Filaria Journal, 2006; 5: 2-2 (más artículos en esta revista)

PCR y la disección como instrumentos para vigilar filarial infección de los mosquitos Aedes polynesiensis en la Polinesia francesa

BioMed Central
Catherine Plichart (cplichart@ilm.pf) [1], Yves Sechan (ysechan@ilm.pf) [2], Neil Davies (ndavies@moorea.berkeley.edu) [3], Anne-Marie Legrand (alegrand @ ilm. PF) [1]
[1] Institut Louis Malardé, P0 Box 30, Papeete, 98713 Tahiti, French Polynesia
[2] Centro IRD (Institut de Recherche pour le Développement), PO Box 529, Papeete, Tahití 98713, Polinesia Francesa
[3] Richard B. Gump South Pacific Research Station, University of California Berkeley, PO Box 244, 98728 Moorea, French Polynesia

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Resumen
Antecedentes

Entomológica métodos pueden proporcionar importantes herramientas para el control de la transmisión de la filariasis en la Polinesia francesa. Con el fin de normalizar nuestro método de PCR y refinar nuestra filarial protocolo para evaluar los niveles de infección en los mosquitos, en comparación disección del vector, Aedes polynesiensis, poolscreening con la reacción en cadena de polimerasa (PCR-PS) ensayo.

Métodos

(1) Los mosquitos fueron colectados en las capturas de aterrizaje humano en cinco áreas en la isla Moorea, Polinesia Francesa. (2) Una fracción de los mosquitos capturados fue disecada para Wuchereria bancrofti larvas. (3) Laboratorio de cría de mosquitos (no infectada, así como infectados experimentalmente) se podían repetidamente probado optimizar un protocolo PS-PCR (ADN extractos de 1-50 combinaron los mosquitos se pusieron a prueba con un sistema interno normalizado y primers específicos para repetir la secuencia Ssp1 . Productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel). (4) Otra fracción de los mosquitos capturados fue ensayada por PS-PCR según el protocolo optimizado.

Resultados

La prevalencia de campo de la infección por el mosquito W. Bancrofti un rango de 1 a 8% en la disección (L1-L3) y el punto estimaciones de prevalencia de la infección, ya ensayadas por PS-PCR, varió de 0,4 a 3,7%. Hubo una fuerte correlación entre moderada de las tasas de infección de larvas según lo determinado por la disección y la PCR.

Discusión

Nuestros resultados sugieren que el PS-el ensayo de PCR es muy sensible y específica para detectar el ADN del parásito. Se obtuvieron similares, aunque no idénticos resultados con disecciones de los mosquitos. PS-PCR parece ser suficiente para probar un gran número de mosquitos en el contexto de los programas de eliminación de la filariasis. El papel y las ventajas de la utilización de los métodos de seguimiento de entomologic filariasis programas se discuten.

Antecedentes

Casi el 10% de la población de la Polinesia francesa es todavía infectadas con el Wuchereria bancrofti filariae con la Sociedad y Marquisas archipiélagos siendo los más fuertemente infectadas. Control de la eficacia de los programas de eliminación de la filariasis depende de una cuidadosa evaluación de los niveles de infección en los humanos y las poblaciones de vectores después de la introducción de programas de control.

Polinesia francés tiene una larga historia de control de la filariasis. El más reciente esfuerzo para lograr la eliminación de la filariasis en la Polinesia Francesa es el Pacífico programa para la eliminación de la filariasis linfática (PacELF). PacELF se puso en marcha en 2000 y se basa en la administración anual masiva de medicamentos (MDA) durante un mínimo de cinco años de toda la población, con una combinación de dietilcarbamazina a dosis de 6 mg / kg de peso corporal y albendazol (400 mg / persona). En la Polinesia Francesa, el MDA se lleva a cabo cada comienzo de abril. El impacto de la comunidad programa de tratamiento en los sitios centinela (Maupiti, Raiatea y Tahuata) se informó de otros lugares. Aquí, nos centramos en la evaluación de las infecciones en los mosquitos vectores. Por razones éticas, la vigilancia de infecciones en los mosquitos ofrece algunas ventajas sobre los repetidos exámenes de sangre de la población humana. Mosquito disección ha sido el estándar de oro para la medición de las tasas de infección y de las densidades en el vector. Sin embargo, se hace cada vez más costoso y laborioso para llevar a cabo un número suficiente de disecciones en las zonas donde la prevalencia de infección se reduce por debajo del 1%. La capacidad de las técnicas de PCR para detectar una microfilaria en piscinas de hasta 50 mosquitos sugiere que los actuales métodos de PCR podría facilitar la puesta a prueba de un número adecuado de los mosquitos para que los cambios en la transmisión que se mide.

