Journal of Biology, 2006; 5(1): 3-3 (más artículos en esta revista)

Análisis global de los cromosomas X de dosis indemnización

BioMed Central
Vaijayanti Gupta (vaijayanti@strandls.com) [1], Michael Parisi (mp355r@nih.gov) [1], David Sturgill (davidsturgill@niddk.nih.gov) [1], Rachel Nuttall (rnuttall@qdots.com) [2], Michael Doctolero (mdoctolero@qdots.com) [2], Olga K Dudko (Dudko@mail.nih.gov) [3], James D Malley (jmalley@mail.nih.gov) [3], P Scott Eastman (seastman@qdots.com) [2], Brian Oliver (oliver@helix.nih.gov) [1]
[1] Laboratory of Cellular and Developmental Biology, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, 50 South Drive, Bethesda, MD 20892, USA
[2] Incyte Genomics, Palo Alto, CA 94304, USA
[3] Mathematical and Statistical Computing Laboratory, Division of Computational Bioscience, Center for Information Technology, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20982, USA
[4] Current address: Quantum Dot Corporation, Hayward, CA 94545, USA

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Resumen
Antecedentes

Drosophila melanogaster mujeres tienen dos cromosomas X, y dos conjuntos de autosome (XX; AA), mientras que los hombres tienen un solo cromosoma X, y dos conjuntos de autosome (X; AA). Drosophila masculino las células somáticas para compensar una sola copia del cromosoma X mediante el despliegue masculino Específicos letales (MSL) complejos que aumentan la transcripción del cromosoma X. Hombre células germinales falta MSL complejos, lo que indica que o bien germinal dosis cromosoma X-MSL-compensación es independiente, o que las células germinales no se llevará a cabo la compensación de dosis.

Resultados

Para investigar si la dosis de compensación se produce en las células germinales, directamente ensayadas cromosoma X-transcripciones utilizando microarrays de ADN y la expresión equivalente en mostrar XX; AA y X; AA germinal tejidos. En X; AA células germinales, de la sola expresión del cromosoma X, es de aproximadamente el doble que la de un solo autosome. Este mecanismo garantiza equilibrado cromosoma X-expresión entre los sexos y, lo más importante, se garantiza el equilibrio entre la expresión única del cromosoma X, y el conjunto autosome. Curiosamente, la inactivación del cromosoma X en las hembras de mamíferos reduce la eficacia de los cromosomas X de dosis y significa que las mujeres se enfrentan a los mismos transcripción cromosoma X-como la deficiencia de los hombres. Contrariamente a la mayoría de la dosis actual de los modelos de compensación, que también muestran una mayor expresión de cromosomas X en X; AA y XX; AA células somáticas de ratones y Caenorhabditis elegans.

Conclusión

Drosophila células germinales compensar el cromosoma X de dosis. Esto ocurre por el equilibrio y el cromosoma X-autosome expresión en X; células AA. El aumento de la expresión de cromosoma X en X; AA individuos parece ser conservadas filogenéticamente.

Antecedentes

En la mayoría de los organismos, el número de copias en cualquier lugar tiene poco efecto sobre la función adecuada organismal. Muy pocos son los genes deletéreos si está presente en una sola copia (haploinsufficiency) o son abiertamente deletéreos en tres copias. Después de más o menos ejemplares (aneuploidía), de una gran parte del genoma es, sin embargo, siempre incompatible con la viabilidad. Por ejemplo, más del 10% de los oocitos humanos son aneuploide, pero con algunas excepciones, ninguna de estas aneuploide ovocitos da lugar a descendencia viable [1]. El aneuploide genotipos más comunes en una amplia gama de especies implicar la supresión o la duplicación de un cromosoma o segmento de cromosoma. Las supresiones son las más perjudiciales.

En Drosophila melanogaster, un estudio sistemático de aneuploids con deleciones de los distintos segmentos de cromosomas indica que el hecho de tener sólo una única copia de un 1% del genoma reduce la viabilidad (y, a menudo, la fertilidad), y teniendo sólo una única copia del 3% o más del genoma Es letal [2]. A partir de las estimaciones actuales de genes contenido en Drosophila, el 3% representa unos 500 genes [3]. Por lo tanto, después de haber sólo una única copia de 500 genes o más generalmente resulta en el colapso de una importante parte de la red genética. Que las redes genéticas de hecho colapso debido a pequeñas diferencias en la expresión de unos pocos nodos conectados se pone de manifiesto en estudios de interacción genética. En la línea germinal femenina, por ejemplo, la dosis de los genes tumor ovárico (otu) firmemente modifica la esterilidad fenotipo de los heterocigotos para las moscas ovo D [4]. (Ovo El gen codifica un factor de transcripción que actúa en otu [5]]. Del mismo modo, en la línea germinal masculina, heterozigosidad de haywire o β-tubulina mutaciones son toleradas, pero heterozigosidad para ambos resultados en la espermatogénesis no [6].

Los cromosomas sexuales representan una extraordinaria excepción a la regla desequilibrio genético. Drosophila los machos tienen una copia del cromosoma X, por diploide conjunto de autosomes (X; AA) y las mujeres tienen dos (XX; AA) [7]. Como la Drosophila cromosoma X tiene un 20% del genoma [3], Drosophila varones muy superior a la habitual del 3% solo copia umbral de la viabilidad. Esto no es debido a un insuficiente de la dosis de los genes sensibles en el cromosoma X, ya que las mujeres son sensibles al cromosoma X-supresiones [2]. Por lo tanto, los hombres tienen un mecanismo especial (s) para compensar el cromosoma X de dosis (ver comentarios de [8, 9]]. Una extensa serie de experimentos sobre la autorradiografía politenizadas cromosomas gigantes de la glándula salival mostró que el cromosoma X en X; AA moscas se expresa en más o menos el doble del nivel que un cromosoma X en el XX; AA moscas. Hypertranscription del cromosoma X en varones cariotípica depende de un complejo de por lo menos cinco proteínas y dos ARN no codificante. Los genes que codifican las proteínas en el complejo se conocen como la de los hombres concretos letal (msl) loci (msl). Los hombres que carecen de alguna de las actividades msl mostrar reducido cromosoma X-transcripción y mueren como larvas. A nivel molecular, estos genes codificar una modificación de las histonas-MSL complejo, que acetylates histona 4 sobre la lisina 16 (H4 K16). La modificación está pensado para aliviar la acción represiva de las histonas y en consecuencia el aumento de la transcripción.

Curiosamente, la MSLs no funcionan en la línea germinal. Los cromosomas X de las células germinales masculinas no son decoradas con MSL complejos y no son hyperacetylated en H4 K16 [10]. Además, ni los genes que codifican el complejo MSL ni la obliga a los reguladores de la somáticas MSLs son necesarios para la viabilidad germinal [11, 12]. Hay falta de pruebas similares de compensación de dosis en la línea germinal de otros organismos [13, 14], llevando a la hipótesis de que las células germinales son tolerantes a la dosis. Alternativamente, la dosis de compensación en las células germinales pueden ser MSL-independiente. Germinal si el cromosoma X de Drosophila, de hecho o de cualquier organismo, la dosis es compensado es uno de los principales problemas no resueltos en el estudio de los cromosomas sexuales. Nuestra gama Drosophila resultados indican que las células germinales hacer, de hecho, la dosis compensar.

