Journal of Experimental & Clinical Assisted Reproduction, 2006; 3: 2-2 (más artículos en esta revista)

Análisis comparativo de la morfología del folículo y ovocitos de diámetro en cuatro especies de mamíferos (ratón, hámster, cerdo, y humanos)

BioMed Central
Jeanine Griffin (jeanine.griffin @ hsc.utah.edu) [1], Benjamin R Emery (bemery@hsc.utah.edu) [1], Ivan Huang (ivan.huang @ hsc.utah.edu) [3], C Matthew Peterson (c.matthew.peterson @ hsc.utah.edu) [3], Douglas T Carrell (douglas.carrell @ hsc.utah.edu) [1]
[1] Andrology and IVF Laboratories, Division of Urology, Department of Surgery, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, Utah 84108, USA
[2] Department of Physiology, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, Utah 84108, USA
[3] Division of Reproductive Endocrinology, Department of Obstetrics and Gynecology, University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, Utah 84132, USA

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

Animales de laboratorio se utilizan habitualmente para evaluar las propiedades fisiológicas de los mamíferos folículo ovárico y la adjunta ovocito. El uso de las diferentes especies para determinar la relación entre la morfología folículo ovocitos y ha dado lugar a un patrón reconocible de las fases folicular, pero las diferencias en el tamaño de folículo, el ovocito de diámetro y de la proliferación de células de la granulosa no son coherentes entre las diferentes especies. En un esfuerzo por comprender mejor cómo estas diferencias se expresan a través de múltiples especies, esta investigación evalúa folículo diámetros de los ovocitos y células de la granulosa y de la proliferación en el ratón, hámster, cerdo, y humanos.

Métodos

Secciones histológicas de los ovarios desde el ratón, hámster, cerdo, y los humanos se han utilizado para calcular el diámetro de los ovocitos y el folículo y el número de células de la granulosa presentes en las etapas pre-determinado del desarrollo folicular. Un análisis estadístico de estos datos se realizó para determinar la relación de crecimiento folicular y el desarrollo dentro y entre las especies evaluadas.

Resultados

Estos datos han puesto de manifiesto que las relaciones de las características que se muestran son estrictamente regulados dentro de cada especie, sino que varían entre las especies estudiadas.

Conclusión

Esta información puede ser útil para los estudios comparativos realizados en diferentes modelos animales y los humanos.

Antecedentes

En un esfuerzo para comprender el crecimiento folicular y desarrollo de los ovocitos en los humanos, muchos modelos animales de folliculogenesis están en uso [1 - 6]. Cada uno de estos modelos ha similitudes específicas a la promoción humana y en caso de que una modelo puede ser insuficiente, el otro puede proporcionar los caracteres adecuados para la experimentación. Un obstáculo importante en la interpretación de los datos de las diferentes especies en relación con los humanos reside en la comprensión de las similitudes y diferencias entre los sistemas de investigación y de los humanos.

A primera vista, las etapas de la maduración folicular parecen ser morfológicamente bien definidas a través de las especies. De hecho, un folículo de cualquier mamífero modelo general puede ser categorizada como primordial, primaria, secundaria o sobre la base de la existencia y el número de capas de células de la granulosa cúbico [5, 7]. Secundaria folículos se puede subdividir en varias etapas basadas en el tamaño y la presencia de líquido antral. Estas etapas son inicialmente definido como preantral (antes de la acumulación de líquido antral) o antro (después de la acumulación de líquido antral). Antro etapas se aclaró además en etapas incipientes de antro (de los primeros signos de acumulación de fluido) para etapas posteriores de principios de antro y Graafian etapas basado en el tamaño del folículo y la cantidad de líquido folicular [5, 8]. Sin embargo, las variables importantes tales como los ovocitos de diámetro y el número de células de la granulosa de apoyo no son evaluados en la aplicación universal de este sistema de clasificación [2, 9].

