Journal of Biology, 2005; 4(3): 11-11 (más artículos en esta revista)

Compuesto de desarrollo ojo inactivación de los siguientes trastornos TGF β señalización en la cresta neural de las células madre

BioMed Central
Lars M Ittner (littner@research.balgrist.ch) [1], Heiko Wurdak (heiko.wurdak @ cell.biol.ethz.ch) [2], Kerstin Schwerdtfeger (kschwerdtfeger@research.balgrist.ch) [1], Thomas Kunz (tkunz@research.balgrist.ch) [1], Fabian Ille (fabian.ille @ cell.biol.ethz.ch) [2], Per Leveen (Per.Leveen @ molmed.lu.se) [3] , Tord A Hjalt (Tord.Hjalt @ med.lu.se) [4], Ueli Suter (ueli.suter @ cell.biol.ethz.ch) [2], Stefan Karlsson (Stefan.Karlsson @ molmed.lu.se ) [3], Farhad Hafezi (farhad.hafezi @ iroc.ch) [5], Walter Nacido (wborn@research.balgrist.ch) [1], Lukas Sommer (lukas.sommer @ cell.biol.ethz.ch) [2]
[1-8008 Zurich, Suiza
[2--8093 Zurich, Suiza
[3-22184 Lund, Suecia
[4-22184 Lund, Suecia
[5-8002 Zurich, Suiza
[6] Current address: Brain & Mind Research Institute (BMRI), University of Sydney, NSW 2050, Australia

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Resumen
Antecedentes

Desarrollo del ojo depende en parte de la periocular mesenchyme derivados de la cresta neural (NC), pero la suerte de NC células de mamíferos ojo en el desarrollo y la coordinación de las señales de la formación de estructuras oculares son poco conocidos.

Resultados

Aquí nos revelan distintos NC contribuciones a la vez anterior y posterior del ojo estructuras mesenquimales y demuestran que la señalización TGF β en estas células es fundamental para el desarrollo normal de los ojos. En la anterior del ojo, TGF β2 liberados de la lente se requiere para la expresión de factores de transcripción Pitx2 y Foxc1 NC-en la córnea y derivados en la cámara de ángulo estructuras del ojo que el control de la presión intraocular. TGF β aumenta Foxc1 e induce Pitx2 expresión en cultivos celulares. Al igual que en pacientes portadores de mutaciones en el gen PITX2 y FOXC1, TGF β señal de inactivación en las células NC conduce a defectos oculares característicos de la enfermedad humana Axenfeld-Rieger la anomalía. En la parte posterior del ojo, NC células específicas de inactivación de señalización TGF β resultados en una condición humana que recuerda al desorden persistente hiperplásico primario vítreo. Como efecto secundario, la retina es también patrón alterado en los ratones mutantes.

Conclusión

En el desarrollo de la lente del ojo actúa como un centro de señalización TGF β que controla el desarrollo de las estructuras oculares derivados de la NC. TGF β defectuoso interfiere con la señal de transducción de NC-la diferenciación celular y la supervivencia anterior de la lente y con el tejido normal y la morfogénesis del patrón posterior a la lente. La similitud con el desarrollo de trastornos oculares en los seres humanos defectuosos sugiere que TGF β modulación de la señal en el ocular NC derivados contribuye a la fisiopatología de estas enfermedades.

Antecedentes

Funcionamiento normal de los ojos depende de una variedad de estructuras muy especializadas en el segmento anterior del ojo. Estos incluyen la córnea y el cristalino, que son necesarios para la refracción de la luz, el iris, que protege a la retina de un exceso de luz, y el cuerpo ciliar y estructuras de drenaje ocular, que proporcionan el humor acuoso y córnea necesarios para la nutrición y la lente para la regulación de La presión intraocular (Figura 1a-e]. El desarrollo de estos tejidos coordinada implica interacciones entre la superficie y el ectodermo neural y periocular mesenchyme que se deriva de la cresta neural (NC). El incumplimiento de estas interacciones múltiples resultados en el desarrollo de trastornos oculares, como Axenfeld-Rieger la anomalía, que consta de ojos pequeños (microftalmia), hipoplasia lirios, polycoria (iris lágrimas), y el patrón anormal de la cámara de ángulo entre la córnea y el iris; También es asociada con una alta prevalencia de glaucoma [1].

Desarrollo del segmento anterior del ojo depende de la correcta función de dos factores de transcripción en el mesenchyme periocular, la forkhead / winged-hélice y el factor FOXC1 dos a dos como homeodomain factor PITX2. En los seres humanos, hypomorphic y overactivating mutaciones en el gen o bien lleva a Axenfeld-Rieger La anomalía [1], y la mutación de una de las Foxc1 o Pitx2 resultados en ratones defectuosos en el segmento anterior del ojo-formación, similar a la observada en humanos Axenfeld-Rieger La anomalía [2 -- 4]. Considerando que los objetivos de FOXC1 expresado en el ojo están supuestamente implicados en la modulación de la presión intraocular del ojo ocular y el desarrollo [5], PITX2 objetivo de los genes se han asociado con la síntesis de matriz extracelular y la estabilidad [6]. En contraste, los reguladores de ambas aguas arriba FOXC1 y PITX2, no se habían determinado. Por otra parte, la identidad de las células que expresan FOXC1 y PITX2 durante patrón anterior del ojo no está claro.