En este estudio, se describe el protocolo de PCR normalizada filarial para evaluar los niveles de infección en los mosquitos. Para validar nuestro procedimiento estándar, evaluamos filarial las tasas de infección en el campo-Ae capturados. Polynesiensis y PS-PCR en comparación con la disección. El área de estudio se Moorea isla en el archipiélago de la Sociedad, ya que su ubicación cerca de Tahití facilitado repetidas campo colecciones de mosquitos. A pesar de que no tenía los últimos datos sobre la prevalencia de la LF en la población humana de esta isla, los datos de investigaciones anteriores [1, 2] (41% microfilaremia prevalencia en el año 1950 antes de cualquier MDA, el 0,4% en 1983 después de cerca de 30 años continuos DEC Profilaxis activa y un 7% en 1993 a los diez años de parada de cualquier MDA) supongamos un moderado nivel de transmisión permanente.

Métodos
Colección de sitios

El principal vector de W. Bancrofti en la Polinesia Francesa es el día de morder mosquito Ae. Polynesiensis [3] con la transmisión se producen durante todo el año. Los mosquitos fueron colectados en cinco localidades de las comunas de Teavaro y Afareaitu al este-sudeste de la zona de Moorea, Sociedad Archipiélago: Afareaitu, Haumi, Maatea, Teavaro y Vaiare.

Método de recolección de mosquitos

Como Ae. Polynesiensis no pueden ser capturadas en número suficiente en cualquier venta en el comercio trampas, es necesario capturar los mosquitos en humanos desembarque de capturas [3]. Los mosquitos fueron colectados por aspiración, ya que aterrizó de harina de sangre. Colecciones se hicieron dentro de los 15 metros de una casa. En general, los lugares de recolección fueron separados por al menos 150 metros. Durante el período de recogida, el ser humano actúa como el "cebo" bared sus piernas y se sentó en silencio, mientras el receptor en círculos lentamente la captura de los mosquitos, ya que aterrizó. Todos los mosquitos recogidos de una sola estación se colocaron en una etiqueta un tapón de algodón en el tubo de ensayo 5-8 ° C en una caja de hielo hasta transportadas al laboratorio.

Estrategia de muestreo sobre el terreno para los mosquitos

Ae. Polynesiensis poblaciones se muestrearon por recoger el mayor número de hembras de los mosquitos en 10 minutos en cada uno de los períodos de sitios de recolección. Los individuos capturados eran representativas de la población en términos de densidad y estado de la infección. Un esfuerzo consciente se hizo para seleccionar el más sombrías y protegido dentro de la colección de sitio para garantizar la mayor probabilidad de que la captura de mosquitos. Dos colecciones de 10 minutos se llevaron a cabo en cada colección "estación" independientemente de la densidad de picadura de mosquitos. El número de estaciones de recolección por sitio de recolección osciló entre 9 a 19 dependiendo de la zona geográfica del lugar con el fin de obtener una muestra representativa de que el área de estudio.

Laboratorio de mosquitos criados

El laboratorio de colonias de Ae. Polynesiensis fue criado en jaulas de 30 cm3 mantienen en una cámara climática a 27-29 ° C, 80-90% de humedad relativa en un 16:8 horas de luz: oscuridad ciclo [4]. Las larvas de la colonia se obtuvieron de los sitios de reproducción natural (madrigueras de cangrejos, pequeños estanques y charcos) y se coloca en una bandeja llena de crianza de 1 L de agua destilada. Las larvas se alimentan en polvo cat "pellets". Los mosquitos adultos se permitió el acceso a una mecha de algodón empapado en la solución de sacarosa al 10%. Huevos para mantener la colonia fueron obtenidos por mosquitos que se alimentan en las ratas de laboratorio.