Hasta ahora, no ha habido un estudio que compara múltiples especies o las diferencias morfológicas que indican que están presentes en un folículo y su adjunto dado ovocitos en etapas en un solo estudio. Este estudio se diseñó para evaluar al mismo tiempo las diferencias en el diámetro de los ovocitos y el folículo y la proliferación de células de la granulosa en el ratón, hámster, cerdo, y los humanos en todas las fases de maduración.

Métodos
Tejido ovárico colección

El comité de ética apropiado se obtuvo la aprobación para el uso de animales y humanos tejido ovárico en este estudio. Mujeres B6D2/F1 híbrido ratones y hámsters Golden sirio se obtuvieron a los 3-4 semanas de edad (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) y alojados hasta utilizados para experimentación en seis a ocho semanas de edad. Tejido ovárico se obtuvo a necropsia inmediatamente después de la eutanasia y lavados dos veces en 0,01 M PBS. Cerdo ovarios se obtuvieron de pre-puberal cerdas jóvenes en un matadero local. Estos ovarios fueron transportados en 0,01 M PBS que contenía 3% de albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma Chemical, La Jolla, CA) en el sitio Web de la transformación dentro de la hora de la salida. Humanos ovarios se obtuvieron de las mujeres, 23 a 45 años de edad, sometidos a ooforectomía para indicaciones no neoplásicas. Humanos tejido ovárico fue retirado por el cirujano de funcionamiento y entregado al departamento de patología, donde una sección de la corteza ovárica se logró para el estudio. La corteza ovárica llegaron al lugar de procesamiento en Leibovitz L-15 medios de comunicación (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contiene un 3% de BSA dentro de la hora de oopherectomy. Todos los tejidos fueron trasladados a formalina al 10% (Sigma Chemical, La Jolla, CA) en 0,01 M PBS para el procesamiento y la evaluación histológica.

Folículo procesamiento histológico y de identificación

El conservados en formol los tejidos de todas las especies fueron enviados a una universidad de laboratorio básico para los procesos de rutina en un procesador automatizado de tejidos e incluidos en parafina. Cinco a diez micras de serie de secciones obtenidas de un micrótomo rotatorio fueron montadas en portaobjetos de cristal liso y rutinaria teñidas con hematoxilina y eosina para microscopía de luz evaluación.

Cada sección de tejido se evaluó por la presencia de folículos oocytic usando un microscopio Nikon E300 equipado con cuatro, diez, veinte, cuarenta, sesenta veces magnificación y objetivos del Plan (Nikon, Japón). El microscopio también fue equipado con una cámara digital Cool Pix (Photometrics, Tucson, AZ), en un trinocular montar y se vinculan a una Macintosh G4 (Apple Computer, Cupertino, CA) ejecutando el software de captura de imagen RS Image (Photometrics, Tucson, AZ) .

La identificación de los folículos dentro de las secciones de serie se basa en criterios estrictos. Folículos fueron evaluadas para determinar si un antro cavidad han formado dentro del folículo. Esto se llevó a cabo mediante la revisión de cada aspecto del folículo, a través de las secciones de serie, para la formación de antro o de una zona dentro de la estructura que contiene un espacio vacío de las células de la granulosa. Si un antro cavidad fue reconocido, la sección de la serie que muestra el mayor folículo transversales de la zona fue utilizada para proseguir con su evaluación (Fig. 1a]. Cuando la evaluación inicial del folículo no indican una cavidad antral, la sección en la que el núcleo de los ovocitos fue visible en el folículo se utiliza para la posterior evaluación (Fig. 1b]. Sobre la base de los criterios de Gougeon [7] y Knigee y Laetham [8], todos los folículos se evaluaron simultáneamente de las señales morfológicas de la atresia y excluidos del estudio cuando identificados. Además, notablemente distorsionada folículos, que sufrieron daños durante la preparación de tejidos, también fueron excluidas del estudio. Las imágenes capturadas de todos los folículos cumplan los criterios de selección se guarda como imágenes en formato tiff y trasladado a la imagen J (NIH, Bethesda, MD), una aplicación de código abierto para el análisis de datos, también en un Macintosh G4, para proseguir con su evaluación.