Cabe la posibilidad de que el desarrollo aberrante de las células mesenquimales NC contribuye a las malformaciones observadas en Axenfeld-Rieger la anomalía. De hecho, las porciones del segmento anterior del ojo, incluyendo las células endoteliales corneales, de la síntesis de colágeno keratocytes, iris y melanocitos, se propuso que se originan de la NC [7 - 9]. El impulso definitivo de Carolina del Norte, sin embargo, se ha debatido, ya que la mayoría de los datos proviene de modelos aviar en el desarrollo ocular que parece ser ligeramente diferente de la de los mamíferos [10]. Por otra parte, los mecanismos de control ocular NC migración y diferenciación aún no se han dilucidado.

Factor de crecimiento transformante β (TGF β) es un factor de candidato para el control de esta infección, NC-el desarrollo de las células. TGF β señalización es necesaria para la generación de diferentes neural no derivados de la Carolina del Norte [11]. Curiosamente, señalización TGF β ojo durante el desarrollo es fundamental, como ligando de inactivación y sobreexpresión conducir a defectos oculares desarrollo en ratones [12, 13]. En ambos casos el desarrollo normal del segmento anterior del ojo está afectado, posiblemente como resultado de la alteración de NC migración y / o diferenciación. En particular, el fenotipo a la perturbación de la Tgfb2 gen recapitula ciertas características observadas en Foxc1 y Pitx2 ratones mutantes. La función celular de señalización TGF β NC ocular en el desarrollo no se conoce, sin embargo, y de un vínculo entre TGF β señalización y activación de los factores de transcripción Pitx2 y FoxC1 ocular en desarrollo todavía no se ha establecido [12].

Presentamos aquí los resultados de las células in vivo-suerte de cartografía de definir en detalle la contribución de la NC a la formación de ojos en ratones. Además, hemos utilizado condicional de orientación para inactivar genes TGF β señalización de las células madre en Carolina del Norte y, como resultado, en Carolina del Norte oculares derivados con el fin de evaluar las acciones de TGF β en estas células durante el desarrollo del ojo.

Resultados
- Células de la cresta neural contribuir a múltiples estructuras derivadas del ojo mesenchyme

NC-células específicas de la expresión constitutiva de β-galactosidasa en ratones transgénicos permite la vigilancia de NC-migración celular y el destino durante el desarrollo in vivo [9, 14]. Este método se utilizó en el presente estudio para definir las estructuras oculares procedentes de la NC. Rosa26 Cre reportero (Rosa26R) ratones, que expresan β-galactosidasa siguientes Cre mediada por recombinación, se acoplada con ratones transgénicos que expresan recombinasa Cre bajo el control de la Wnt1 promotor. Wnt1 Aunque no se expresa en toda la estructura del ojo en desarrollo (véase el archivo de datos adicional 1), que se expresa en la dorsal del tubo neural, lo que permite Wnt1-Cre mediada por recombinación en prácticamente todas las células madre de Carolina del Norte [11, 15]. En Cre-Wnt1 / Rosa26R doble ratones transgénicos, β-galactosidasa-NC-expresando células puede ser visualizado por tinción de X-gal.

NC-células han sido propuestos para contribuir al desarrollo ocular embrionarias en ratones después de los días (E) 12 [10]. Curiosamente, hemos observado que las células derivadas NC-ya eran detectables en E10 en torno a la óptica de la lente y la taza de vesícula (Figura 1f]. Hasta E13.5 (Figura 1f-j], el NC-células se encontraron principalmente en la mesenchyme periocular, mientras que las que cubren el epitelio, la lente y la retina de forma coherente la X-gal-negativos. Además, se observó que las estructuras de las principales vítreo, que se encuentra entre la lente y la retina, son NC-derivados (Figura 1f-j]. En etapas posteriores (Figura 1d, e], X-gal-positivas células contribuido al estroma y endotelio corneal y de las estructuras del ángulo de cámara en el cruce entre la córnea y el iris. En los ojos adultos, el estroma del iris, el cuerpo ciliar, y la malla trabecular, así como células de la coroides y vítreo primario, son todos de origen NC (datos no presentados). En conjunto, estos resultados muestran que las células derivadas NC-contribuir al desarrollo de los ojos tan pronto como el ojo de vesícula se forma y, posteriormente, a diversas estructuras de la maduración ojo.