Igualmente enigmática es la dosificación de los sistemas de compensación en Caenorhabditis elegans y mamíferos, que se basan en la reducción de los cromosomas X de expresión en el XX; AA células [15, 16]. Esto se ve claramente en la mayoría de los mamíferos, donde uno de los cromosomas X en el XX; AA mujeres se inactiva. En C. Elegans, los dos cromosomas X en el XX; AA hermafroditas reducir la expresión. En ambos casos, la dosis de compensación modelo equilibrates cromosoma X-expresión entre los sexos, sino que también hace que los dos sexos funcionalmente aneuploide con respecto a la autosomes. Ambos hombres y mujeres (o hermafroditas) se funcionalmente X; AA. Se ha sugerido que este es counterintuitive, como dentro de cada diploide X; AA organismo, la expresión de los genes de un único cromosoma X debe ser equilibrada y equilibrada a la autosomes [17 - 20]. Por lo tanto, es más útil pensar en el cromosoma X de la dosis como un mecanismo de equilibrio del cromosoma X, y autosome expresión, y no sólo como un mecanismo de expresión de equilibrio entre los sexos. Este predice, por ejemplo, que en los mamíferos tanto el único cromosoma X de los hombres y el único cromosoma X activo en el sexo femenino son hypertranscribed [17, 18]. Si bien hay una abrumadora literatura apoyo a la inactivación cromosoma X-, ha habido muy poca evidencia experimental para apoyar hypertranscription de la activa cromosoma X [21]. Nuestro examen de los resultados en la gama C. Elegans y el ratón sugiere que tales cromosoma X-hypertranscription ocurre.

Resultados
Comparando XX; AA y X; AA expresión ratios

En la expresión de genes XX; AA y X; AA tejidos puede ser visualizada simplemente trazando la hibridación intensidades de las dos muestras en una de dispersión (Figura 1]. Es modesto sexo-sesgada expresión en el soma, pero el sexo-sesgada amplia expresión en las gónadas. A falta de la dosis de compensación, podríamos esperar para ver XX tejido expresión en el doble del nivel de X tejidos. No existe evidencia de que tal distribución de los cromosomas X de expresión ratios en ninguno de los dos tejidos. La mayor parte de la expresión X XX versus puntos de datos recubre la mayor parte de la AA AA expresión frente a los puntos de datos en ambos tejidos. Esto indica que el único de los cromosomas X de X; AA soma gónadas y se expresan en el mismo nivel que los dos cromosomas X en el XX; AA soma y las gónadas. Esto sugiere que la dosis somáticas indemnización es generalizada en tejidos adultos. Más importante aún, este proporciona la primera evidencia sólida de que el cromosoma X de la dosis de compensación se produce en la línea germinal. Sin embargo, es mucho más difícil para buscar sutiles efectos de la dosis génica en la línea germinal debido a la extensa y dramática sexo sesgo de expresión observadas entre ovarios y testículos: el sesgo de sexo afecta a alrededor del 31% del genoma y los resultados en un mayor Diez veces más diferencia en el nivel de expresión de algunos genes.

Para evitar la distorsión por sexo sesgo de expresión, que incluyen el sexo de los tejidos transformado en nuestros experimentos (ver Materiales y métodos). Estos tejidos se produce por la manipulación genética de la determinación del sexo jerarquía (Figura 2, y ver [7, 22] para comentarios). Utilizamos gónada muestras de ensayo germinal a la compensación de dosis. Aunque tanto de tipo salvaje y transformado gónadas se componen de tejido germinal y somática, citoplasma germinal representa la mayor parte de los ARNm [4, 11, 23]. Confirmamos que el germinal contribuye a la mayoría de las transcripciones en las hibridaciones, como no fuimos capaces de extraer suficiente ARN de similar número de vacíos disecados gónadas [24]. Más importante aún, hemos comprobado directamente a la composición de la muestra por las gónadas en busca de grupos de genes con germinal sesgo de expresión y de los genes conocidos con germinal específica o germinal de los patrones de expresión sesgada (Figura 3]. Estas muestras nos permiten aislar el efecto de los cromosomas X de dosis de confusión de los efectos de dimorfismo sexual.

Ambulantes en el XX; AA versus X; AA datos debido a la sesgada sexo-expresión puede reducirse de manera muy eficaz por sexo transformación (Figura 4]. Al comparar la expresión de XX; AA y X; AA soma que se corresponde sexual (por ejemplo, mujeres versus hombres transformados en mujeres, y los hombres frente a las mujeres transformarse en hombres), se observa muy poca magnitud alta expresión diferencial. Aún más sorprendente es la similitud en los perfiles de expresión de transformarse teniendo ovarios no diferenciar las células germinales. La gran magnitud de las diferencias observadas entre la expresión de tipo salvaje XX; AA ovarios y X; AA testículos (Figura 1] son casi abolido cuando comparación XX; AA y X; AA transformado ovarios (Figura 4]. El examen visual de las consecuencias de la dispersión son claras, como la hibridación de elementos correspondientes a la gama X-cromosoma autosómico y genes muestran ratios de expresión perfectamente centrado en la unidad. Se confirmó la veracidad de este análisis exploratorio utilizando múltiples instrumentos estadísticos (véase la sección Transcriptional respuesta a la alteración genética autosómica dosis, más abajo). Esto apoya firmemente la idea de que el cromosoma X de la dosis de compensación se produce en la línea germinal.

Es posible que formalmente son los cromosomas X en dosis compensadas XX; AA versus X; AA transformado células germinales, pero no en la de tipo salvaje oogenic espermatogénica y de las células germinales. Aunque la mayoría de los puntos de datos se encuentran a lo largo de la diagonal en la dispersión de la comparación de las intensidades de hibridación XX; AA ovarios y X; AA testículos, las líneas de regresión de cromosoma X autosome y perfiles de expresión son diferencialmente desviado (Figura 5]. Esto es causado por la gran cantidad de genes que muestran los hombres sobre la expresión sesgada autosomes y la menor densidad de los genes con el hombre sesgada expresión en el cromosoma X [25]. Sin embargo, hay muchos genes con 'limpieza' funciones tanto en el cromosoma X, y la autosomes que se espera que se expresó igualmente en ambos oogenic espermatogénica y de las células germinales.

Para determinar cómo los genes con función de limpieza responder a la dosis en la línea germinal, hemos examinado con más detalle los niveles de expresión de genes que codifican citoplásmica nuclear o mitocondrial ribosomal subunidades [26]. El cromosoma X, autosómica y genes muestran sorprendentemente similares distribuciones (p> 0,1 por análisis de regresión de las pendientes y las intersecciones), a pesar de una doble diferencia en el cromosoma X de dosis (Figura 5b]. También se identificó un conjunto de facto de los genes mediante la investigación de la casa matriz que muestra elementos de la reducción de la hibridación y la diferencia de alta intensidad de hibridación en todos nuestros experimentos (Figura 5c]. A falta de la dosis de compensación, podríamos esperar un déficit de los genes del cromosoma X, en este subgrupo, ya que muestran una mayor variación debido a la diferencia de dosis. No se encontraron déficit del cromosoma X-codifican genes que muestran bajos diferencia expresión. Ambos análisis indican que por lo menos algunos genes de los cromosomas X de dosis son compensados en la naturaleza de tipo germinal.

Transcripcional respuesta a la alteración genética autosómica dosis

Para entender la precisión de los cromosomas X de la dosis de compensación, en primer lugar hay que entender la respuesta general del sistema biológico de la dosis de genes alterados. ¿Qué debemos esperar si no hay un cromosoma X de dosis indemnización? A diferencia de los genes de dos tipos de dosis es poco probable que siempre resulta en una doble diferencia en el estado de los niveles de transcripción, ya que muchos genes están regulados por elegante mecanismos de retroalimentación que amortiguar el efecto de la dosis génica. Del mismo modo, tenemos que demostrar que toda la tubería de manipulación de los datos nos permite ver las diferencias de expresión de genes asociados con la dosis de genes alterados.