Folículo y mediciones de los ovocitos

El cálculo exacto de los diámetros se garantiza mediante el uso de los instrumentos de medición integrados en el software Image J después de una etapa de calibración con micrómetro (Gurley Instrumentos de Precisión, Troy, NY). Además, en la medición de diámetros, dos medidas fueron tomadas. La segunda medición se originó en ángulo recto desde el punto medio de la primera medición (Fig. 1c]. Las dos mediciones se expresan como promedio y el diámetro de la estructura.

Los datos fueron recogidos de esta manera para determinar el diámetro del folículo, antro cavidad, y el ovocito. Folicular se midieron los diámetros de la pared exterior de la capa tecales, cuando se presente, o de la capa exterior de las células de la granulosa tecales cuando la capa estaba ausente. La formación de la capa tecales siempre ocurrió en el folículo preantral y está presente en todas las etapas posteriores. Además, los folículos que contienen una capa tecales se midió a través del folículo tecales desde el interior de la capa de la ayuda en el cálculo de la superficie del folículo ocupados por células de la granulosa (Fig. 1d]. Las mediciones de la cavidad antral eran de la capa interna de las células de la granulosa a la capa exterior de las células del cumulus que rodean el ovocito [10]. El ovocito se midió incluida la zona pelúcida, cuando presente. La formación de la zona pelúcida siempre se produjeron durante la fase de folículo preantral y está presente en todas las etapas posteriores.

De lo anterior mediciones morfológicas y observaciones, a través de todos los folículos se presentaron todas las especies (Fig. 2] [1, 2, 8]. En pocas palabras, los ovocitos sin zona pelúcida y hasta una capa de aplanado granulosa células progenitoras fueron clasificados como folículos primordiales. Primaria folículos se clasificaron como ovocitos rodeados por una capa de células de la granulosa cúbico. Ovocitos con dos o más capas de células de la granulosa, pero no visible espacio entre las células de la granulosa fueron identificados como preantral folículos. Folículos antrales, los que contengan cualquier antro cavidad, se divide en las categorías de la incipiente y pequeña antro y folículos Graafian. La incipiente folículos, que indican el comienzo de la formación de antro, fueron identificados por la presencia visible de espacio entre las células de la granulosa. Pequeños folículos antrales fueron identificados por la presencia de una cavidad segmentado con dos o más compartimentos, mientras que los folículos Graafian contenía una gran cavidad antral continua.

Datos de los cálculos y las estadísticas

La sección de cada folículo se calculó de acuerdo a la ecuación para el área de un círculo, área = π r 2, donde r, el radio, es igual a la mitad del diámetro calculado de la folículo. El número de las células de la granulosa presente en el folículo se deriva de conteo manual de cada celda de la sección transversal del folículo impreso de copias en papel de la imagen digital. El análisis estadístico y la comparación de datos se realizaron con STATA 7.0 (Stata Corporation, College Station, Texas) y Excel 2004 (Microsoft Corporation, Seattle, WA).

Resultados
Diámetro folicular

Las mediciones obtenidas por folículo diámetro fueron estratificados según folicular fase de clasificación para todas las especies (Fig. 3]. El conjunto de datos compilados incluye datos de este estudio para folículos de, ratón (n = 104), hámster (n = 273) y porcino (n = 284). Estos folículos se obtuvieron de 10 ratones, 10 de hámster, y el 6 de ovarios de cerdo. Además, el tejido ovárico humano del 5 biopsias se obtuvieron para este estudio y ha proporcionado un número suficiente de folículos para el análisis a través de la etapa preantral (n = 126). Posteriormente, la aparición de folículos antrales que no son atretic humanos en el hecho extremadamente raros y no es probable obtener utilizando cualquier técnica histológica [3]. La media de diámetro folículo y rangos para el antro grupos humanos están en la lista, por lo tanto, de los datos publicados anteriormente por la comparación, pero no está incluido en el análisis estadístico [11].