Múltiples anomalías oculares derivarse de la inactivación de señalización TGF β en la NC-derivados periocular mesenchyme

El patrón de expresión de TGF β ligandos y sus receptores durante el desarrollo del ojo se visualizan mediante técnicas de inmunohistoquímica en las diversas etapas de desarrollo (E10.5 a E18), que muestran que el TGF β2 expresión alcanzó su punto culminante en la formación de la lente en E13.5 (figura 2a] y E15, pero disminuyó Hacia E18 (datos no presentados), mientras que TGF β1 y TGF β3 fueron indetectables (archivo de datos adicionales 2 y datos no presentados). En E13.5, TGF β del receptor de tipo 2 (Tgfbr2) se expresó en periocular mesenchyme, lentes, la retina, y el vítreo primario (figura 2b]. Porque en vivo suerte de cartografía reveló una contribución sustancial de la NC a la mesenchyme periocular, señalización TGF β podría ser importante para el desarrollo de NC oculares derivados. Por eso, hemos analizado los ojos de los embriones de ratón después de NC-específicas inactivación de señalización TGF β [11, 16]. Tejido-específico señal inactivación se logró por Cre-Wnt1 mediada por deleción del exón 4 del gen Tgfbr2 (figura 2c], que conduce a la pérdida de Tgfbr2 la expresión de la proteína en células madre de Carolina del Norte [11]. En tal Tgfbr2-ratones mutantes, tanto Tgfbr2 expresión (Figura 2d, f] y TGF-β induce la fosforilación de la molécula de señalización corriente abajo Smad2 (pSmad2; Figura 2e, g] se mantuvo indetectable en el periocular mesenchyme.

En E18, principales estructuras del segmento anterior del ojo, incluyendo la formación de cuerpo ciliar, el iris y la malla trabecular, todos fueron bien definidas en el control de los animales; ojo de desarrollo en ausencia de señalización TGF β en células derivadas NC-fue, por tanto, analizar en primer lugar en E18. Los más impresionante, los ojos de Tgfbr2-embriones mutantes fueron 26 ± 1% más pequeño que los ojos de control littermates (Figuras 3, 4]. Control de la córnea en los ojos fue debidamente estructurado en el epitelio y el endotelio que cubre un denso estroma, pero en ratones mutantes Tgfbr2 de la córnea carece de una capa endotelial normal y no se formó estroma (Figura 3b]. En los ratones control, estructuras de la córnea y el cristalino son claramente separados para formar la cámara anterior del ojo, en cambio, córnea y la lente de Tgfbr2-mutante ojos no separada, y no propiamente segmento anterior del ojo se construyó (Figura 3c]. Además, la formación normal de la malla trabecular y el cuerpo ciliar, se indica por una arruga en el primordio del iris en el control de los ojos, no se observó en los ojos Tgfbr2-mutante (Figura 3c]. Además, los ojos de las secciones E18-Tgfbr2 embriones mutantes puso de manifiesto una notable acumulación de las células entre el lente y la retina, mientras que buques de la hyaloid sistema vascular estuvieron presentes en el correspondiente control de las estructuras de los ojos (Figura 3d]. Por último, la retina de los ratones control fue claramente estructurado en una interior y una capa exterior de células, mientras que la retina de ratones mutantes-Tgfbr2 mostró patrón difuso (Figura 3e]. Así, Tgfbr2-embriones mutantes muestran microphthalmic ojos con anomalías del segmento anterior, similares a los observados en humanos Axenfeld-Rieger la anomalía, y los embriones también tuvo defectos del segmento posterior del ojo.

La persistencia de vítreo hiperplásico primario en Tgfbr2 de ratones mutantes

En ratones normales, el principal vítreo, incluyendo el sistema vascular hyaloid, persiste hasta el día postnatal (P) 30. Su regresión comienza postnatalmente P14 torno a la forma avascular y transparente vítreo secundaria [17]. En los pacientes con hiperplasia congénita persistente primaria vítreo, desarrollo anormal del vítreo primario se convierte en una membrana de fibro-vascular, formada detrás de la lente (retrolentally) [18]. Al igual que en humanos la persistencia de vítreo hiperplásico primario [19], irregular retrolental estructuras presentes en los ratones mutantes Tgfbr2-constaba de varios tipos de células diferentes (Figura 5 bis-e]. Entre ellas-como las células fibroblastos, melanocitos prospectivo expresando dopachrome tautomerase ARNm (Dct; también llamado Trp-2; Figura 5c], el músculo liso α-actina-positivas pericito (Figura 5b], y los buques de la hyaloid sistema vascular (Figura 5e] . Además, la tinción con un anticuerpo para Ki-67, una proteína expresada sólo en la división de células, puesto de manifiesto en la proliferación de células de tejidos retrolental (Figura 5d].

