNc, se incluyeron en cada plazo.

Análisis estadístico

Los datos del estudio 1, 3 y 4 fueron analizadas por dos vías análisis de la varianza. Los datos del estudio fueron analizados por 2 en un solo sentido el análisis de la varianza. Para cumplir con los criterios de normalidad y homogeneidad de varianza algunos de los marcadores fueron transformados logarítmicamente una o dos veces. Para algunos marcadores, los datos fueron clasificados con técnicas antes de una prueba, porque no es posible transformar los datos de una forma que satisface los criterios de normalidad y homogeneidad de varianza. Para determinar la significación estadística de biomarcadores, pares de interés se compararon con Tukey's Studentized serie de pruebas con el control de tipo 1 error experimental. En el estudio 3, un ratón se excluyó como de las demás porque los datos de este ratón son más de 2 desviaciones estándar del resto de los datos para todos los puntos finales a excepción de uno. En el estudio 2, el aire se agruparon los ratones expuestos. El análisis estadístico se realizó con el programa estadístico SAS 8,2.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

ATS llevado a cabo en tiempo real el análisis RT, realizó el análisis estadístico y redactó el manuscrito. NRJ, JBO, SLK, LR y MD llevó a cabo la exposición de los ratones. ATS, SL, UBV y HWA concibe el estudio y participaron en su diseño y coordinación. HWA, SL UBV y ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación Médica de Dinamarca (sin 2052-03-0016), la Airpolife centro de excelencia otorgada por el organismo danés de investigación y una beca para Anne Thoustrup Saber por la Academia Danesa de Investigación. La asistencia técnica de Birgitte Korsholm Se agradece. Los experimentos fueron aprobados por el danés "Animal Experimental Inspección", y llevó a cabo después de sus directrices para la conducta ética y cuidado al utilizar animales en la investigación.