Mosquito disección

Los mosquitos fueron disecados por lo general dentro de las seis horas después de que fueron recogidos; en unos pocos casos que se celebraron durante la noche a 4 ° C y diseccionado el día siguiente. Justo antes de comenzar la disección y por un tubo a la vez, los mosquitos fueron anestesiados por enfriamiento durante unos minutos. Luego, fueron colocados en una placa petri y las alas y las piernas eliminado utilizar dos pares de jewelerss' fórceps bajo magnificación de baja potencia. El individuo mosquitos fueron colocados en un portaobjetos de microscopio y con agujas de disección dividido en cabeza, tórax y abdomen, colocando cada parte del cuerpo por separado en una gota de una solución salina de la misma diapositiva. El abdomen fue disecada primera y ovarios clasificado para la paridad [5]. Mujeres nulíparas fueron inmediatamente registrados como no infectada sin más disección. Por parous mujeres, los tres segmentos corporales fueron examinados y se burlaran aparte de las larvas o gusanos etapa microfilaria. La ubicación y el número de los parásitos se observó. Los mosquitos desempeño microfilaria, L1, L2 o L3 larvas se definieron como infectados.

Infección experimental de laboratorio criados mosquitos

Artificial se alimentan de sangre de las mujeres crían los mosquitos se realizó a través de la membrana de alimentación Parafilm según Failloux et al. Y Rutledge et al. [4, 6]. Los mosquitos se infectan por vía oral a través de una harina de sangre tomadas a través de un Parafilm membrana se coloca sobre la apertura de un depósito de alimentación. Infecciosas sangre fue preparado mediante una adecuada cantidad de microfilarias recuperados por la técnica de filtración por membrana [7] venosa de la sangre de una persona infectada. Microfilarias fueron resuspendidos en la sangre no infectada (con el añadido de ATP, 2,6 mg / ml) de un donante a una densidad de microfilarias 1200-1500 por mL (determinado por un conteo triplicado, de 2 μ L muestras). Alimentar a los embalses se llenaron con 3,5 mL de sangre infectada y permite que se caliente a 37 º C. Alimentadores posteriormente se colocaron en la parte superior de las tazas de plástico cubierta por una red de nylon. 6 Copas de 50 días de edad fueron mujeres de hambre durante 24 horas antes de la membrana de alimentación. Los mosquitos se permitió a la alimentación de 1 h. Engorged mujeres (125/400) se mantuvieron, 20 fueron disecados inmediatamente y los otros congelados a -20 ° C hasta su utilización como controles positivos para la extracción de ADN (número medio de microfilarias por mosquitos resultó ser 1,2 ± 1,4; n = 20) .

Extracción de ADN

Extracciones de ADN se realizaron según el método descrito por Nicolas et al. [8] con algunas modificaciones (método A) o usar el Qiagen DNAeasy de tejido Kit (Qiagen, Hilden, Alemania; Cat. N º 69504, con un procedimiento especialmente optimizado para mosquitos tejidos (método B). Piscinas de los mosquitos se secaron durante 3 h A 90 ° C, antes de ser cuidadosamente estrelló con un triturador de tejidos estériles pestle (Fisher Ciencia) en un tubo eppendorf 1,5 ml.

Controles de la extracción de ADN

Dos controles negativos de extracción de ADN de un grupo de cría de los mosquitos se incluye con todas las carreras. Tres controles positivos también se incluye con cada PCR plazo. Controles positivos consistía en piscinas de cría de los mosquitos de pinchos con un mosquito infectado experimentalmente (número medio de microfilarias por mosquitos infectados fue de 1,2 ± 1,4, n = 20, según lo determinado por microscopía) o con microfilarias (número medio de microfilarias por L 2 μ considerado en la muestra Microscopio: 3 ± 2, n = 6).

