Genetic Vaccines and Therapy, 2006; 4: 1-1 (más artículos en esta revista)

Distribución de tejidos de un plásmido de ADN de genes de codificación Hsp65 depende de la dosis administrada por vía intramuscular a través de la entrega

BioMed Central
AAM Coelho-Castelo (arlete@fmrp.usp.br) [1], AP Trombón (apfavaro@rpm.fmrp.usp.br) [1], RS Rosada (rogerio@hotmail.com) [1], RR Santos ( Jrsr@cpt.fmrp.usp.br) [1], Bonato VLD (vlbonato@fmrp.usp.br) [1], A Sartori (sartori@ibb.unesp.br) [3], CL Silva (Clsiva @ fmrp . Usp.br) [1]
[1] Departamento de Bioquímica e Imunologia, Facultad de Medicina Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
[2] REDE-TB: Rede Brasileira de combate à tuberculose, USP, Riberiao Preto, São Paulo, Brasil
[3] Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, São Paulo, Brasil

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Resumen

Con el fin de evaluar una nueva estrategia de la vacuna de ADN para tener un conocimiento más completo de su acción en la respuesta inmune, es importante para determinar el destino in vivo biodistribución y antígeno de expresión. En estudios anteriores, nuestro grupo se centró en el uso profiláctico y terapéutico de un plásmido de ADN que codifica el Mycobacterium leprae 65-kDa de proteínas de choque térmico (Hsp65), y logró una eficiente respuesta inmune de inducción, así como la protección contra la virulenta M. Tuberculosis desafío. En el presente estudio se analizaron la distribución de tejidos in vivo de ADN desnudo-Hsp65 vacuna, la Hsp65 mensaje, la integración y la metilación del genoma situación de ADN plásmido. El ADN-Hsp65 fue detectable en varios tipos de tejidos, lo que indica que el ADN-Hsp65 difunde ampliamente en todo el cuerpo. La biodistribución es dependiente de la dosis. En cambio, la RT-PCR detectó la Hsp65 mensaje durante al menos 15 días en el músculo y el tejido hepático de los ratones inmunizados. Se analizaron también el estado de metilación y la integración de la inyecta el plásmido de ADN en el genoma celular de acogida. El patrón de metilación bacteriana persiste durante al menos 6 meses, lo que indica que el plásmido de ADN Hsp65 no reproduce en los tejidos de mamíferos, y el análisis Southern blot plásmido de ADN demostró que no fue integrado. Estos resultados tienen importantes implicaciones para el uso de la vacuna de ADN Hsp65 en un entorno clínico y abre nuevas perspectivas para las vacunas de ADN y las nuevas consideraciones sobre el sitio de la inoculación y sistemas de distribución.

Introducción

Se ha descubierto que el ADN plásmido codifica una proteína del antígeno podría servir como un eficaz inmunógeno. Desde entonces, las vacunas basadas en ADN han recibido atención por su potencial como tratamientos alternativos para diversas enfermedades [1]. Por vaccinologists, las principales ventajas de este método son los efectos adyuvantes proporcionados por motivos unmethylated CpG en el plásmido columna vertebral y por la activación de células T CD8. Sin embargo, a pesar de la eficacia de las vacunas de ADN desnudo, diferentes resultados en relación con la biodistribución, el tipo de células que participan en el proceso de captación, así como la integración del genoma in vivo y el momento de la expresión del antígeno ha sido demostrada para cada uno de ADN y el método de construcción (2-8). El análisis de estos factores podría avanzar en la comprensión de esta estrategia de vacunación y llevar a mejoras metodológicas, como el uso de cantidades menores de plásmido sin alterar la respuesta inmunitaria.

Nuestro grupo se ha centrado en la administración intramuscular de ADN plásmido desnudo codificación de la Mycobacterium leprae 65-kDa de proteínas de choque térmico (HSP65), y ha demostrado que esta forma de administración plásmido resultados en la inducción de una buena inmune, así como proporciona protección contra la virulenta M. Tuberculosis problema [9]. La protección se atribuyó a la inducción de una respuesta inmune celular dominado por el antígeno específico de los linfocitos T, que no sólo produce el interferón-γ, pero también son citotóxicas para las células infectadas [10]. Además, en gran medida ratones infectados, la vacunación con Hsp65-codificación del ADN dio lugar a un pronunciado efecto terapéutico relativamente ineficientes alterar la respuesta inmune que produce estasis bacteriana, en una respuesta eficaz que fue capaz de matar las bacterias [9]. Esta vacuna también mostró buenos resultados en los estudios que emplean el principal impulso de la estrategia en contra de ambos experimental [11] y la tuberculosis bovina [12].