Curiosamente, el folículo diámetros son significativamente diferentes entre las cuatro especies en la fase primordial, en comparación usando ANOVA (p <0,005). Posteriormente, el folículo tamaños convergen en la enseñanza primaria y preantral etapas sólo para luego ver una enorme disparidad con un menor diámetro folicular del ratón en comparación con el hámster y cerdo folículo tamaño en la etapa incipiente en adelante antro (p <0,001). El cerdo y hámster divergen de la similitud en las primeras etapas de antro (p <0,001).

Diámetro de los ovocitos

Los diámetros de los ovocitos calculados, para todas las especies, se estratificaron en las etapas de crecimiento folicular (Fig. 4] de la misma manera que el folículo diámetros desde arriba. La media de los diámetros de los ovocitos humanos en etapas de desarrollo marcadas desde el comienzo de la antro de no obtenerse en este estudio de diseño, como en el caso de diámetro folicular. Para la comparación, la media del tamaño de un ovocito humano plenamente maduro, que está presente desde la etapa incipiente folículo en adelante [12], se incluye en la figura 4.

Cuando estratificada en clases folicular, la comparación estadística de los diámetros de los ovocitos de ratón, hámster, cerdo y pusieron de manifiesto una diferencia entre las especies en todas las etapas (p <0,005). Análisis del diámetro de los ovocitos humanos reveló una diferencia de todas las especies en las etapas primordiales y primarios (p <0,01), pero es similar a la de cerdos en la etapa de desarrollo preantral.

Contar las células de la granulosa

El número de células de la granulosa contados por sección de la primordial, primaria, secundaria, y la incipiente antro se compararon con los de diámetro folicular del folículo en cada una de las cuatro especies. El presente en las células de la granulosa folículos Graafian no fueron evaluados debido a la variación de los tiempos de duplicación y atresia de las células de la granulosa en esta etapa de todas las especies [13]. Pequeños folículos antrales tampoco se incluyeron en el análisis debido al aumento de la compactación de las células de la granulosa de la expansión del antro de líquidos [14]. Estos factores contribuyeron a hacer de la evaluación el número de células poco fiables dado por el método. Análisis de regresión de las células de la granulosa cuentan como una función del folículo diámetro cuadrático indica una línea de ajuste óptimo para cada especie (Fig. 5].

Discusión
Folículo diámetro folicular versus fase

Estos datos indican que la media del folículo diámetros de las especies estudiadas tienen distintos patrones de crecimiento folicular durante el desarrollo, pero que siguen una tendencia al aumento de tamaño folicular final dentro de cada folículo de clase en relación a la masa corporal (Fig. 3]. La implicación de estos datos es que cada especie alcanza la morfología característica de cada fase folicular, en la definición de un diámetro folicular, como se pone de manifiesto por el bajo error estándar de la media folículo dentro de las etapas de diámetro (Fig. 3], pero esto se define el tamaño no es coherente Entre especies.

Además, la tasa de crecimiento del folículo en función de la etapa de madurez no es coherente dentro de las especies. De hecho, la diferencia de diámetro entre las etapas folículo, dentro de las especies, se vuelve progresivamente más con cada etapa. Esto indica que el crecimiento del folículo de una etapa a la siguiente es progresiva, pero no lineal (datos no presentados). Esto es coherente con las anteriores publicaciones de las especies individuales que muestran el crecimiento del polinomio de mamíferos folículo en función del tiempo [12, 15, 16].

Ovocito diámetro folicular versus fase

La comparación de los ovocitos de diámetro se utiliza a menudo como un marcador de maduración de ovocitos o meióticas competencia. Considerando que esta medida se ha utilizado para correlacionar la fase de desarrollo folicular con maduración de ovocitos dentro de cada una de las especies [17, 18], estos datos presentados aquí inferir los ovocitos de diferentes especies alcanzan la madurez en el antro etapa incipiente de desarrollo, pero el diámetro de los ovocitos Cada especie es diferente a la madurez (Fig. 4]. Esto ha sido confirmado por los datos anteriores que muestran que en cada una de las especies estudiadas, los ovocitos maduros se convierte en el inicio de la acumulación de fluido antro, pero el ovocito puede seguir creciendo en diámetro a la etapa ovulatoria [12, 18 - 20].