Mediante amplificación por PCR

Los ensayos de PCR se realizaron utilizando NV-1 y NV-2 oligonucleótidos específicos para la Ssp Ssp 1 repetición a lo descrito previamente por Zhong et al., Chanteau et al. Y Nicolás y Plichart [10 - 12]. La amplificación se realizó con un gradiente Mastercycler termociclizador PCR (Eppendorf AG, Hamburgo, Alemania) usando Hot Start Taq (Qiagen, Hilden, Alemania) y 1 / 20 e, 1 / 40 e o 1 / 240 e de muestras de ADN en un volumen de reacción De 25 μ L. La PCR temperatura programa fue el siguiente: 15 min a 94 ° C, 5 min a 54 °, a continuación, 30s a 72 ° C, 20 segundos a 94 ° C, 30 a 54 ° C durante 35 ciclos, y, por último, 5 min a 72 ° C. Mezcla de reacción incluido 1 unidad de Taq polimerasa, 5 pmoles de cada primer, NV1 y NV2, 5 mmoles de cada dideoxynucleotide y 1,5 μ l de 25 mM MgCl 2 en 1 × Qiagen PCR buffer. La eficiencia de la amplificación de PCR pueden variar de una muestra a muestra, dependiendo de la calidad de los preparativos de ADN. Algunos inhibidores de la PCR de los mosquitos, no puede ser eliminado por completo que conduzca a resultados negativos falsos. Para el control de esta variación, en un segundo tubo de un patrón interno (pWb11) se añadió a cada reacción de PCR para la co-amplificación junto con el blanco W. Bancrofti ADN utilizando el mismo par de primers. Un control negativo para el ensayo de PCR, utilizando agua destilada estéril en lugar de extraer ADN en la mezcla de reacción se incluyó corre con todos, así como un control positivo de PCR (Ssp1 secuencia clonada en un plásmido pTZ18, este plásmido recombinante es designado pWb01). Análisis de los productos de PCR se realizó a través de la electroforesis en gel. Diez μ l de los productos de PCR fueron cargados en un 1,75% de gel de agarosa con bromuro de etidio (0,5 μ g / ml) para la visualización de la UV bandas de amplificación (191 pb para el Ssp1 repetir y 225 pb para el pWb11 de control interno).

Análisis estadístico

Las tasas de prevalencia de la disección se expresaron como porcentaje de los mosquitos infectados y calcularon con intervalos de confianza del 95%. PCR punto estimaciones se calcularon y compararon mediante Poolscreen 2,0 generosamente proporcionado por el doctor Tom Unnasch y Charles Katholi (de la Universidad de Alabama, Birmingham, EE.UU.) [13]. El coeficiente de correlación de Pearson fue usado para estimar la asociación basada en la disección de las tasas de prevalencia con tasas basadas en la PCR.

Resultados
Obtención y disección de datos

Ae. Polynesiensis hembras de los mosquitos fueron recolectadas en diferentes sitios del área de estudio durante tres períodos. El objetivo de campo de recolección de 1 (octubre de 2003) era reunir datos preliminares sobre la captura y la aproximación de las tasas de prevalencia de larvas de los mosquitos en disecados. Posteriormente, el campo de acopio de 2 (noviembre de 2003) fue administrado con el fin de recoger suficientes Ae. Polynesiensis a ser analizado en 2 lotes para la comparación entre cada uno de disecciones y la PS-PCR método. El tercer campo de colección (abril de 2004) evaluaron la prevalencia de niveles, bajo diferentes condiciones estacionales de los de la colección 2. Datos de campo se presentan en el cuadro 1.

Mosquito colecciones en diferentes períodos difieren en sus tasas de captura. Evidentemente, estos parámetros (obtiene dividiendo el número de minutos gastados en la captura de esfuerzo en el número de mosquitos capturados durante ese tiempo) varía significativamente en Afareaitu, Maatea y Vaiare por el período de recogida. Las tasas de captura en abril de 2004 fueron el 20% y el 33% de la captura de las tasas observadas en noviembre de 2003, por exactamente la misma colección "estaciones".

En materia de acopio de 2 de noviembre de 2003, el 25% de los mosquitos capturados (en cada estación de recogida de recogida de cada sitio) se mantuvieron para la disección. Paridad tasas fueron por lo general entre el 80 y el 100%. Las tasas de infección determinada por la disección y el recuento de las personas infectadas con W. Bancrofti L1, L2 o L3 larvas, mostraron algunas variaciones, de un sitio a otro de recogida, con los niveles de infección entre el 1 y el 8% (cuadro 1].

Entre los mosquitos durante 1021 disecados campo de colección 2 en noviembre de 2003, 34 se encontraron infectados con W. Bancrofti (cuadro 2]. Ellos albergan la mayoría de las larvas L1 y L3 con media de número de larvas de cada etapa larval que oscilan entre 1 y 4 por mosquito infectado.

Optimización de la extracción de ADN y PCR procedimiento de laboratorio que crían los mosquitos

Se evaluaron diferentes parámetros para optimizar el procedimiento de extracción de ADN utilizando el kit Qiagen (método B) para obtener resultados similares en sensibilidad y especificidad para el método de referencia (método A). En primer lugar, se tomó especial cuidado para la molienda fina del mosquito tejidos. En segundo lugar, con el fin de obtener una completa lisis de las membranas celulares para la óptima liberación de la ADN, la incubación con proteinasa K se realizó dos veces. Además, se prestó atención a los pasos de lavado de extraer el ADN vinculado a la columna de sílice con el fin de obtener una óptima limpieza y para eliminar los inhibidores (compuestos que puedan inhibir aún más el PCR).