Como se mencionó anteriormente, el plásmido biodistribución genoma y la integración, así como su persistencia en vivo y la expresión de antígenos, ha sido poco explorada en estos modelos de vacunación de ADN. Sin embargo, estos aspectos son muy importantes para el diseño de nuevas estrategias de entrega y seguridad de la biotecnología.

La integración en el genoma de la célula huésped podría producir mutagénesis de inserción, que tienen el potencial de la activación o inactivación de los genes. Además, los plásmidos utilizados en la vacuna de ADN han Hsp65, en su secuencia de nucleótidos, el SV40 origen de la replicación del virus, lo que podría permitir la replicación in vivo del plásmido. Estos fenómenos pueden ser verificados por distinguir entre procariótico presentes en los patrones de metilación del ADN plásmido y el genoma eucariótico de la acogida, que puede ser considerado otra medida de seguridad.

Algunos aspectos de la biodistribución han sido analizados con otros sistemas de entrega y las dosis, como los modelos de vectores de ADN desnudo o encapsulado en un vehículo de reparto, [13 - 17]. Los resultados han mostrado que un amplio biodistribución del vector ocurre en todos los sistemas. Sin embargo, el tiempo analizado después de la vacunación fue variable y es difícil comparar los resultados.

En el presente estudio, se observó la distribución de tejidos de ADN plásmido desnudo-Hsp65 vacuna y expresión del ARN por 6 meses después de la administración intramuscular en ratones. Además, se investigó si las repeticiones de ADN plásmido o se integra en el genoma de mamíferos cuando residen en los tejidos a largo plazo.

Materiales y métodos
Plásmido de ADN construcción y depuración

La construcción de un plásmido pcDNA3 que contiene el citomegalovirus (CMV) y un promotor del cDNA de codificación de genes para la HSP65 M. Leprae (pcDNA3-HSP65) se ha descrito previamente [9]. Plásmido de ADN fue purificado como se describe en el manual de depuración de EndoFree plásmido (Qiagen, Ltd, Crawley, Reino Unido). Espectrofotométrico análisis reveló la 260/280 nm ratios de ser ≥ 1,80. La pureza de las preparaciones de ADN fue confirmada en un gel de agarosa al 1%.

Inmunización

Ratones BALB / c (tres animales por cada punto del tiempo) evaluadas en el estudio fueron 6-8 semanas de edad y se han obtenido de los Servicios Animal de la Universidad de Sao Paulo, Facultad de Medicina de Ribeirão Preto. Los ratones fueron mantenidos bajo condiciones de laboratorio estándar. El ADN plásmido desnudo dosis utilizadas fueron 4, 20 y 100 μ g / ratón (w / v) en PBS el 25% de sacarosa (100 μ l de volumen total) y se administra por inyección intramuscular en el músculo cuádriceps derecho en dos sitios separados en el mismo Muscular. Como control negativo ratones fueron inmunizados con el control de vectores en PBS-sacarosa (tres ratones por grupo).

Aislamiento de ADN y ARN

A varios tiempos después de la administración de desnudos pcDNA3-Hsp65 o pcDNA3 vector de ADN (datos no presentados), las muestras de varios tipos de tejidos, incluidos los músculos, drenan los ganglios linfáticos, bazo, pulmón, hígado, riñón y timo, así como una sola Suspensión de células de la médula ósea, se obtuvieron. Las muestras fueron tratados con reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) y el total de ARN y ADN fueron aisladas de acuerdo con el fabricante protocolos. Posteriormente, el ARN se extrajo con cloroformo y se precipitó con alcohol isopropílico. El ADN fue aislado por etanol precipitación de la interfase y la fase de fenol. El ADN fue precipitado se lava con citrato de sodio 0,1 M seguida de 75% de etanol. El ARN total extraído ADN y se disuelve en el agua libre de nucleasa (Invitrogen). Total de ADN de E. Coli fue aislado por el mismo protocolo.