Efectos en la retina han sido reportados en pacientes con persistencia de vítreo hiperplásico primario [20]. Además, como las señales de instructivo de la lente promover patrón normal de la retina [21], las estructuras irregulares retrolental en ratones mutantes Tgfbr2-podría alterar la interacción normal entre la lente y la retina. Para probar si la retina en desarrollo Tgfbr2-ratones mutantes se vio afectado, retinas de embriones de diferentes edades immunohistochemically manchadas de factores que se sabe que son expresadas en diferentes etapas de desarrollo [22]. En E15, el interior de la retina de ratones control expresó enérgicamente Brn3A los factores de transcripción en células ganglionares de la retina y Pax6 en amacrine células de las capas de células ganglionares, en cambio, Tgfbr2-mutante menor el número de embriones de ambas Brn3A-y Pax6 - Positiva células de la retina (Figura 5 septies, g]. Además, en E15 el número de células TUNEL positivas en la tinción de procedimiento, que detecta las células apop-totic, fue mayor en la retina de los embriones mutantes Tgfbr2-que en los de los embriones control (13,3 ± 2,5 / 5 μ m de la sección (mutante) Frente a 5,6 ± 0,5 (control), p <0,01; no se muestra). En E18, expresión de Brn3A, Pax6 y neurofilaments define distintas capas de la retina en desarrollo en el control de los ojos (Figura 5h]. En Tgfbr2-ratones mutantes, sin embargo, el patrón de células en capas inquieta, y el espesor de la retina se incrementó en los mutantes (Figuras 4, 5 h]. Ojos de Tgfbr2-ratones mutantes, por lo tanto, son afectados por anomalías similares a la persistencia de vítreo hiperplásico primario y alterado por la retina del patrón.

Expresión de Foxc1 y Pitx2, que son a la vez implicados en Axenfeld-Rieger la anomalía, depende de TGF-β en Carolina del Norte derivados de células oculares

Segmento anterior del ojo-Tgfbr2 anomalías en ratones mutantes recordaban humanos Axenfeld-Rieger la anomalía (Figura 3]. In vivo suerte de cartografía reveló que la migración de TGF-β NC células dependientes de la córnea, el endotelio, y la malla trabecular no fue afectado en Tgfbr2 de ratones mutantes (Figura 6a]. Esto indica que las malformaciones oculares derivarse de alteración de la diferenciación más que de NC-defectos de la migración celular. Curiosamente, las anomalías observadas en los embriones mutantes-Tgfbr2 recapitular los aspectos de defectos oculares se encuentran en Foxc1 nulo o nulo Pitx2 ratones [2, 3]. Pérdida de TGF β de respuesta en las células de la mesenchyme periocular, por lo tanto, podría afectar a la expresión de factores de transcripción Pitx2 y Foxc1. Para probar esta hipótesis, se analizaron los ojos de Tgfbr2-mutante y control de los embriones en diferentes etapas de desarrollo de la presencia de Foxc1 y Pitx2. Se confirmó informes anteriores [2, 23] que los dos factores que se expresan en la periocular mesenchyme durante las primeras etapas del desarrollo (Figura 6b y datos no presentados); en el E15, sin embargo, se localizan Foxc1 al endotelio corneal y la formación de estructuras de la malla trabecular ( Figura 6d], y Pitx2 a la córnea (Figura 7]. Por el contrario, en los ojos de los embriones mutantes Tgfbr2-Foxc1 difícilmente detectables en la mesenchyme en E13.5 periocular y en la formación de la cámara de ángulo y en el endotelio corneal E15. Además, las células mutantes Tgfbr2-que no parece expresar Foxc1 posteriormente someterse E15 alrededor de la apoptosis, como se puso de manifiesto por la tinción de TUNEL (Figura 6e].

Pitx2 se expresó enérgicamente en la córnea en E15 en el control de los ojos, pero era indetectable en los ojos de Tgfbr2-embriones mutantes (Figura 7]. Curiosamente, algunos Tgfbr2-mutante células de la córnea expresó Dct en lugar de Pitx2, que apunta a la incorrecta destino a la adquisición o melanocitos misguidance durante la migración (Figura 7b]. En E18, la córnea de los embriones control consistió en delgadas keratocytes organizados en una estructura lamelar y embebidas en la matriz extracelular, que ofrece estabilidad y transparencia corneal (Figura 7c]. Los altos niveles de colágeno fueron detectables en la córnea con el control de los ratones, mientras que el colágeno tinción fue negativa en la malformación de la córnea-E18 Tgfbr2 ratones mutantes, y las células del estroma tuvo una anormal forma poligonal (Figura 7c, d]. En resumen, NC-derivados de células oculares que la falta de respuesta a TGF β dejar de expresar Foxc1 y Pitx2 y dejar de someterse correcta diferenciación de las células endoteliales en la córnea y la síntesis de colágeno-keratocytes de la córnea.