El cuadro 3 muestra los resultados obtenidos con piscinas de cría de mosquitos en laboratorio de pinchos con un mosquito infectado experimentalmente extraído por medio de un método, respectivamente, y el método B. En ambos casos, se observó que once de los 12 controles positivos arrojó dos bandas de amplificación de ADN (191 bp y 225 bp). Uno de los casos no ceder los 191 bp, aunque la banda de 225 pb patrón interno se amplifica de manera eficiente. Estos corresponden a extractos de control de los mosquitos que no ingieren microfilarias infectados experimentalmente durante la harina de sangre. Con el método B, se observó que los controles positivos y negativos no ceder bandas de amplificación de ADN (191 bp banda y banda de 225 pb) al 1 / 20 o e 1/40e de los extractos de ADN fueron utilizados para PCR. Tales resultados señal de la presencia de inhibidores en una dosis que bloquea la actividad de Taq polimerasa. La disminución de la concentración de la muestra de ADN a 1/240e o 1 / 1200 e conduce a la amplificación de ADN, lo que indica que no son los compuestos inhibidores en concentración suficiente para ser activo. Controles positivos preparado con microfilarias de pinchos en piscinas de cría de mosquitos en laboratorio y extrajeron utilizando el método B fiable dio resultados positivos sin inhibición (cuadro 4] cuando la fracción utilizada para la PCR fue pequeño (1/240e es decir, el 1 μ l de la plantilla). A juicio para reducir la cantidad de Taq polimerasa utiliza dio resultados negativos falsos (datos no presentados), de manera que 1 U mantenerse como la cantidad óptima de Taq polimerasa.

La aplicación del protocolo optimizado para mosquitos recogidos sobre el terreno

El protocolo optimizado para la extracción de ADN utilizando el kit Qiagen mediante amplificación por PCR y de un 1 / 240 e fracción de la extracción de ADN se aplicó a las piscinas, de 20 de mosquitos recogidos en Moorea. La infección de las mujeres Ae Ae. Polynesiensis por W. Bancrofti se evaluó tanto por la disección y la PS-PCR en los mosquitos de campo de recolección de 2 (véase el cuadro 5 y el gráfico 2]. Hubo una moderadamente fuerte y significativa correlación entre las tasas de infección por larvas según lo determinado por la disección y la PCR (r = 0,68, p <0,05). Los mosquitos recogidos en abril de 2004 mostró PCR estimado de larvas prevalencias similares a las tasas observadas en noviembre de 2003 (cuadro 6], aunque el número de mosquitos colectados en la superficie total es significativamente menor.

Discusión

MDA microfilarial anual con las drogas, la única herramienta de que dispone actualmente para luchar contra la infección filarial debe ser eficiente, en principio, en la eliminación de la filariasis linfática. Monitorización cuidadosa de los filarial transmisión es necesaria para seguir el avance hacia la eliminación y, en particular, para decidir cuando dejar de tratamiento comunitario, así como para certificar la eliminación.

Entomológica medidas de filarial infección de los vectores de proporcionar "tiempo real" filarial estimaciones de la transmisión [14]. La disección se considera el estándar de oro contra el que otros métodos han de ser comparados. Los procedimientos fueron diseñados para normalizar nuestro método de PCR y de perfeccionar nuestra filarial protocolo para evaluar los niveles de infección en los mosquitos. En un ensayo de validación, se evaluó filarial las tasas de infección en el campo-Ae capturados. Polynesiensis entre el 5 de las zonas situadas a lo largo de la este-sur-este de la costa de la isla Moorea en la Polinesia francesa y PS-PCR en comparación con la disección.

De las colecciones de campo mostraron que la densidad de población de mosquitos fluctuado considerablemente de un sitio a otro. La estrategia de muestreo con el fin de recoger muestras representativas de las poblaciones de mosquitos en términos de densidad y de la infección, parece rendimiento información valiosa sobre la situación de toda el área de estudio. Disección trabajo fue realizado por experimentados entomólogos con un especial cuidado (ver sección de método) para evitar la subestimación de la infección.