RT-PCR

Total de ARN celular (10 μ g / ml) fue transcrito invertir utilizando oligo (dT) los cebos y la transcriptasa inversa (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La contaminación de ADN plásmido fue removido por el tratamiento con DNAse I, de amplificación de la categoría (Invitrogen). El cDNA (2 μ g) se amplificó durante 35 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 45 segundos y 72 ° C durante 1,5 minutos, utilizando el primer pares 5'-GAT AAC CAC GGC GTG TCC AT-3 ' Y 5'-AAG GCA TAG CAG TCG AGG-3 ', lo que resulta en un 400-bp cDNA Hsp65 codificación, o el primer pares 5'-CGC TCT GTG GGC AGG CAC CAA-3'and 5'-CTC TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC-3 ', lo que resulta en un manual de 450 bp cDNA encoding β-actina. Con el fin de evitar la contaminación cruzada, todos los procedimientos, incluida la PCR, se realizaron por separado en campanas de flujo laminar.

Plásmido procedimiento de rescate

Total ADN fue extraído a partir de todos los tejidos utilizando Trizol reactivo de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Del total de ADN aislado, 1 μ g competentes se transformó en E. Coli DH 5 α que se describió anteriormente [3, 5, 19] y chapada en Luria-Bertani placas de agar utilizando una selección de la ampicilina plásmidos (100 μ g / ml). Plásmidos rescatados fueron analizados por restricción de la cartografía (datos no presentados), insertar en libertad y por PCR usando primers (5'-GCC ATG AAC ACA ATT GCG TAC-3 'y 5'-TTG TCC AGC AGG TCG TCG TAC TCA C-3' ) Que amplifica a 1500-bp fragmento, en las mismas condiciones que para la reacción de PCR se describe antes. La secuenciación de nucleótidos de los rescatados plásmido se llevó a cabo con un kit de secuenciación del ADN (Big Dye Terminator Cycle Kit de secuenciador; Perkin-Elmer, Norwalk, CT, EE.UU.) y un ABI PRISM 3100 Genetic analizador (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) De acuerdo a instrucciones del fabricante. Los cebos utilizados fueron T7 o BGH. Secuencia homologías se obtuvieron mediante la utilización de base local Alineación Página de búsqueda (Centro Nacional de Información sobre Biotecnología, Bethesda, MD, EE.UU.). Transformación de E. Coli con 1 μ g de tipo salvaje pcDNA3-hsp65 fue utilizado como control positivo de la transformación.

Estado de metilación del ADN plásmido

Del total de celulares el ADN obtenido de músculo, 1 μ g fue digerida durante 4 horas con 10 unidades de Nde Iy la presa patrón de metilación se analizó [18] o con Mbo I Dpn I (Invitrogen) durante la noche a 37 ° C. Diez μ l de la mezcla de reacción se utilizaron para realizar un PCR de 35 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 45 segundos y 72 ° C durante 1,5 minutos, utilizando T7 y BGH primer pares (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 'y 5'-AAG GCA TAG CAG TCG AGG-3'). Amplificación de ADN fue analizado por tinción con bromuro de etidio 1% después de la electroforesis en gel de agarosa. El patrón de metilación de E. Coli se utilizó como control positivo.

Southern blot

Después de un mes de la inoculación con desnudos plásmido pcDNA3-Hsp65, se aisló el ADN genómico de los hígados de los ratones inmunizados, así como de los de los ratones no inmunizados, utilizando reactivo Trizol (Invitrogen). Las muestras fueron digeridas con Nde I la noche a la mañana o se quedaron sin digerir. De cada una, 10 μ g de ADN celular total fueron sometidas a electroforesis en un gel de agarosa 0,8%. El análisis Southern blot se llevó a cabo utilizando imágenes de Gene ™ (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), y bandas de hibridación se revelaron utilizando desnuda pcDNA3 vector (1 μ g / ml), marcadas con el azar primer módulo de etiquetado (Amersham).