TGF β induce Foxc1 y Pitx2 expresión en fibroblastos y ex vivo en el ojo culturas

La ausencia de Foxc1 y Pitx2 expresión en el desarrollo de los ojos de ratones mutantes Tgfbr2-plantea la cuestión de si la señalización TGF β puede regular la expresión de Foxc1 y / o Pitx2. Para resolver este problema, fibroblastos de embriones de rata cultivadas fueron tratados con TGF β y analizados por mancha occidental de la presencia de Foxc1 y Pitx2 (Figura 8]. En ausencia de TGF β, las células mostró débil expresión de Foxc1, y Pitx2 expresión es indetectable. TGF β tratamiento, sin embargo, un fuerte incremento Foxc1 expresión y la expresión inducida Pitx2, concomitante con el aumento de los niveles de pSmad2 (Figura 8]. Además de los fibroblastos, postmigratory NC-derivados de las células de ratón periocular mesenchyme también fueron sensibles a TGF β, como se muestra en el corto plazo, los cultivos de tejidos de los ojos de los embriones E11 (Figura 8b): de nuevo, el tratamiento con TGF β dado lugar a elevados Foxc1 expresión. Además, Pitx2 expresión, que es indetectable en las muestras no tratadas, se indujo a la adición de TGF β. En resumen, el TGF β tratamiento upregulates tanto Foxc1 y Pitx2 expresión en una línea celular de fibroblastos de embriones y en cultivos de tejidos oculares. TGF β señalización, por lo tanto, no sólo es necesario para la expresión de factores de transcripción asociados a los trastornos de desarrollo del ojo, pero también es suficiente para regular su expresión.

Discusión

Este estudio demuestra que la inactivación de los dirigidos de señalización TGF β NC en células madre perturba el desarrollo adecuado de la NC-derivados estructuras en el ojo, dando lugar a malformaciones similares a los encontrados en humanos Axenfeld-Rieger y la anomalía persistente hiperplásico primario vítreo. La importancia de las señales inductivas de la lente para el correcto desarrollo del segmento anterior del ojo, así como para la retina del patrón ya ha sido propuesto [21, 24]. La mutación en los genes que causan lente anomalías oculares anormales y la posterior formación ha apoyado esta hipótesis [25, 26]. En este sentido, proponemos que una de las principales moléculas de señalización que participan en estos procesos es TGF β2, que es altamente expresado en el objetivo en las primeras etapas de desarrollo del ojo. Entre los receptores de señal tipos de células, NC-células tienen una función importante en el desarrollo ocular. De acuerdo con estudios anteriores en los modelos aviar, NC células de contribuir al desarrollo de segmento anterior del ojo [27]. Uso in vivo NC suerte de cartografía de las células, hemos ampliado estos resultados a un modelo de mamífero y demostrar que las células derivadas NC-contribuir a la formación de los ojos ya en la etapa de vesícula ojo. Más tarde, el endotelio corneal, estroma keratocytes y estructuras de la cámara de ángulo todos proceden de la NC. Además, encontramos una contribución de NC a la primaria vítreo, que normalmente contiene un transitorio de la red de buques que apoya el interior del ojo durante el desarrollo. Curiosamente, todos estos tejidos derivados NC-dejar de desarrollarse adecuadamente en ausencia de señalización TGF β, aunque NC-migración celular en la formación de los ojos no se ve afectado (Figura 9]. Además, se muestra que los factores de transcripción implicados en el desarrollo anterior del ojo son blanco de la señalización TGF β. Por lo tanto, nuestros datos indican que las anomalías oculares en ratones mutantes se deben a la falta de una respuesta post-migratorias de NC-derivados de las células oculares TGF β.

NC-células específicas TGF-β señal inactivación conduce a defectos del segmento posterior del ojo

El principal vítreo está situado detrás de la lente y contiene el sistema vascular debajo hyaloid NC-células. Normalmente, el principal vítreo retrae durante la maduración posnatal del ojo a través de la remodelación tisular de la apoptosis y la fagocitosis, generando así el avascular, transparente vítreo secundaria [17]. En los pacientes que sufren de persistente hiperplásico primario vítreo, una densa membrana celular persiste entre la lente y la retina. Este trastorno congénito suele ir acompañada de cataratas, glaucoma secundario, y un grado variable de microftalmia [18, 28]. Del mismo modo, el principal vítrea en los ojos de ratones mutantes Tgfbr2-aparece como una densa membrana celular, y mutante ojos son más pequeños que los de ratones control. Al igual que en humanos la persistencia de vítreo hiperplásico primario [19], la persistente retrolental masa de células en ratones mutantes Tgfbr2-contiene-al igual que las células fibroblastos, células pigmentadas, y buques de la hyaloid sistema vascular, y la multiplicación de las células también son consideradas.

Otros ratones mutantes se han notificado a tener un fenotipo similar al de la persistencia de vítreo hiperplásico primario, incluidos los mutantes de la Arf1, Bmp4, o de los genes p53 [29 - 31]. En estos modelos, normal postnatal regresión de la principal falla vítreo, lo que resulta en un grado variable de anomalías que recuerdan de la persistencia de vítreo hiperplásico primario. Del mismo modo, una densa masa de células en la parte posterior del ojo también se ha observado previamente en ratones Tgfb2 nula, pero esto no fue analizado más [12]. El tratamiento de ratones embarazadas con ácido retinoico, que se sabe para interferir con la señalización TGF β [32], induce anomalías similares a la persistencia de vítreo hiperplásico primario en la descendencia [33]. Por tanto, concluimos que en la señalización TGF β NC-células que constituyen el principal vítreo es importante para la morfogénesis de tejidos.