Para determinar si las diferencias en la dosis genética detectable en consecuencia las diferencias en la expresión de genes, que hemos medido directamente la expresión de genes de los cambios derivados de la dosis de genes alterados debido a la deficiencia de (supresión) y la duplicación de un segmento de la autosómica genoma. La duplicación que hemos utilizado se superpone a la supresión región, sino que abarca más genes. Las moscas heterocigotos para la duplicación Dp (2:2) Cam3 / + (Dp / +) tienen tres copias de alrededor de 330 genes, mientras que las moscas heterocigotos para la supresión Df (2L) JH / + (Df / +) son hemicigotos para un subconjunto De alrededor de 70 de esos genes duplicados [27]. Directamente por la comparación de la expresión de genes en moscas que incluye estas aberraciones, que analizarse las consecuencias de la expresión génica de 1 veces, 1,5 veces, y 3 veces diferencias en la dosis de genes a lo largo de cromosoma brazo 2L.

Estamos aislados de dos ARNm independiente preparativos de las hembras, los machos y los ovarios y realizó la comparación de seis hibridaciones Dp / Df + y / + muestras directamente unos contra otros sobre microarrays (Figura 6]. El efecto de la alteración genética autosómica dosis es evidente en la media móvil parcelas ratios de expresión contra la posición a lo largo de los cromosomas brazo (Figura 6]. Hemos observado diferentes alteraciones de la expresión génica-ratios entre Dp / Df + y / + moscas en el citológicamente aneuploide regiones definidas en los hombres, las mujeres y los ovarios. Pasando de izquierda a derecha a lo largo de esta trama, los ratios son esencialmente 1.0 (indicando expresión equivalente) en la región, que es de dos copias en ambos Dp / Df + y / + moscas, hasta llegar a la región que es de tres-en copia Dp / + Moscas y dos copia en Df / + moscas. En esta posición hay una fuerte ruptura de la media móvil Dp-sesgado hacia la expresión. La misma ruptura de la media móvil se produce en la transición a la región que es de tres-en copia Dp / + moscas y un solo ejemplar en el Df / + moscas. Alterada veces ratios entre Dp / moscas y Df + / + moscas vuelven a su nivel proximal como la interrupción de las aberraciones se cruzan.

Las diferencias en la expresión de genes de los coeficientes correspondientes a 1 -, de 1,5 y 3 veces la dosis cambios en el cromosoma 2L son altamente significativos (p <<10 -4 por ANOVA seguido de Tukey HSD, Hodges-Lehmann, y Kolmogorov-Smirnov Pruebas; ver Materiales y métodos). Ningún otro similar grandes bloques de genes en otras partes del genoma muestran significativamente mayor expresión en Dp / + moscas que en el Df / + moscas. Hubo, sin embargo, menor copia de dos regiones que mostraron tasas de imitación de la expresión de 1,5 a 3 veces la dosis de genes efecto o el efecto inverso. Estas regiones podrían ser debido a la no reconocida o aberraciones podrían transcripcional efectos secundarios.

También utilizan estos 1 -, de 1,5 y 3 veces la dosis de cambio de datos para ajustar nuestro manejo de datos. El terreno sobre el método de corrección de fondo dio el mayor poder de discriminación (véase Materiales y métodos adicionales y archivo de datos 1), y se utiliza para la distribución de todos los análisis posteriores. Este método maximiza nuestra capacidad para detectar la falta de compensación de dosis.

La característica más destacada de estos análisis es que los cambios de expresión de genes alterados debido a los cambios en la dosis autosomes son fácilmente detectables. Esto nos proporciona un indicador para el análisis de los similares cromosoma X-gen-ratios de expresión al comparar XX; AA con X; AA tejidos. Se realizó 48 hibridaciones utilizando 96 muestras biológicas (ver Materiales y métodos). Coincidentes XX; AA y X; AA tejidos se compararon en directo hibridaciones y se vincularon a través del diseño de bucle a otros XX; AA y X; AA muestras hibridizada en otras matrices. Esto permitió que un número aún mayor de las comparaciones. En todas las comparaciones a nivel mundial de los XX; AA con X; AA expresión en el soma (72 comparaciones), una dosis de 1,5 veces la diferencia en un autosome dio una mayor diferencia en los perfiles de expresión génica-que hizo una doble diferencia en el cromosoma X - Dosis (p <<10 -4). Lo mismo se encontró en la totalidad de las comparaciones a nivel mundial de nuestro XX; a AA X; AA expresión transformado en gónadas (119 comparaciones). Estos datos demuestran concluyentemente que las células germinales llevar a cabo la compensación de dosis.

Mecanismo de dosis en el cromosoma X de la indemnización

Equilibrio entre el cromosoma X-expresión entre XX; AA y X; AA células germinales en Drosophila es probable que exigir a cada una de las hypertranscription X en el sexo masculino (como ocurre en el soma) o hypotranscription del cromosoma X en las mujeres en comparación con una referencia autosómica. La determinación de que el mecanismo de compensación de dosis funciona en la línea germinal requiere de la medición de los niveles de expresión absoluta de los genes del cromosoma X, en relación con los de los genes autosómicos. La expresión de genes varía en órdenes de magnitud, pero en un gran representante de la población de los genes en un cromosoma brazo esperamos que los representados por dos ejemplares tendrán mayor abundancia transcripción de los representados por un solo ejemplar.

Como una rigurosa prueba de viabilidad, se examinaron las intensidades de hibridación en el Df / + región de autosome 2L. En todo los machos adultos, hembras adultas y ovarios, el promedio de las intensidades de hibridación fueron significativamente inferiores en el 70 o así en el único de los genes-copia Df segmento que en la copia de dos segmentos en otros lugares del genoma (Figura 7]. Hypertranscribed cromosomas X están en relación con el soma autosomes. Como era de esperar, las transcripciones del único cromosoma X en la hibridación de soma para arrays como intensamente como los de la copia de dos autosomes. Se observó la misma tendencia en la X; AA germinal. Transcripción del cromosoma X de X; AA transformado ovarios muestran una intensidad tan elevada como la hibridación de los de la copia de dos autosomes. De hecho, el cromosoma X parece ser algo relativo a autosomes sobreexpresa en el X; AA transformado ovarios, en cada uno de los siete replicar experimentos. Incluso las transcripciones del único cromosoma X en X; AA testículo se observó mayor intensidad de la hibridación de los genes de una sola copia de cualquier Df + muestra (p <<10 -4). Estos resultados indican que el cromosoma X de la dosis de compensación en la Drosophila y soma germinal es el resultado de más altos por copia X-acumulación en el cromosoma X transcripción; células AA. Curiosamente, el cromosoma X muestra leve, pero altamente significativo, en todos los sobreexpresión XX; AA muestras. Esto puede ser debido a la inherente hypertranscription de genes de los cromosomas X-tanto en hombres como mujeres.

Escapar de la dosis de compensación

Aunque la expresión global de genes de los cromosomas X-que parece ser muy bien compensada dosis, puede haber pequeñas regiones o genes dispersos que escapar de la dosis de compensación. Para buscar bloques del cromosoma X que no se someten a la dosis de compensación, ya sea en el soma o de la línea germinal, que trazan media móvil de expresión ratios a lo largo de la longitud de la X o el tamaño similar autosome brazo 2L (Figura 8]. En el caso del soma, de las parcelas (XX; AA) / (X; AA) reveló expresión ratios sólo ruido expresión ratios que oscilan alrededor de la unidad. X-cromosoma expresión ratios para gónadas fueron ligeramente sesgado hacia la expresión sesgada XX-, pero hemos detectado ningún abierta de la región del cromosoma X, expresado como un Df / + región. Estos resultados indican que no bloques contiguos de los genes en el cromosoma X escapar de la dosis de compensación en el soma o germinal.