Resultados
Biodistribución de plásmido pcDNA3-Hsp65 y detección de mensaje de Hsp65

Para identificar el ADN plásmido-Hsp65 y de expresión de la codificación de las proteínas en sitios remotos después de la inyección intramuscular, hemos utilizado RT-PCR y transformación bacteriana enfoques. Los animales recibieron inyecciones intramusculares de desnudos pcDNA3-Hsp65 o el control de vectores (pcDNA3), y luego fueron sacrificados a varios tiempos. Múltiples muestras de tejidos fueron recolectados para la detección de ADN plásmido y Hsp65 mensaje. El día 2 después de la inoculación, la RT-PCR de tejidos análisis demostró la presencia de Hsp65 transcripciones en casi todas las muestras de tejidos examinados, con la excepción de los riñones y pulmones (Fig. 1, Tabla 1]. El día 7, la Hsp65 mensaje ha sido todavía presente en el hígado, el músculo, la médula ósea, los ganglios linfáticos de drenaje y bazo. Sin embargo, a día 15, la Hsp65 mensaje sólo puede ser detectado en los músculos y el tejido hepático (Fig. 1, Tabla 1]. La Hsp65 transcripciones no se hayan detectado en los tejidos de animales inmunizados con el vector de ADN plásmido (datos no presentados). Sin embargo, el plásmido de ADN hsp65 fue generalizado cuando la inyección se hizo con la dosis más alta, pero no con la dosis más bajas (Tabla 2]. Además, fue posible rescatar el plásmido ADN de los ratones inyectados con la dosis más alta plásmido en todos los tejidos analizados hasta 6 meses (cuadro 1]. Curiosamente, el número de rescates plásmido aumento de más de 30 días después de la inmunización en casi todos los tejidos (Cuadro 2].

Identificación de los rescatados plásmido

Con el fin de aclarar que la rescataron los plásmidos, las bacterias después de la transformación, se pcDNA3-Hsp65, los plásmidos digeridos de diferentes tejidos (músculo, la médula ósea, el hígado y el bazo), o de tipo salvaje plásmido (como control positivo) mediante enzimas de restricción que Insertar la liberación. El patrón de digestión indicó que las colonias resistentes a ampicilina obtenidos a partir de estos tejidos, figura el plásmido pcDNA3-Hsp65 (Figura 2A]. La identidad de pcDNA3-HSP65 fue también confirmado por PCR, utilizando Hsp65 primers específicos y análisis de secuencias de ADN plásmido (Figura 2B y 2C]. Estos resultados confirmaron que los plásmidos rescatados en nuestro análisis se pcDNA3-Hsp65 que demuestren la especificidad de la metodología.

Estado de metilación del ADN plásmido en el músculo

Con el fin de determinar si pcDNA3-Hsp65 reproducirse en el tejido en el largo plazo, el músculo preparativos de ADN fueron digeridos con Nde Iy luego con Dpn I (Fig. 3A, carril a) o Mbo I (Fig. 3A, carril b) antes Para análisis de PCR. Todas las muestras de ADN fueron digeridos con Nde I porque mediante amplificación por PCR con plásmido lineal dado más de productos que el plásmido de ADN circular que fue sin digerir (datos no presentados). Las muestras de ADN obtenidas de músculo seis meses después de la inoculación fueron sometidos a ese procedimiento. Amplificación de los fragmentos en los que sólo aparecían muestras digeridas con Nde yo solo (Fig. 3A, carril c) o con Mbo I solo (Fig. 3A, carril b). No fragmentos amplificados fueron digeridos evidente en muestras con Dpn I antes de la PCR (Fig. 3A, carril a). Se obtuvieron resultados similares utilizando ADN celular total de las muestras de hígado y bazo (datos no presentados). El control positivo de metilación presa en Escherichia coli se indica en la Figura 3B.

Genómica integración

Para excluir la posibilidad de que pcDNA3-Hsp65 se integró en el genoma de la célula huésped, se realizó un análisis de Southern blot en muestras de tejido del hígado de los ratones inmunizados y no inmunizados. El pcDNA3-Hsp65 de muestras de tejido del hígado fue digerida con Nde I lineal para convertirse en un plásmido, que se evidencia por una sola banda de 9000-kb (Fig 4, carril e). El plásmido sin digerir (Fig. 4, carril f) presentan la característica de multímeros bandas correspondientes a las formas de nonintegrated plásmido de ADN. Este mismo patrón se observó banda en el ADN genómico de ratones inmunizados (Fig. 4, carriles de a y b), que muestran que pcDNA3-Hsp65 no fue integrado. El tejido hepático de los animales no inmunizados no presentaron bandas (Fig. 4, carriles c, d).