Las tasas de infección determinada por disección (porcentaje de los mosquitos infectados con cualquiera de las etapas de desarrollo W. Bancrofti) oscilaron entre el 1 y el 8% en los 5 sitios muestreados en noviembre de 2003 con un valor medio de 3 (2-4)% para el total Zona. Este valor se calcula a partir de aproximadamente un mil disecados mosquitos es una buena estimación del "índice de potencial transmisión a los seres humanos" especialmente en la ausencia de datos recientes sobre los niveles de infección en la población humana de la zona de estudio.

Los repetidos experimentos para optimizar un protocolo PS-PCR utilizando el kit Qiagen método de extracción de ADN (método B) se realizaron con el objetivo de dar resultados compatibles con la sensibilidad obtenida con la "referencia" método (método A) para las piscinas de hasta 50 laboratorios - Mosquitos criados de pinchos con material infectado experimentalmente. El protocolo ha sido optimizado para: (1) multa de molienda de los mosquitos, (2) liberación de ADN por un doble incubación con proteinasa k, (3) lavados de extraer el ADN vinculado a la sílice para reducir los inhibidores de la columna, (4) la detección de Falsos negativos mediante el uso de un patrón interno (5) y un cuidado meticuloso para evitar los falsos positivos (contaminaciones) que conducen al éxito positivas y negativas de experimentos controlados.

La validación de este protocolo PS-PCR realizados sobre los mosquitos recogidos en el área de estudio, analizaron 200 grupos de 20 personas, arrojaron valores estimados de la prevalencia de larvas en la zona. Disección y PS-ensayo de PCR generado superposición / similares, aunque no idénticos resultados.

Aunque la disección es una herramienta muy efectiva para controlar la infección prevalencias en poblaciones de vectores, y ha sido el patrón oro, es muy laborioso, que consumen mucho tiempo que el método requiere experiencia entomólogos. En nuestra situación, la decisión de utilizar PS-PCR en vez de individuales disección incluso para valores de prevalencia> 1% toma en cuenta la escasez de entomólogos capacitados, junto con el hecho de que la estimación de la filarial transmisión puede realizarse adecuadamente en sólo unos pocos cientos De los mosquitos. Cuando descenso en la prevalencia de infección por debajo del 1%, sólo PS-PCR es rentable. Es importante experimentar un precisamente calibrado y validado antes de la transmisión del protocolo de nivel de disminución.

Hay que tener cautela con este enfoque, sin embargo. En primer lugar, Ae polynesiensis es un dengue, así como un vector de la filariasis y la ausencia de una trampa disponible en el comercio a la muestra de la población de mosquitos requiere el uso de aterrizaje humano, con la posibilidad de capturas accidentales de morder. Un segundo problema es que en un programa de MDA para eliminar la filariasis linfática, las tasas de infección en los humanos y las poblaciones de mosquitos disminuirá con los sucesivos tratamientos de la población humana. El seguimiento de los progresos hacia la eliminación, por lo tanto, requieren cada vez más muestras de mosquitos a medida reducciones significativas en las infecciones. Ambos de estos obstáculos se pueden superar con el desarrollo de una trampa capaz de capturar un gran número de Ae polynesiensis.

En conclusión, el adaptado PS-técnica de PCR puede detectar una microfilaria en piscinas de hasta 50 mosquitos se presentan en este documento se confirma que esta prueba es adecuada para la realización de pruebas Ae. Polynesiensis mosquitos en el contexto de los programas de eliminación de la filariasis. Se puede aplicarse útilmente para vigilar la prevalencia de la infección por W. Bancrofti en toda la zona donde Ae. Polynesiensis es el principal vector cuando una eficiente trampa de ser desarrollado.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

AML diseñó y coordinó el estudio, YS supervisó las colecciones de mosquitos, y la crianza de disecciones, CP realizado ensayos de PCR, la entrada de datos y el análisis de datos, y ND asistida con trabajo de campo de diseño y análisis estadístico.

Agradecimientos

Agradecemos el apoyo financiero del Gobierno de la Polinesia Francesa, el Ministerio francés de los Territorios de Ultramar, y el Instituto Louis Malardé la UC Berkeley Gump estación. Damos las gracias a M. Faaruia, A. y M. Germain Tetuanui para su asistencia técnica en la reunión, la disección y la cría de mosquitos. También queremos agradecer a la Sra Sandra Laney (Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de Massachusetts, Northampton, MA, EE.UU.) por sus consejos útiles sobre la extracción de ADN y el Dr Tom Burkot (Centro de Control y Prevención de Enfermedades, División de Enfermedades Parasitarias, Atlanta , GA, EE.UU.) por su lectura crítica del manuscrito.