En el segmento posterior del ojo, la retina desarrollo también le inquieta a la ablación de las células Tgfbr2 en Carolina del Norte, separado de la generación de la persistencia de vítreo hiperplásico primario. En particular, se observó el aumento de la apoptosis en la retina E15 y derogó la retina del patrón, como se muestra por la histología y la capa de tejido-específico marcador expresión (Figura 5f-h]. Porque no hay NC contribución a la retina, este fenotipo se debe a la secundaria, no de células autónomas-efecto. La densa persistente primaria vítreo-Tgfbr2 en ratones mutantes posible que limitan el instructivo señales de la lente de la retina, pero ese putativo señales quedan aún por identificar.

TGF-β señal dependiente de factores de transcripción y la generación de Axenfeld-Rieger la anomalía

Además de los defectos que recuerdan de la persistencia de vítreo hiperplásico primario, todos los ratones mutantes Tgfbr2-tienen varios defectos en el desarrollo anterior del ojo. La cámara anterior del ojo no se da en el mutante porque la córnea y el cristalino no para separar. Además, la formación normal del cuerpo ciliar y de la cámara de ángulo con la malla trabecular requiere de señalización TGF β, ya que estas estructuras son defectuosos en los ratones mutantes. Las anomalías presentadas por Tgfbr2-ratones mutantes son característicos de los trastornos encontrados en los pacientes con Axenfeld-Rieger La anomalía [10]. En este trastorno, disgenesia del segmento anterior dificulta la regulación de la presión intraocular, lo que lleva con frecuencia a glaucoma de desarrollo.

Otros ratones mutantes también han sido implicados como modelos para los trastornos de desarrollo anterior del ojo. Los ratones homocigotos para una mutación de inactivar Pax6, candidato a la anomalía humana Pedro, la falta ojos [7]. Heterocigotos Pax6 + / - ratones tienen defectos en el segmento anterior del ojo, aunque menos severas que las que se encuentran en los ratones mutantes Tgfbr2-[34, 35]. La expresión de Pax6 en ojos de ratones mutantes Tgfbr2-no se ve afectada, sin embargo (datos no presentados), lo que sugiere que sus defectos no dependen de Pax6 modulación. En humanos Axenfeld-Rieger la anomalía, las mutaciones se han encontrado en los genes que codifican los factores de transcripción FOXC1 y PITX2 [1]. Supresión de cualquiera de Foxc1 o Pitx2 en ratones [2, 3] conduce a defectos en el segmento anterior del ojo, muy similares a las de los ratones mutantes Tgfbr2-descritos en el presente estudio. En el ojo, Foxc1 se expresa en la formación de estroma y endotelio corneal y, en etapas posteriores, en las estructuras de la malla trabecular posibles [2]. Curiosamente, estas estructuras Foxc1 expresar en una señal de TGF-β forma dependiente, y Tgfbr2-mutante prospectivo del endotelio corneal y malla trabecular someterse a la apoptosis de células que no se observa en el control de los ojos. Además, el TGF β upregulates Foxc1 expresión en fibroblastos cultivados y tejido ocular, de acuerdo con un informe anterior que se describe como un objetivo Foxc1 gen de TGF β en cáncer humano de las líneas celulares [36]. Por lo tanto, los datos sugieren que la lente derivados TGF-β señalización de los controles de la supervivencia y el desarrollo de la NC-derivados periocular mesenchyme que da lugar a endotelio corneal y la malla trabecular por Foxc1 expresión en la regulación de estas células (Figura 9].

Pitx2 se expresa predominantemente en NC-derivados del estroma corneal células que se convierten en la síntesis de colágeno-keratocytes. En Tgfbr2-ratones mutantes, sin embargo, las células del estroma corneal no expresan Pitx2 y, en consecuencia, dejar de convertirse en la síntesis de colágeno-keratocytes. Recientemente, mutaciones en el gen humano TGFBR2 se han notificado a causa del síndrome de Marfan, un trastorno también se asocia con defectos de la matriz extracelular de síntesis [37]. Por tanto, concluimos que la córnea NC-células deben tener TGF-β depende expresión de Pitx2 y diferenciación para convertirse en estroma keratocytes que producen la matriz de colágeno (Figura 9]. En apoyo de esta hipótesis, Pitx2 expresión está fuertemente inducidos en fibroblastos y tejido ocular a TGF β señal de activación.