Discusión

Se ha propuesto que a largo plazo la expresión de un gen extranjero es uno de los principales indicadores de éxito de la terapia génica. Desde el punto de vista de las vacunas, sin embargo, a corto plazo puede impedir la expresión de tolerancia sistémica inducida por la exposición reiterada a antígeno [20]. Hay una variedad de factores que pueden potencialmente afectar a la expresión de genes plásmido, incluidos los antígenos específicos de la respuesta inmune y de citoquinas reguladas función promotora [revisados [21]]. Usando sólo una dosis de 100 μ g de pcDNA3-Hsp65 entrega por vía intramuscular, se observó la presencia de Hsp65 mensaje en varias muestras de tejidos hasta 7 días después de la inyección, incluidos los órganos linfoides secundarios. Después de este período, la Hsp65 mensaje se detectó sólo en el músculo y el hígado (Figura 1]. Desde nuestro ensayo no es cuantitativa, no determinar la cantidad de Hsp65 mensaje en cada tejido, pero su presencia en cada uno de los materiales por un tiempo limitado se demostró. Sin embargo creemos que el éxito de nuestra vacuna experimental contra la tuberculosis puede deberse a otro plásmido de dos dosis a los 15 días. Este calendario de la inmunización podría preservar la Hsp65 mensaje a los órganos linfoides resulta en la inducción de concreto y eficiente respuesta inmune [9].

A pesar de que la Hsp65 mensaje no se detectó después de quince días, el plásmido de ADN todavía se pueden encontrar en todos los tejidos analizados incluyendo pulmón, DLN, bazo, hígado, médula ósea, riñón, músculo y timo por lo menos seis meses posteriores a la inoculación. Estos resultados indican que el plásmido de ADN Hsp65 difundido ampliamente por todo el cuerpo y persiste como una forma de ADN plásmido o producido dosis más bajas de mensaje no detectables en nuestro ensayo de RT-PCR (Cuadro 1 y 2]. Después de dos días de la inmunización, alrededor de 100 colonias resistentes a ampicilina / μ g de ADN genómico se puede obtener de diferentes tejidos. Sin embargo, el número de resistentes a la ampicilina colonias disminuyó en más adelante los puntos, lo que sugiere que los niveles de ADN plásmido también se redujo (cuadro 2]. A los seis meses, una menor frecuencia de recuperarse de ADN plásmido se observó en el riñón, pulmón y timo (Tabla 2]. La presencia de ADN plásmido en el timo puede ser una preocupación, ya que la expresión de este antígeno en el tejido puede inducir tolerancia por supresión de Hsp65 específicos de las células T alterar la inducción de la respuesta inmunitaria después de Hsp65 intramuscular calendario de vacunación. Sin embargo, el mensaje ha sido detectado sólo dos días después de la inmunización en casi todos los tejidos analizados y el número de plásmidos rescatados disminuido después de seis meses, lo que sugiere que los plásmidos podrían haber sido dañados o digestión por endonucleasas. Curiosamente, la presencia de ADN plásmido se observó en diferentes tejidos de los puntos más largo tiempo, incluso en presencia del menor número de colonias. Estos resultados son importantes porque muestran que, incluso después de biodistribución generalizada de plásmido, la detección se redujo después de 6 meses. Además, hay importantes datos proporcionados por nuestro laboratorio demuestran que la presencia de ADN desnudo en diferentes órganos no cambia el patrón histológico, lo que sugiere la ausencia de respuesta inflamatoria en los tejidos (manuscrito en preparación, Deison Soares comunicación personal).

Para asegurar que el plásmido rescatados de diferentes tejidos se pcDNA3-Hsp65, analizamos varios plásmidos por tres métodos diferentes: patrón de restricción (datos no presentados) e insertar en libertad, la PCR y la secuencia de nucleótidos. El gráfico 2 muestra cómo los resultados de las mismas muestras obtenidas de diferentes tejidos. Estos experimentos se realizaron para determinar la identidad del plásmido de ADN y evitar falsos resultados positivos. Los resultados confirmaron que la rescató fue el plásmido pcDNA3-Hsp65.