Ovocito diámetro versus folículo diámetro

Otra definición de la característica morfológica de los ovocitos folículo relación es la velocidad a la que el ovocito crece en relación con el crecimiento del folículo, que se puede identificar como un tipo de curva de crecimiento. Esta curva de crecimiento no está en relación directa con el tiempo, pero en relación con la maduración del folículo y el oocito a través de las etapas morfológicas del folículo. La relación de los ovocitos de diámetro folicular se ha informado anteriormente para cada una de las especies en las primeras etapas de crecimiento folicular [8, 21 - 23], pero este es el primer informe conocido esta relación a través de la comparación de las cuatro especies utilizadas en este estudio (Tabla 1 ). Las ecuaciones de regresión de las cuatro especies son similares, pero no idénticos. De hecho, si el diámetro de los ovocitos y los diámetros correspondientes folículo se expresan como coeficientes, el análisis de varianza indica una diferencia significativa en la relación de los ovocitos a folículo diámetro entre las fases folicular y entre especies (datos no presentados). Así, el cambio en el diámetro de los ovocitos no es directamente proporcional al diámetro folicular, incluso en las primeras etapas de crecimiento folicular.

Células de la granulosa contar versus folículo diámetro

Evaluación de los análisis de regresión de las células de la granulosa a contar folículo diámetro revela que la relación entre la proliferación de células de la granulosa y folículo diámetro es estrictamente regulados dentro de cada especie y el aumento de un polinomio de moda (Fig. 3]. Esto se correlaciona con los datos presentados en otras especies de mamíferos que han mostrado la tasa de duplicación de las células de la granulosa, que se define como el intervalo de tiempo necesario para el número de células de la granulosa del folículo midsection al doble, es mucho más lento a principios de las fases folicular Que en la etapa incipiente antro [3]. Por lo tanto, estos datos son consistentes con las observaciones Hirschfield de crecimiento folicular. Además, señalan las diferencias entre las especies, como se muestra (Fig. 3].

Conclusión

Este estudio comparativo es el primero en detalle las diferencias observadas entre los modelos experimentales de folliculogenesis. Específicamente se identificó el visto variaciones morfológicas entre el ratón, hámster, cerdo, y los humanos de los folículos ováricos evaluación histológica. El cambio en el folículo y diámetro de los ovocitos en relación a la etapa de maduración (Figs. 3, 4], el cambio en la proporción de folículo de los ovocitos de diámetro (Tabla 1], y la proliferación folicular de las células, han sido mostrados en el presente documento que se Específicas de las especies estudiadas y no se debe generalizar a otros modelos.

Este estudio da lugar a numerosas e interesantes vías de reflexión que puede ser abordado en futuros estudios. Esos estudios pueden incluir una investigación de por qué los ovocitos y folículos son más grandes en algunas especies que otros. Además, sería interesante determinar por qué la relación entre la masa corporal y el tamaño de folículo se conserva entre especies. ¿Es posible que el aumento de tamaño del cuerpo requiere de un mayor volumen de líquido y el tamaño de los ovocitos para facilitar la recuperación de ovocitos en el abdomen para la entrega de los ovocitos a las trompas de Falopio para la fecundación? Estas cuestiones pueden ser resueltas por la manipulación de la realización de nuevos estudios in vivo en el sistema de estas especies.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

JG realizó la recopilación de datos y resúmenes. BRE ayudado en el diseño del estudio de recopilación de datos, resúmenes y análisis estadístico y redactó el manuscrito. IH aportados por la realización de análisis estadísticos. CMP y DTC concibe el estudio y el diseño de la investigación dirigida. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Ninguna.