Dispersos a lo largo de los genes del cromosoma X, que no logran convertirse en dosis compensadas ya sea en el soma o de la línea germinal son más difíciles de detectar porque hay cromosoma X, autosómica y los genes que son expresados diferencialmente entre XX; AA y X; AA tejidos incluso después de la transformación de sexo Los tejidos. Si autosómica algunos genes se expresan en niveles más altos en el XX; AA moscas que en X; AA moscas, entonces algunos genes de los cromosomas X-que se espera que hagan lo mismo. Para probar de genes aislados que se han librado de la dosis de compensación, hemos extraído todos los genes que fueron al menos 1,5 veces sobreexpresa en cualquiera XX; AA o X; AA moscas, normalizado a los contenidos de genes por el brazo, y espera por la salida del normal Distribución (Figura 8]. Si hay un número significativo de genes en el cromosoma X que escapan a la dosis de compensación, no debe expresión más atípicos a la cartografía del cromosoma X, de manera similar en relación con los segmentos de tamaño autosómica. Además, los valores atípicos desde el cromosoma X debe mostrar XX-sesgada expresión escapar de la dosis si la indemnización. En el sexo-transformado soma, aunque existen genes de los cromosomas X-que siempre muestran mayor expresión en el XX; AA de los X; AA soma, se observó que no existen importantes de enriquecimiento (Figura 8], de dichos genes. Sobre el doble de genes que el cromosoma X-como era de esperar, sin embargo, muestran mayor expresión en el XX; AA transformado germinal (p <10 -3, por la prueba de χ 2). En valor nominal, se puede calcular que aproximadamente el 2% de los genes de los cromosomas X de escapar de la dosis de compensación en la línea germinal. En el soma, el sexo y la determinación de la dosis de compensación están vinculados vías, sin embargo, y esto podría ser cierto en el caso de la línea germinal [7, 22]. No podemos descartar la posibilidad de que la reducción de X-expresión en el cromosoma X; AA, hs-tra / + XX relativo a los ovarios; AA otu o Sxl ovarios se debe a un ligero defecto de la indemnización germinal dosis concurrente con una transformación germinal sexo.

Dosis de mecanismos de compensación en C. Elegans y el ratón

Aunque el cromosoma X de dosis indemnización equilibrates cromosoma X-expresión entre los sexos, la X; AA individuos son los que se enfrentan a un desequilibrio cariotipo. Esto hace que el aumento de X-expresión en el cromosoma X; AA masculino Drosophila lógico mecanismo de compensación de dosis. En contraste, el cromosoma X-transcripción se reduce de los dos cromosomas X en C. Elegans hermafroditas, y un cromosoma X se inactiva en las hembras de mamíferos [15, 16]. En ambos casos, esta dosis indemnización equilibrates cromosoma X-expresión entre los sexos, pero también hace que los dos sexos funcionalmente aneuploide con respecto a la autosomes. Este dilema se resuelve si los cromosomas X son generalmente hypertranscribed y si el cromosoma X de la inactivación o en hypotranscription XX; AA hembras o hermafroditas es un mecanismo para prevenir la sobreexpresión del cromosoma X. De lo contrario, hypertranscription del cromosoma X en el XX; AA individuos se traduciría en tetraploidy funcional.

Con el fin de investigar el nivel de actividad del cromosoma X en estos animales, reanalizamos serie de datos previamente publicados sobre la expresión de genes en el soma de hermafrodita masculino y C. Elegans [28] y hombres y mujeres de ratones [29]. Estos estudios informaron sobre-expresión de genes diferencias entre los sexos en lugar de la compensación de dosis. De dispersión de estos datos hay poca diferencia entre la expresión del cromosoma X en el XX; AA versus X; AA germlineless animales o tejidos somáticos (Figura 9]. Teniendo en cuenta que ambas especies han somáticas dosis de mecanismos de compensación que equilibre expresión entre los sexos, esto es de sorprender.

Para determinar si por copia de la transcripción del cromosoma X, se reduce en el XX; AA somas, que mide la intensidad media de la hibridación de la X, y todas en tanto autosomes X; AA y XX; AA animales (Figura 9]. Transcripción del único cromosoma X en X: AA C. Elegans masculino soma hibridación, así como los de la copia de dos autosomes. De hecho, los dos cromosomas X de X; AA y XX; AA C. Elegans parecen ser sobreexpresa en relación con autosomes (p <<10 -4). Del mismo modo, el cromosoma X-transcripciones de X; AA y XX; AA ratón soma (media de los hipotálamo, hígado y riñón) son detectados dentro de la gama de los de la autosomes. Muchos tejidos de ratón han sido examinados, y encontramos evidencia de elevación de los cromosomas X de expresión en todos los casos (datos no presentados). Un estudio concurrente con éste es el que ha catalogado de mamíferos ampliamente cromosoma X-dosis indemnización, y confirma nuestra observación de que el único cromosoma X en los hombres y el único cromosoma X activo en el sexo femenino se compensan [30]. Estos hallazgos sugieren que el único de los cromosomas X de X; AA C. Elegans y ratones se expresan en niveles comparables a dos autosomes, como hemos observado en Drosophila. Quizás este es un fenómeno universal.

Discusión

Politenizadas glándula salival cromosomas han facilitado en gran medida el análisis de la compensación de dosis en Drosophila [8], pero el análisis global de la indemnización en la dosificación otros tejidos no ha sido concluyente. Un reciente transcriptasa inversa (RT)-PCR estudio mostró una amplia gama de estados de la indemnización de los cromosomas X de los genes [31]. Sexo sesgo de expresión potencialmente distorsiona tales dosis de análisis de la indemnización, sin embargo. Hay un gran sesgo de sexo en Drosophila expresión [24, 32 - 34] y, además, estos genes no están distribuidas por igual entre el cromosoma X autosomes y [25, 35]. Los estudios dirigidos a subgrupos de genes han revelado complejas relaciones entre el cromosoma X autosome y expresión. Sin embargo, es difícil de interpretar una sutil diferencia en el cromosoma X-expresión entre XX; AA y X; AA si los individuos efectos de similar magnitud se observan para autosómica genes [36]. Análisis global de la transcripción en la no politenizadas tejidos podría ayudar a resolver la naturaleza de los cromosomas X de la dosis de estudio de la indemnización en los tejidos que conforman el grueso de la marcha.

Microarray análisis es ideal para el estudio de la compensación de dosis. Nuestros resultados sugieren que muy apretado cromosoma X-dosis indemnización se produce en una amplia gama de tejidos adultos. Lo que es más importante, que también proporcionan la primera evidencia de la compensación de dosis germinal en cualquier organismo. El mecanismo de compensación tanto en la línea germinal y soma es el equilibrio de la expresión del cromosoma X, autosómica con expresión. Esto es probable que sea debido a una mayor expresión del único cromosoma X en X; AA, si bien disminuyó la expresión de todos los autosomes también podría asegurar que el cromosoma X de expresión es equilibrada con la autosomes [37].

MSL-independiente de la dosis germinal indemnización

Germinal cromosoma X-dosificación de compensación ha sido una caja de negro desde hace décadas [22]. Como el conocido somáticas dosis de mecanismos de compensación en los principales organismos modelo genético claramente no funcionan en la línea germinal, la idea ha surgido gradualmente de que las células germinales son tolerantes a la dosis. Ello se debe no a la prueba de la ausencia, pero a falta de pruebas. Aunque nuestros resultados muestran que la dosis de compensación en la línea germinal y soma son temas similares, los mecanismos en la línea germinal deben ser distintos.

El MSL complejos necesarios para la compensación de dosis en el soma son prescindibles en la línea germinal [10, 12]. Esto puede parecer no parsimoniosa, pero germinal y somática de expresión génica también parecen ser distintos. Los hombres y mujeres germinal expresar los diferentes tipos de maquinaria basal de transcripción, como los hombres germinal específica TATA-box vinculante factores asociados (TAF), que puede exigir una diferente estructura de la cromatina [38, 39], y germinal-Restringido factores se unen Restringido el núcleo germinal de promotor de la ovo de genes [40]. Además, a pesar de la dosis de compensación somática es altamente conservadas, las proteínas de mediación dosis indemnización no. Por ejemplo, en algunas otras especies de moscas de la MSL complejos asociados con todos los cromosomas, y no sólo el cromosoma X [41 - 43], lo que sugiere que el complejo no juega ningún papel en la dosis de compensación en esos organismos. En la levadura, así que carecen de cromosomas sexuales diferenciados, uno de los principales componentes del complejo MSL es necesaria para la viabilidad [44]. Estas observaciones indican que los complejos de MSL juego marcadamente diferentes funciones en diferentes especies. Dadas las diferencias en la expresión de genes entre la línea germinal y el soma, que quizá no resulte sorprendente que diferentes proteínas podrían participar en Drosophila germinal dosis indemnización.