La distribución generalizada de plásmido de ADN en todo el cuerpo, con independencia de la forma y la vía de administración, se ha informado anteriormente [4, 6, 8, 15, 16, 22]. Actualmente, el mecanismo que participan en este amplio biodistribución de ADN plásmido no está completamente definido. Se ha especulado que esto puede ocurrir como consecuencia del transporte de libre plásmido de ADN, así como su transporte por las células transfectadas [22]. Sin embargo, la generalizada biodistribución no puede limitarse a un determinado mecanismo o tipo de células, ya que después de la inmunización con ADN desnudo puede ser abordada por diferentes células como CD11b + (2), CD11c (23,24), CD11c y CD19 (3), Llegar a sitios distantes. Sin embargo, no podemos excluir el transporte de ADN plásmido por suero o linfáticos.

En base a nuestros resultados nos indican que la biodistribución generalizada también puede ser correlacionado con el plásmido se inyecta la dosis. Para evaluar esta posibilidad, algunos ratones fueron inmunizados con dosis más bajas de ADN plásmido-Hsp65 (4 y 20 μ g / ratón). Los resultados presentados en la Tabla 2 mostraron que en ratones que recibieron la dosis de 20 μ g, el plásmido se mantuvo en algunos tejidos como el músculo, los ganglios linfáticos y la médula ósea y sólo se recuperó después de 48 h después de la inoculación, mientras que en los ratones que recibieron la dosis más baja de 4 μ g, el plásmido de ADN no fue recuperado de cualquiera de los tejidos analizados (datos no presentados).

La limitada biodistribución en ratones que recibieron dosis más bajas no se puede atribuir a la sensibilidad del método utilizado, ya que mediante el uso de ADN plásmido etiquetados con tinte fluorescente (10-12 μ g / ratón), que presentan un patrón similar de biodistribución [3]. En consecuencia, sugerimos que la biodistribución generalizada es también dosis correlacionadas. Estos resultados son importantes para el desarrollo de nuevos vectores, lo que permite el uso de dosis más bajas y, por tanto, la reducción de los riesgos en la aplicación clínica de las vacunas de ADN. Hoy en día, una de las alternativas para reducir la cantidad de los administrados plásmido es la entrega de por lo micropheres [14, 16, 17] o [7] liposomas. Sin embargo, el plásmido de ADN no es fácilmente liberado de estos complejos y esta puede detener la inducción de una respuesta inmune eficiente. Por lo tanto, los nuevos enfoques, como el que se describe en [25] puede ser una alternativa para reducir la dosis de ADN plásmido, sin alterar la respuesta inmunitaria.

Curiosamente, la Hsp65 mensaje ha sido consistentemente detectado en el músculo e hígado muestras de tejido en el día 15. Además, el número de colonias en el hígado es muy reducido (Cuadro 2], que podría, en parte, explicar la detección de Hsp65 mensaje en tales tejidos quince días después de la inyección de ADN. La persistencia a largo plazo de los plásmidos en el hígado y los tejidos musculares también ha sido observado por otros autores usando diferentes construcciones plásmido [5]. Sin embargo, otros autores diferentes resultados obtenidos después de utilizar rutas alternativas plásmido de la administración, como la intranasal [26]. Según lo propuesto por Wolff et al. (1992), el largo plazo expresión de antígenos por células musculares pueden estar relacionados con características estructurales, tales como las células multinucleadas. Es posible que estas características de tejidos son responsables de la presencia prolongada de mensaje a la Hsp65 en el tejido muscular. Sin embargo, no hay una explicación satisfactoria para la Hsp65 largo plazo mensaje expresión en el tejido hepático, pero debemos tener claro que la columna vertebral de un plásmido de ADN también pueden tomar parte en el mensaje de expresión.

La recuperación del plásmido ADN de las células eucariotas mediante transformación bacteriana es un simple, rápido y sensible método, que es adecuado para nuestro objetivo de verificar la presencia o ausencia de ADN plásmido en diferentes tejidos independiente del número de copias en los tejidos. Por otro lado, también detectaron el plásmido en algunos tejidos por PCR lo que indica que ambos métodos mostraron los mismos resultados (datos no presentados).