En Axenfeld-Rieger La anomalía de los pacientes que tienen una enfermedad ligada a la mutación en el gen PITX2, anomalías oculares parecen estar acompañadas de otros defectos, incluidas las anomalías de los dientes, piel periumbilical redundante, y defectos cardíacos (todos juntos a que se refiere como el síndrome de Rieger) [1 ]. Aparte de su expresión en NC-derivado de las células que forman el ojo, Pitx2 se expresa en otros tejidos durante el desarrollo, incluyendo los dientes, ombligo, y el corazón [23]. En contraste con el patrón de expresión mesenquimales en el ojo, en otros órganos de la expresión de Pitx2 se limita a las estructuras que no son derivados NC-, pero estas estructuras y, sobre todo, el diente anlagen, están rodeadas de o están en estrecho contacto con NC - Células [14]. No obstante, Tgfbr2-embriones mutantes no muestran defectos en el diente anlagen o en el ombligo E18 (datos no presentados). Por lo tanto, dependen de Pitx2 anomalías en Tgfbr2-ratones mutantes parecen estar limitada a los ojos, aunque a causa de letalidad embrionaria que no hemos podido determinar si hay otros que dependen de Pitx2 defectos en una etapa de desarrollo más tarde de E19.

Nos informó recientemente de que la inactivación de TGF β señalización de las células madre en Carolina del Norte también da lugar a alteraciones cardíacas y defectos craneofaciales y la glándula paratiroides y timo de las anomalías que recuerda el síndrome de DiGeorge humanos [11]. Además, en función del contexto celular, el TGF-β no promueve destinos de células neuronales en células cultivadas de Carolina del Norte [38, 39]. Por lo tanto, junto con las conclusiones del presente estudio, hay buena evidencia de que el TGF β es un modulador clave de la no diferenciación neural de post-migratorias NC células durante el desarrollo de múltiples tejidos, incluyendo el ojo.

Conclusión

Hemos demostrado una gran contribución de la NC para el desarrollo del segmento anterior del ojo y de la primaria vítreo. Además, la debida diferenciación de NC-oculares derivados de células es dependiente de TGF-β (Figura 9]. En concreto, hemos demostrado que el TGF β está implicado en la restricción del crecimiento de los principales vítrea y, en consecuencia, que Tgfbr2-ratones mutantes sufren de persistente hiperplásico primario vítreo. En el segmento anterior del ojo, anomalías en ratones mutantes Tgfbr2-recuerdan humanos Axenfeld-Rieger la anomalía. Ocular expresión de Pitx2 y Foxc1, que cuando mutados pueden causar Axenfeld-Rieger la anomalía, es dependiente de TGF-β, lo que sugiere que ambos factores de transcripción participan en la mediación de señalización TGF β ocular en las células durante el desarrollo. Curiosamente, un informe de una familia que sufren de ambos Axenfeld-Rieger y la anomalía persistente hiperplásico primario vítreo sugirió un vínculo entre los genes de Axenfeld-Rieger y la anomalía persistente hiperplásico primario vítreo [40]. Por lo tanto, nuestros hallazgos pueden conducir a una mayor comprensión de la fisiopatología de Axenfeld-Rieger y la anomalía persistente hiperplásico primario vítreo.

Materiales y métodos
Generación de ratones mutantes Tgfbr2 -

La generación de ratones utilizados en este estudio se ha descrito antes [9, 11, 16, 41]. En pocas palabras, los sitios loxP para Cre-mediada por recombinación se introdujeron en el ratón Tgfbr2 locus de acompañamiento exón 4, que codifica el dominio de transmembrana y es una parte importante de la funcional de dominio intracelular de la proteína Tgfbr2. Ratones expresando la recombinasa Cre bajo el control del promotor y Wnt1 heterocigotos para esta Tgfbr2 'floxed' alelo fueron acoplado con ratones homocigotos para el alelo floxed. Inactivación de señalización TGF β-NC en células derivadas de embriones se logró heredar Wnt1-Cre y dos alelos Tgfbr2 floxed [11]. 100% de todos los embriones mutantes tenían el fenotipo se describe en este estudio, según la evaluación de los análisis de al menos tres embriones por cada etapa y condición de tinción. En cambio, carece de littermates la Wnt1-Cre transgén o con un tipo salvaje Tgfbr2 expresó Tgfbr2 alelo normal y no presentan ningún fenotipo manifiesta, por lo tanto, actúa como control de los animales. La genotipificación se realizó tal como se describe [11]. Todos los experimentos con animales se realizaron en los C57BL / 6 antecedentes, que nunca ha sido asociada con mutaciones genéticas que causan la degeneración retiniana.

Suerte de cartografía de NC-oculares derivados de células in vivo

El reportero Rosa26 (Rosa26R) ratón cepa expresa β-galactosidasa siguientes Cre mediada por recombinación [41]. Para definir la contribución de la NC oculares durante el desarrollo, Rosa26R ratones fueron cruzadas con Wnt1-Cre ratones transgénicos [9]. Por lo menos tres embriones por toda la etapa se tiñeron con la β-galactosidasa sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-gal; Sigma, Buchs, Suiza) y posteriormente se fija en el 4% paraformaldehído La noche a 4 ° C. Posteriormente, los embriones fueron incluidas en parafina, seccionadas a las 7 μ m, y para el montaje de dewaxed con DFX (Fluka, Buchs, Suiza). Algunas secciones se counterstained con eosina (Fluka).