Tampoco está claro si la MSL complejo para todas las cuentas de compensación de dosis somáticas. Por ejemplo, XX; AA moscas que carecen de Sexo letales (Sxl) de proteínas en el soma morir, presumiblemente debido a la falta de reprimir MSL formación de los complejos [45]. Pero las mutaciones en los genes de codificación MSL-dejar de rescate de la letalidad XX; AA Sxl sin moscas, lo que sugiere que reprime Sxl dosis adicionales de las funciones de la indemnización [46]. Del mismo modo, en politenizadas glándulas salivales, grandes bloques de la cromosoma X, no asociar con MSL complejos [47]. No hemos encontrado pruebas para apoyar amplias escapar de la dosis en el cromosoma X de la indemnización en los tejidos somáticos. Estos resultados son compatibles con cualquiera de despliegue selectivo de los genes activos en MSLs [47] MSL-independiente o compensación de dosis en un subconjunto de los genes.

Las mutaciones en los genes que regulan la dosificación germinal indemnización se espera que muestren cariotipo fenotipos específicos. Curiosamente, existen al menos dos genes que parecen ser necesarios para la viabilidad del XX; AA, pero no X; AA células germinales; ovo y todavía de pie (todavía) [48, 49]. Negativas y positivas de la proteína Ovo isoformas actuar en el sitio de inicio de la transcripción, al menos, algunos promotores [5, 40, 50] y decora Stil proteína activa cuando la cromatina sobreexpresa en el soma [49]. Si una o ambas de estas proteínas sirven para bloquear el upregulation del cromosoma X que se produce normalmente en la línea germinal masculina. Esto podría ser análoga a la situación en la Drosophila soma, en donde la dosis la indemnización se reprime activamente en el XX; AA mujeres [7]. También hay una serie de genes que se requieren para la viabilidad de las células germinales masculinas [51]. Algunos de estos genes codifican funciones de compensación de dosis. Si tales dosis de los genes existen compensaciones, que podrían codificar la modificación de la cromatina de los complejos, como en el soma Drosophila. Dado que nuestros datos muestran que el estado de las transcripciones del cromosoma X son compensados, sin embargo, hay una serie de post-transcripcional mecanismos, tales como la estabilidad del mRNA preferencial, que podría mediar la dosis germinal indemnización.

X-cromosoma dosis de mecanismos de compensación pudieran surgir a raíz de la dosis los mecanismos de control que están activos en muchos o todos los genes. De hecho, hemos detectado en nuestra memoria intermedia transcripcional control de los experimentos sobre los efectos de la dosis de genes autosome. Hemos encontrado que la magnitud del efecto transcripcional era menos de esperar de un simple cálculo de la dosis génica. Este efecto inverso sobre la transcripción de genes en relación con la dosis ha sido conocido por décadas [52 - 54], y recientemente se ha observado en los perfiles de expresión y RT-PCR estudios [31, 55 - 57]. Parece probable que muchos genes tienen un autónomo sistema de compensación de la dosis, aunque imperfecta. El MSL componentes han generales actividad transcripcional en levaduras y parecen haber sido co-optado en Drosophila para regular la dosis somáticas indemnización. Germinal dosis indemnización podría ser mediada por otras co-optado cis-o trans-actuando componentes que sirven para la expresión de genes de amortiguación.

Escapar de la dosis de compensación

Hay cromosoma X-genes, como LSP1-α, que escapar de la dosis de compensación en Drosophila [58], pero no se sabe cómo esto podría ser común. Del mismo modo, en los mamíferos, muchos genes de los cromosomas X en las mujeres escapar de inactivación (escapar de la dosis de compensación en X; AA hombres no ha sido examinado). En teoría, esto es de esperar, ya que no todos los genes tienen que ser compensados de dosis en el curso de la evolución cromosoma X [59]. Aunque podemos analizar con confianza poblaciones de genes de los cromosomas X, es muy difícil determinar si un determinado gen se escapa de compensación de dosis. De hecho, en ausencia de una detallada, gen por gen mecanicista estudio, podría ser imposible. Hay muchos autosómica genes que son más altamente expresado en el XX; AA de los X; AA tejidos, incluso después de controlar por sesgo de expresión sexual. Estas diferencias de expresión de genes-están claramente que no están directamente relacionadas con el cromosoma X de dosis indemnización. Muchos de los cromosomas X de genes expresados en niveles más altos en el XX; AA de los X; AA tejidos será igualmente no guarda relación con la dosis indemnización per se. En los estudios de escapar de la dosis de compensación en Drosophila, C. Elegans, o sexo de los mamíferos, donde el sesgo es incontrolada, los informes de los genes escapar de la dosis indemnización bien podría ser falsa.

A nivel mundial, no hay pruebas para escapar de la dosis de compensación en la Drosophila soma. En la línea germinal, sin embargo, hay más claramente con genes XX-sesgada expresión de lo esperado. Existen varias interpretaciones de este hallazgo. Es posible que escapar de la dosis de compensación es más común en la línea germinal (alrededor del 2% de los genes). Alternativamente, pueden existir pequeños indemnización inferior en la línea germinal. Los cromosomas X en ambos XX; AA y X; AA gónadas parecen ser sobreexpresa en relación con autosomes, sin embargo. Por lo tanto, es posible que el ligero exceso de los XX-sesgada expresión se debe a la ausencia de una plena amortiguar el cromosoma X-hypertranscription en XX; AA mujeres.

Hacia un modelo unificado de compensación de dosis

Las mujeres tienen dos cromosomas X y los hombres tienen. Por lo tanto, es natural pensar en el problema de la dosis de compensación como mecanismo para equilibrar el cromosoma X de expresión entre los sexos. Pero cambiar la dosis de grandes segmentos del genoma es un problema para la persona con la condición aneuploide - los machos en el caso de los principales sistemas modelo metazoos. Sorprendentemente, un cromosoma X se inactiva en femenino mamíferos. Igualmente notable, en ambos cromosomas X C. Downregulated elegans son hermafroditas. ¿Por qué debería cromosoma X, la dosis se logrará una indemnización en estos organismos por desequilibrar la expresión de genes en ambos sexos? Nuestro análisis de la validez de los datos existentes sugieren que la variedad tanto de hombres cromosoma X, y la única activa femenina cromosoma X son hypertranscribed o en el acumulado de los mamíferos. En el curso de nuestro estudio, algunos de los mismos datos se ha reanalizamos independiente, y los autores del estudio otros han llegado a conclusiones similares [30]. Estos datos apoyan una presencia más unificada de la teoría de la compensación de dosis [17 - 20], por la que el cromosoma X de expresión se incrementa en todas las X; AA células (Figura 10]. Puede haber contrarrestar fuerzas para aumentar X-expresión en el cromosoma X; AA hombres y para mantener el cromosoma X de expresión bajo control en la XX; AA mujeres. De hecho, nuestro análisis sugiere que en Drosophila y C. Elegans, el de los cromosomas X XX; AA y X; AA tejidos se sobreexpresa en relación con autosomes. Esa superación se espera que sea más perjudicial para XX; AA individuos y podría haber dado lugar a la inactivación de cromosomas X en el linaje de mamíferos. Curiosamente, la cromatina represiva asociada a la proteína HP1 se enriquece en el cromosoma X en Drosophila los hombres [60]. Quizás esta es la modulación de la sobrecompensación.