En general, el ADN plásmido genéticos utilizados en las vacunas SV40 posee una secuencia de reproducción y podrían replicarse en vivo. Replicativa síntesis de ADN plásmido en células de mamíferos puede ser evidenciado por la aparición de moléculas de ADN que carecen de la adenina methylase dependientes de adenosina (DAM) metilación [[27]. Plásmido ADN de la bacteria contiene una metiladas adenosina en el GATC reconocimiento de los sitios y Mbo Dpn I I. El Dpn I es transportada al sitio de manera más eficiente en caso de la adenina es metiladas, mientras que Mbo I es transportada al sitio de manera más eficiente en caso de la adenina es unmethylated [18, 27]. Si el plásmido de ADN se replican en células de mamífero, entonces el patrón de metilación bacteriana se pierde. El patrón de metilación en E.coli se muestra en la Figura 3B, como un control positivo. Procariótico ADN fue cleaved por DpnI como se esperaba, pero no por Mbo I (Fig. 3B], asegurar a la presa patrón de metilación. La metilación del plásmido rescatados de los músculos se muestra en la Figura 3A. Este resultado reveló que el patrón de metilación bacteriana inyectado pcDNA3-Hsp65 ADN permaneció sin cambios después de haber residido en el músculo durante al menos seis meses, lo que indica que este plásmido de ADN no reproducir in vivo. Estos resultados están de acuerdo con los de estudios anteriores utilizando diferentes vacunas de ADN plásmido [5, 28]. Además, la falta de plásmido de replicación in vivo proporciona un mayor grado de seguridad para la terapia génica de vacunación.

La recuperación de las colonias resistentes a la ampicilina de los tejidos de pcDNA3-Hsp65-ratones inmunizados después de la transformación total del ADN celular sugiere que algunos extracromosómicos de ADN plásmido se mantuvo durante al menos 6 meses. Southern blot análisis se hizo con el hígado y el músculo (datos no presentados) muestras a los 30 días después de la vacunación, debido al mayor número de plásmido bacteriano rescatado por la transformación en el hígado muestra. Además, el número de plásmido rescatado a 180 días fue comparable con el número de plásmidos obtenidos a los 30 días. Los resultados muestran en la figura 4 muestran que el plásmido no integrarse en la BALB / c genoma. En general, la integración en el plásmido ADN genómico se produce por el tándem se repite [30], y cuando se libera el genoma de la plásmido muestra una forma lineal en Southern blot. Por otra parte, cuando el plásmido de ADN no se ha integrado en el modelo de ADN sin digerir. El pcDNA3-Hsp65 mostró un patrón similar a la del ADN plásmido sin digerir en comparación a su forma natural de ADN plásmido utilizado en la inmunización (Figura 4, carril a y f). Estos resultados indican que pcDNA3-Hsp65 no fue integrado en el genoma del ratón en el punto de tiempo analizados.

La frecuencia de integración en el genoma celular podría verse afectada por varios factores, como el plásmido secuencia, la presencia de chi-como elementos [29], Alu segmentos [30] y minisatélite regiones [31]. Sin embargo, la integración de ADN plásmido bacteriano, no es tan simplista. El genoma de mamífero que parece poseer un mecanismo para proteger su integridad [32]. Además, los resultados proporcionados por Ledwith et al. (2000), utilizando diferentes plásmido construye sugieren que el riesgo de integración de las vacunas de ADN plásmido después de la inoculación intramuscular es insignificante. Por lo tanto, el uso de ADN plásmido en la terapia génica puede ser más seguro que los sistemas de vectores. En la actualidad, los mecanismos implicados en la no integración de pcDNA3-Hsp65 no podía ser definitivamente caracteriza. Sin embargo, nuestros resultados sugieren que la vacuna es segura para el uso clínico y señalan que el uso de un plásmido conteniendo el gen Hsp65 es fiable a efectos de la terapia génica, así como para la vacunación en un entorno clínico. Además, los resultados de largo tiempo biodistribución / dosis intramuscular después de la entrega se han observado y descrito por primera vez en el mismo. En consecuencia, consideramos que nuestros hallazgos no sólo abrir nuevas perspectivas para las vacunas de ADN, sino también dar lugar a nuevas consideraciones sobre el sitio de la inoculación y de los sistemas de suministro.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Izaíra T. Brandão por su asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, Fundación de Apoyo a la Investigación del Estado de São Paulo) y del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, de Brasil para el Consejo Desarrollo Científico y Tecnológico).