Procedimientos de tinción

Embedding, seccionando y tinción procedimientos se realizaron tal y como se describe [11]. En pocas palabras, los ojos de por lo menos tres embriones por cada etapa se tiñeron con anticuerpos primarios a TGF β1, TGF β2, TGF y β3 (Biotecnología Inc Santa Cruz, Santa Cruz, EE.UU.), Tgfbr2 (Santa Cruz), pSmad2 (Cell Technology Inc Señalización, Beverly, EE.UU.), Ki-67 (Laboratorio de Visión (UK) Ltd, Newmarket, Reino Unido), Brn3A [42], Pax6 (Chemicon International Inc, Temecula, EE.UU.), neurofilamentos (Chemi-con), Foxc1 (Santa Cruz) , Pitx2 [23], y GFAP (Sigma). Para la visualización de la elite Kit ABC (Vector Laboratories Inc, Burlingame, EE.UU.) con Metal mayor DAB (Biotecnología Inc Pierce, Rockford, EE.UU.) o al sustrato AP kit I (Vector) se utilizó como sustratos. Hibridación in situ con digoxigenina-etiquetados Riboprobes a Dct se realizó tal como se describe [9, 15]. TUNEL ensayos se realizaron siguiendo las directrices del fabricante (Roche Diagnostics, Basel, Suiza). Norma protocolos fueron utilizados para el procesamiento de tejidos de semi-secciones delgadas y la posterior tinción de azul de toluidina [43]. La tinción de Van Gieson procedimiento fue utilizado para visualizar la formación de colágeno en la córnea.

Evaluación de crecimiento ocular

Por lo menos tres Tgfbr2-mutante y control de los embriones por etapa fueron incorporados y seccionadas. Mediados de órgano sagital secciones de los dos ojos, se midieron utilizando un microscopio Eclipse E600 (Nikon, Tokio, Japón) equipado con una cámara CCD (Kappa, Gleichen, Alemania) y el PicEd Cora versión de software 8.08 (JOMESA, Munich, Alemania).

Cultura experimentos

Fibroblastos de embriones de rata (rat2 línea celular; American Type Culture Collection, Mannassas, EE.UU.) se cultivaron en MEDM: F12 medio (Gibco / Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.) con 10% de suero fetal bovino (Sigma). Tras una incubación de 60 min en MEDM: F12 medio que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina a 37 ° C, las células fueron tratadas con TGF β (5 ng / ml) durante 90 min a 37 ° C como se describe [11]. A corto plazo, los experimentos de cultivo de tejidos, con los ojos de tejidos perioculares fueron retirados de nueve embriones en E11 por microdissection. Izquierda y derecha se agruparon los ojos por separado y mantenidos en MEDM: F12 medio que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina y antibióticos, con y sin TGF β (5 ng / ml), respectivamente, durante 6 horas a 37 ° C. Western blot de extractos de fibroblastos de embriones de rata y ratón extractos de tejido ocular se llevaron a cabo como se describe [44]. Anticuerpos primarios utilizados fueron contra Actina (Chemicon), pSmad2 (Señalización Celular), Foxc1 (Santa Cruz) y Pitx2 [23]. Cada experimento se realizó por lo menos tres veces.

Estadísticas

Los resultados se muestran como media ± error estándar de la media (SEM). Los gráficos y los análisis estadísticos utilizados Prisma 4,01 (GraphPad Software Inc, de San Diego, EE.UU.).

Adicional de los archivos de datos

Los siguientes archivos se encuentran disponibles: 1 archivo de datos adicionales, una cifra que muestra la ausencia de Wnt1 expresión durante la formación de los ojos, y archivo de datos adicionales 2, una cifra que muestra la expresión de TGF β isoformas durante la formación de los ojos.

Material suplementario
Adicional 1 archivo de datos
Una cifra que muestra la ausencia de
Wnt1
Expresión durante la formación del ojo
Adicional archivo de datos 2
Una cifra que muestra la expresión de TGF β isoformas durante la formación del ojo
Agradecimientos

Damos las gracias a Langsam B. y C. Imsand por su excelente asistencia técnica, C. Grimm, Mantei N., S. Neuhauss, Remé C., y A. Wenzel y valiosos consejos para los debates, y E. Turner, C. Mummery, A. McMahon, y P. Soriano para proporcionar anticuerpos o ratones. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional Suiza (SNF; al BM y LS), por el Centro Nacional de Competencia en Investigación "Plasticidad Neural y Reparación", por la Universidad de Zurich, y por el Consejo de Ciencia de Suecia (a TAH) .