Conclusión

Dosis indemnización ha sido objeto de estudio por un casi un siglo. Examen de la estructura de la cromatina, en lugar de ensayo directo de la transcripción de genes, domina la reciente literatura de compensación de dosis. Microarray análisis nos permite el acceso directo a la acumulación de la transcripción de todos los genes de los cromosomas-X. La Drosophila serie de datos proporcionan la primera demostración en cualquier organismo que las células germinales compensar la dosis. Estos datos también añadir un giro significativo a nuestra comprensión de la compensación de dosis en mamíferos y C. Elegans. Microarray análisis será un instrumento vital para directamente analizaron esta intrigante de todo el cromosoma regulación de la expresión génica.

Materiales y métodos
Drosophila cepas

Las moscas fueron cultivadas a 25 ° C, con una edad media de 5-6 días, disecados, flash-congelados, y se preparó para la extracción de RNA, tal como se describe anteriormente [24] (véase el Flybase compendio de información sobre los genes, alelos, y fenotipos de descripciones adicionales [ 27]]. Las moscas utilizadas para poner a prueba el efecto de las aberraciones cromosómicas fueron Dp (2, 2) Cam3 / + y Df (2L) JH / + que fueron generados a partir de la cruza de las poblaciones y 1 w 67c 67c para eliminar el equilibrador de los cromosomas. Además de utilizar XX; AA mujeres (y 1 w 67c 67c), que transformó XX; AA moscas en hombres usando nula mutaciones de transformer2 (tra2 B / Df (2R) trix) y utilizando una mutación dsx codificación de un pre-mRNA Que es constitutivamente empalmada en el masculino-forma específica (dsx swe). Las moscas teniendo dsx swe transeuropeas a una supresión Dsx M producir proteínas y no Dsx proteína F (dsx swe / Df (3R) dsx M +15 H +15 H +15). Del mismo modo, las moscas nula para producir tra2 sólo Dsx M. Para obtener X; AA moscas que se transforma el sexo de los hombres en las mujeres, las mujeres cruzamos las moscas teniendo específicos de las mujeres tra cDNA transgenes (w, w (P + 83 hs-tra) / CyO o Gla) o (Df (3L) st J7 j7 Ki huevas p p (P) hs-tra / TM3 o TM6) a B s Y los hombres. El hs-tra los transgenes son lo suficientemente activo a 25 ° C para transformar hombres en mujeres fenotípicas. No utilizar una bomba de calor, choque régimen.

Con el fin de estudiar los cambios de expresión como consecuencia de un doble cambio en la dosis del cromosoma X entre el XX; AA y X; germlines AA, que utilizan mutaciones genéticas que se muestra la supresión de la mayoría de sexo sesgada germinal expresión del análisis. La activación de las mujeres en lugar de la diferenciación sexual masculina en el soma hs con-tra en X; AA moscas resultados en las gónadas con un gran número de células germinales pobremente diferenciado. Las mutaciones en Sxl (y Sxl fs3 fs3 / cm y Sxl 7BO 7BO) o otu (ct otu 1 v 24 / yw otu 17) como resultado un fenotipo similar germinal. De vez en cuando, algunos de los ovarios X; AA hs-tra moscas y germinal-transformado Sxl o otu moscas llevar huevos. Estos ovarios no fueron incluidos en las muestras. Del mismo modo, muy pequeños ovarios, que son esencialmente germlineless no fueron incluidos en ninguna de nuestras muestras.

Para eliminar germinal expresión del análisis de los cromosomas somáticos X-dosis indemnización, hemos aprovechado el hecho de que XX; AA moscas transformado de las mujeres y los hombres por lo general no tienen germinal, pero rara vez tiene un par de células germinales que muestre oogenic espermatogénica o fenotipos. Estos germinal atrófica-XX; AA mujeres se transforman en machos en comparación con las dos gonadectomized X; AA hombres disecados o ficticios-X; AA varones con una ablated germinal genéticamente como resultado de la ausencia de la madre Tud + (progenie tud de 1 pc 1 SP 1 madres).

Arrays

Hemos utilizado una plataforma de microarrays a prueba diseñada para detectar la transcripción de un 94% de D. Melanogaster la versión 1 de genes [61]. A diferencia de la mayor gama de estudios, donde el objetivo es determinar qué genes están alterados entre los tejidos, las etapas de la vida o de los tratamientos, nos centramos aquí en la no expresión diferencial. En docenas de experimentos de hibridación homotipica (ARNm que una muestra se divide, ya sea etiquetada con Cy3 o Cy5, mixto, y hibridizada a la matriz) realizó como parte de este (datos no presentados) y de los estudios previos, nos encontramos con que la expresión es de 1 y que son muy pocos los "outliers" [24, 25, 61]. En el conjunto más amplio de tales homotipica hibridaciones, el 99,5% intervalos de confianza fueron siempre entre 1,4 y 1,5 veces [61]. Dado que sólo un puñado de genes que se espera que muestren un mayor artifactually de 1,5 veces la expresión diferencia, que había fácilmente la sensibilidad para detectar cambios en la expresión debido a una doble diferencia en el cromosoma X-2245 genes representados en la matriz.

Además, hemos demostrado que las diferencias en dos concentraciones de mRNA puede ser fácilmente detectado por la adición de una concentración conocida de mRNA de la hibridación en las mezclas' espiga-en los experimentos de [61]. Análisis de la espiga-en el control de datos (un doble cambio en la aportación de resultados en una doble diferencia en la expresión ratios), y una comparación de sexo-sesgada expresión determinada por FlyGEM y en el norte de secante no muestran pruebas de compresión de expresión en nuestros ratios de los datos [24, 61].

Preparación de la muestra y el etiquetado

Se utilizó 96 muestras biológicas en este estudio. La cuidadosa preparación de la muestra asegura mínimo ajuste posterior en el manejo de datos. Disecciones, flash congelación y ARN extracciones se realizaron como se describe [24, 61]. En resumen, el total de ARN se extrajo utilizando Trizol (Life Technologies, Carlsbad, EE.UU.), seguido por el ARNm mediante un aislamiento Oligotex poli (A) kit de extracción (Qiagen, Valencia, EE.UU.). Concentración de ARN se determinó usando RiboGreen tinte (Molecular Probes, Oak Ridge, EE.UU.) en un ensayo de fluorescencia utilizando un espectrómetro de Luminescence LS-50B (PerkinElmer, Fremont, EE.UU.) equipado con 485 nm (excitación) y 520 nm (emisión) filtros. ARN de calidad se determinó por electroforesis capilar en una Bioanalyzer 2100 (Agilent, Palo Alto, EE.UU.), utilizando el kit de ensayo Nano 6000 (Agilent), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las muestras fueron etiquetadas con Cy3-o Cy5-etiquetados azar nonamers (Trilink Biosciences, San Diego, EE.UU.). Con el fin de garantizar que cada uno de los nonamer fue, de hecho, establece igualmente 'aleatorio', que ordenó un solo lote de azar oligonucleótidos que se dividió en medio sintético en el penúltimo paso con Cy3 o Cy5 nucleótidos añadido al final. Para verificar el rendimiento de estos oligonucleótidos, se realizó un experimento en el que se RNA marcado con ambas Cy3 y Cy5 nonamers en el mismo tubo, seguida de la hibridación, de exploración y análisis. No hubo tinte sesgo evidente. Hibridaciones de las muestras a los microarrays se realizaron a 60 ° C, seguido de lavados exactamente como se describe [24, 61].

Escaneo

Las matrices fueron escaneados utilizando un Axon GenePix 3000A lector de fluorescencia (Molecular Devices Corporation, Union City, EE.UU.), en la que el fotón tubo multiplicador (PMT) fueron ajustados ajustes de calibración utilizando diapositivas. GenePix v.4.1 adquisición de imágenes de software (Molecular Devices Corporation) se utilizó para extraer la señal para cada elemento objetivo. Calibración diapositivas fueron Ultra LAGUNAS (Corning, Acton, EE.UU.) manchado con 10 -3 a 10 -6 diluciones de un 0,33 nM cada población de Cy3 y Cy5 tintes (Amersham Biosciences, Pittsburgh, EE.UU.) a través de GMS 417 Arrayer (Affymetrix, Santa Clara , EE.UU.). El PMT voltajes, en el rango lineal, son equilibradas utilizando estas diapositivas. Con cada nuevo lote de etiquetado y la hibridación, que incluyó un homotipica hibridación [61], en la que la misma preparación de ARN y 1 w 67c 67c todo los hombres se dividió en dos tubos, etiquetados con Cy3 o Cy5 nonamers, mixto y hibridizada. Gira a ajustes de voltajes PMT a veces se hecha en el control de estas diapositivas. No eran elementos saturados. Una vez que se determinó la configuración de PMT, todos los arrays en el mismo lote de hibridación de las escaneadas con el mismo voltaje de los ajustes. Hibridación y el etiquetado de calidad se determinó mediante la confirmación de que los canales eran cerca de equilibrio mundial en la falta de ajuste PMT (no 'sobre la marcha' ajustes se realizaron). No matrices fueron descartados porque no etiquetado de las reacciones en uno de los dos canales. Además, todos los elementos fueron impresas por duplicado. Análisis de regresión de las parcelas de elementos duplicados también se utilizó como una medida de control de la calidad de los degradados y graves speckling. No se descartaron siguientes arrays duplicado elemento de evaluación. Por último, se determinó la fracción de los elementos que regresaron por encima de la señal de fondo sobre el terreno (véase el manejo de datos). Tres vectores se descartaron del estudio porque menos del 50% de los elementos expuestos más arriba-señal de fondo.

Loop diseño de los microarrays emparejamientos

Las muestras de todos los tejidos y las moscas se prepararon (Tabla 1] y hibridizada utilizando un bucle de diseño [62]. Este diseño (véase el archivo de datos adicionales 2) garantiza en primer lugar, que de la más alta calidad directo hibridaciones fueron predominantemente entre corresponde XX; AA y X; AA tejidos y, en segundo lugar, que cualquier muestra puede compararse con cualquier otra muestra incluidos en el estudio, después de La normalización en todas las muestras. La mayoría de las muestras se compararon directamente, pero todas las muestras están conectados en el diseño de las comparaciones indirectas. En la mayoría de las comparaciones directas se han incluido técnicos tanto de etiquetado repeticiones (tinte de gira) y biológicas repeticiones. Aunque hemos utilizado una serie de comparaciones en pareja de XX; AA y X; AA muestras en este estudio, el diseño flexible permite fácil uso en el futuro para abordar otras preguntas acerca del sexo sesgo de expresión.

Manejo de datos

Drosophila datos fueron procesados con el Bioconductor [63] paquete limma (modelos lineales para Microarray Análisis) v. 1.7.6, para ajustarse a los efectos que se derivan de las variaciones en la tecnología de microarrays y no de diferencias biológicas. Debido a la diligencia en el uso de RNA idénticas concentraciones en el etiquetado reacciones y configuración del escáner, el manejo de datos dio lugar a ajustes mínimos a los datos primarios. No hemos duplicado gama media de los elementos que así se disminuiría el poder estadístico en más adelante. En la serie individual, la cruda intensidad de los datos se normalizaron en medios impresos-punta loess (localmente ponderado gráfico de dispersión suave) [64]. Esto corrige la punta de los prejuicios y de menor hibridación gradientes. Esto fue seguido de una de las tres diferentes correcciones de fondo. Para la eliminación de antecedentes, la intensidad de menos de la media de intensidades de los elementos de código de barras (en contra de ADN diseñadas correspondiente a un intrón que se incluyeron en planchas de impresión para fines de seguimiento, pero también son muy útiles para la corrección de fondo [61]] se clasificaron como antecedentes y excluidos De los cálculos. Por el terreno corrección de fondo, la intensidad media de los elementos de código de barras en la matriz se restará de la intensidad de cada spot Los elementos de matriz. Por la no-opción de corrección, utilizado para comparar cuantil normalización entre arreglos [64]. Los experimentos con el Df / + y Dp / + moscas confirmar que el terreno corrección de fondo maximiza la expresión aneuploide diferencias dentro de los segmentos, pero el efecto del número de copias se puso de manifiesto con las dos eliminación de antecedentes y no corrección de fondo (véase el archivo de datos adicional 1).

De matriz de datos de C. Elegans y el ratón fueron extraídos directamente de la Expresión Génica Omnibus (GEO) página web [65]. Se realizó la existencia de mayor normalización o corrección de fondo. El C. Elegans experimentos fueron dos canales hibridaciones sobre manchas arrays [28]. Las muestras problema que se hibridó con una muestra de referencia. La referencia que se hace en los canales de cancelar nuestra comparación de los XX; AA vs X; AA expresión génica. El ratón se realizaron experimentos de arrays de Affymetrix [29].

Fuentes de los datos

Todo el conjunto se dispone de datos en la órbita geoestacionaria. Una extensa descripción de FlyGEM plataforma está disponible en virtud del número de GEO GPL20 [61]. Se dispone de datos en virtud de las adhesiones GSM37438 GEO-GSM37451, GSM2464-2467, GSM16582-GSM16583, GSM16570-GSM16581, y GSM77749-GSM77752. Expresión de los datos del ratón hipotálamo, el riñón y el hígado se obtuvieron a partir de la adhesión GEO número GSE1148 [29]. C. Elegans datos de GEO número GSE715 y GSE724 [28].

Exploratoria visualización de datos

Los datos se agruparon y visualizados usando Cluster 3.0/Tree-View 1,6 [66]. Un mapa de auto-organización (SOM) se calculó a organizar normalizado intensidades de hibridación (en terreno antecedentes resta cuantil seguido de la normalización a través de arrays) de elementos en serie 100000 iteraciones, seguido de k-significa la agrupación de los genes con 10 nodos utilizando la correlación ( Uncentered) similitud métricas. Los genes, pero no los experimentos, se agruparon. Hemos duplicado promedio de los elementos de este análisis a fin de evitar la aplicación falle.

Por dispersión y la media móvil parcelas, usamos los datos procesados por la eliminación de antecedentes cuantil seguido de la normalización en todos los experimentos. Se utilizó el terreno de datos con corrección de fondo para la expresión Drosophila histogramas de los datos. Chi-cuadrado pruebas se realizaron en Excel (Microsoft, Redmond, EE.UU.).

Los elementos de codificación Drosophila subunidades ribosomales se identificaron utilizando el identificador de ontología de genes' estructural constitutivos de ribosomas' que se le asigne en la órbita geoestacionaria GPL20 adhesión. Los elementos de limpieza de hecho fueron identificados de la siguiente manera. Después de la eliminación de antecedentes y cuantil normalización en todos los experimentos, se seleccionaron los elementos de hibridación con intensidades superiores a dos desviaciones estándar por encima de la mediana de intensidad de todos los elementos de serie, de todos los experimentos. De lo anterior, se seleccionaron los elementos de limpieza de facto como los elementos con las desviaciones estándar para la expresión ratios como ± 0,1. Regresiones de la X codificada y la autosome codificada elementos se calcularon por separado en Bioconductor. Las pendientes intercepta y se compararon en el límite de confianza del 95%.

Las medias móviles de expresión para los coeficientes de cada 40 elementos consecutivos (dos elementos por predijo transcripción) se representan gráficamente en función de los correspondientes puestos de genes en el cromosoma X. brazo o 2L El predijo citológico puntos [27] se utilizaron para definir los límites de los segmentos aneuploide en el cromosoma 2L brazo, en el Dp / versus Df + / + experimentos. Las medias móviles se calcularon en Bioconductor.

Análisis de las distribuciones

La distribución de las estadísticas citadas en el texto se obtuvieron utilizando datos tratados con la punta de impresión loess y sobre el terreno corrección de fondo sobre los distintos arrays, y cuantil normalización entre arrays. Podemos demostrar de manera inequívoca que un modesto 1,5 veces diferencia en la dosis de genes tiene un efecto detectable sobre la expresión génica utilizando exactamente los mismos datos que los métodos de manipulación que se aplican al estudio de la X. Además, la manipulación de datos es el método utilizado Método menos favorable con respecto a las conclusiones que se informe. Las diferencias en la expresión de genes en autosómica aneuploide segmentos fueron siempre significativamente superiores a los observados entre los cromosomas X de XX; AA y X; AA muestras.

Se realizó un análisis de una vía de la varianza (ANOVA) seguido por el método de Tukey HSD para la protección en múltiples comparaciones utilizando Matlab (The MathWorks, Natick, EE.UU.). Todas las células se cubrieron diez veces. Utilizó un modelo lineal se usa para comparar tres diferentes juegos de expresión ratios o intensidades de hibridación. El único factor de bloqueo para utilizó un modelo lineal se gen dosis. Se utilizó el muestreo de arranque de la serie de datos agrupados para llenar cada una de las tres células de ANOVA de una vía de diseño. Por la información, las células fueron (Dp /+)/( + / +), AA / AA, y XX / X (ver archivos de datos adicionales 3, Tablas 1-3). Para llenar el (Dp /+)/( + / +) de células, que combinaron los ratios de expresión asociados con una diferencia de 1,5 veces en el gen de la dosis reproducir muestras de todo los hombres, las mujeres y el conjunto de los ovarios, y los ratios de la muestra 600. Hay un menor número de genes en la región Dp autosomes que en todos o en el cromosoma X. Por lo tanto, la estabilidad de esta inferencia fue verificado por llenar esa célula con 200 coeficientes de cada uno de los tipos de tejidos por separado (datos no presentados). Para llenar la AA / AA de células que combinaron todos los datos comunicados conjunto en el presente artículo cuando el gen dosis fue de 1 y la muestra 600 ratios. Para llenar el XX / X 600 células de la muestra que el cromosoma X-ratios para cada una de las tres diferentes comparaciones de las gónadas por separado. Estos son (otu 1 / otu 17) / (hs-tra / +), (Sxl fs3 fs3 / Sxl 7BO 7BO) / (hs-tra / +) y ovario / testículo (ver archivo de datos adicional 3, Tablas 1-3 ). Para el análisis de los datos de intensidad de Drosophila, las células fueron Df / +, AA, y la X (ver archivos de datos adicionales 3, Tablas 4,5). Al igual que con la de datos, la intensidad de arranque datos fueron muestreados 600 veces y el procedimiento se repitió diez veces. Estabilidad para el Df / + de células también fue verificada. Las inferencias fueron similares en los diez muestreos de 200 valores de intensidad de cada tipo de tejido (datos no presentados). Por C. Elegans y el ratón datos de las celdas y se AA X (véase el archivo de datos adicional 3, Tabla 6). Estas células se llenaron como para Drosophila. Para ratón, que corrió ANOVA agrupados en la intensidad de hígado, riñón y el hipotálamo. También se analizaron por separado cada tejido. Tukey HSD El procedimiento se realizó en Matlab y generó un intervalo de confianza para cada par de comparaciones que tiene una familia de sabios tasa de error de, como máximo, α = 0,05 (véase el archivo de datos adicional 3).

A los datos de Drosophila, hemos aplicado una bootstrapped Hodges-Lehmann (HL) estimación de la mediana de las diferencias para determinar si el cromosoma X de expresión es más similar a autosómica expresión o expresión a partir de aberraciones autosómica (ver archivos de datos adicionales de 4,5). Archivo de datos adicional 6 muestra una caricatura que representa arranque HL mediana de las estimaciones de las diferencias seguida de la de Kolmogorov-Smirnov (KS) prueba. HL KS estimaciones y pruebas fueron ejecutadas en Bioconductor. Para la de datos (véase el archivo de datos adicional 4), el HL estimación se ha calculado para cada giro de 600 muestras de arranque de la (Dp /+)/(+/+) y AA / AA distribuciones de generar una nueva distribución de las diferencias. Luego, la misma que se utilizó el muestreo de arranque de la XX / X y AA / AA distribución para generar una segunda distribución de las diferencias. Intensidad datos fueron tratados de manera similar (véase el archivo de datos adicional 5). Las dos distribuciones de las diferencias y se compararon mediante la prueba de KS. Las diferencias en las medianas y de los correspondientes D y p-valores para el KS pruebas entonces permite inferir acerca de la proximidad de expresión ratios o intensidades. En la práctica, un importante valor de p nos permite aceptar (no rechazar) la hipótesis de que la expresión ratios AA / AA están más cerca de XX / X que a Dp / +. Este procedimiento de arranque de la toma de muestras, KS HL estimación y evaluación se repitió diez veces, para comprobar la estabilidad y la solidez de las inferencias. En todos los casos, las evaluaciones se debió repetir en la misma inferencia.

Adicional de los archivos de datos

Los siguientes archivos se encuentran disponibles. Datos adicionales archivo 1 es una cifra que muestra el efecto de diferentes técnicas de manipulación de los datos sobre la expresión diferencial de genes alterados como consecuencia de la dosis en el autosomes. Adicional archivo de datos 2 es una cifra que muestra el diseño experimental en detalle. Adicional de los archivos de datos 3, 4 y 5 son cuadros con los resultados de los análisis estadísticos de los coeficientes de la expresión génica y absoluta para toda la intensidad de las armas y para el cromosoma autosómico aneuploide segmentos: archivo de datos adicional 3 muestra utilizó un modelo lineal comparaciones y archivo de datos adicional 4 muestra la estimación De Hodges-Lehmann (HL), la mediana de las diferencias entre las tasas de expresión en diversos experimentos adicionales y archivo de datos 5 muestra la estimación de Hodges-Lehmann (HL), la mediana de las diferencias entre la intensidad de la señal. Archivo de datos adicional 6 es una cifra que muestra una simple imagen de arranque que representan HL mediana de las estimaciones de las diferencias seguida de la de Kolmogorov-Smirnov (KS) prueba.

Material suplementario
Adicional 1 archivo de datos
Una cifra que muestra el efecto de diferentes técnicas de manipulación de los datos sobre la expresión diferencial de genes alterados como consecuencia de la dosis en el autosomes
Adicional archivo de datos 2
Una cifra que muestra el diseño experimental en detalle
Datos adicionales archivo 3
Utilizó un modelo lineal comparaciones
Datos adicionales archivo 4
Estimación de Hodges-Lehmann (HL), la mediana de las diferencias entre las tasas de expresión en diversos experimentos
Datos adicionales de archivo 5
Estimación de Hodges-Lehmann (HL), la mediana de las diferencias entre la intensidad de la señal en diversos experimentos
Adicional archivo de datos 6
Una cifra que muestra una simple imagen de arranque que representan HL mediana de las estimaciones de las diferencias seguida de la de Kolmogorov-Smirnov (KS) test
Agradecimientos

Esta investigación fue financiada en parte por el Programa de Investigación Intramural del NIH, NIDDK y CIT. Reconocemos nuestros colegas Matías Beller, Jurrien Dean, Sandra Farkas, Leonie Hempel, Jamileh Jemison, Rasika Kalamegham, Alan Kimmel, James Minor, John E. Smith, Charles Vinson, y Yu Zhang para los debates y la asistencia técnica. Estamos agradecidos a Christine Disteche para proporcionar un preliminares de los trabajos de su laboratorio y de Jim Birchler para los debates sobre la aneuploidía autosómica y compensación de dosis.