Genetic Vaccines and Therapy, 2006; 4: 2-2 (más artículos en esta revista)

La rabia sostenida de protección neutralizar los títulos de anticuerpos después de la administración de lípidos catiónicos-formulado pDNA vacuna

BioMed Central
Michal Margalith (mmargalith@vical.com) [1], Adrián Vilalta (avilalta@vical.com) [1]
[1] Vical Incorporated, 10390 Pacific Center Ct, San Diego, CA 92121, EE.UU.

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen

Los datos publicados indican que la formulación de pDNA con lípidos catiónicos podría aumentar en gran medida la respuesta a una vacuna pDNA en mamíferos más grandes. En el presente trabajo se prueba la influencia de varios pDNA: lípidos catiónicos formulaciones sobre los títulos de neutralización de la rabia. Plásmido que expresa la proteína G Rabia (cepa CVS) fue evaluado in vivo de la capacidad para obtener los títulos de neutralizar. PDNA: DMRIE-DOPE formulado en dos de ADN: los lípidos catiónicos molares se comparó en ratones a un Vaxfectin ™ - pDNA formulación. Mouse datos indican que Vaxfectin ™ es más efectiva que la DMRIE-DOPE neutralizar en la obtención de títulos. Además, la proporción de pDNA a DMRIE-DOPE también puede afectar a los títulos de neutralizar. Nuestros datos muestran que la sostenida neutralizar títulos (120 días) se puede obtener después de una única administración de DMRIE-DOPE-pDNA formulado en conejos.

Introducción

Cada año, la rabia mata a más de 50000 personas y millones de animales en todo el mundo [1]. Aunque la vacunación de perros, la eliminación de la desvía y control de los animales salvajes han sido eficaces en la prevención de la mayoría de los casos de rabia humana en América del Norte y Europa occidental, los mismos métodos han sido difíciles de aplicar en las partes del mundo en desarrollo a causa de cultural, económico y Razones políticas. Por lo tanto, una necesidad apremiante de seguros, eficaces y asequibles vacunas contra la rabia humana, todavía existe en algunos países en desarrollo. ADN plásmido (pDNA) vacunas podrían llenar ese vacío, debido a su demostrada seguridad, la velocidad y la facilidad de desarrollo, y de su inherente estabilidad que permita a largo plazo para el almacenamiento y la simplificación de la distribución.

Las vacunas antirrábicas de tejido nervioso origen han estado disponibles para el uso posterior a la exposición en los seres humanos desde el final del siglo 19. Estas vacunas son de bajo costo pero de relativamente baja potencia que requiere un difícil calendario de vacunación de 14 a 21 inoculaciones con dos dosis de los tratamientos posteriores a la exposición. Además, los efectos secundarios graves se asocian frecuentemente con estas vacunas, que limitan su idoneidad para la profilaxis pre-exposición. Muchos países en desarrollo todavía dependen de tejido nervioso derivados de las vacunas. Seguro y altamente eficaces vacunas antirrábicas producidas en cultivos celulares han estado disponibles desde hace casi 30 años en los países prósperos. Tres vacunas antirrábicas están actualmente disponibles en los Estados Unidos para uso humano: la vacuna de células diploides humanas (HDCV); vacuna antirrábica adsorbida (RVA); purificada de embrión de pollo y cultivo de células de la vacuna (PCECV). Las tres vacunas se pueden utilizar en ambos antes y después de la exposición de las aplicaciones. A pesar de la eficacia y perfil de seguridad de las vacunas de cultivo celular, la fabricación, el almacenamiento y la distribución de los gastos que sean prohibitivos para uso generalizado en muchos países más pobres. Otros enfoques de la vacuna contra la rabia en evaluación incluyen el uso de virus vaccinia [2 - 4] y pDNA [5, 6] para entregar antígenos de la rabia.

La viabilidad de las vacunas antirrábicas pDNA se ha demostrado en varios modelos animales, incluyendo ratones [5], [7] perros, gatos [8], [9] caballos y primates no humanos [6, 10]. Curiosamente, una sola administración de la vacuna contra la rabia en ratones pDNA fue tan eficaz como cinco dosis de una vacuna derivada de cultivos de células [11]. Varias vías de administración han sido probados incluidos intramuscular [5, 9], intradermoplantar [12] y intradérmica [5, 7]. PDNA también ha sido entregada Biolistic ® utilizando el sistema [13], así como por la aguja de inyección. Rabia pDNA vacunas se han entregado en PBS [9, 11], Adju-Phos ® (fosfato de aluminio) [9], el lípido A monofosforilado [5], así como las formulaciones de lípidos catiónicos [9]. La elección de la formulación puede ser fundamental para la eficacia de la vacuna, tal como se muestra por Fischer y compañeros de trabajo [9], que demostró que un lípido catiónico-pDNA formulado la rabia vacuna es más eficaz en la obtención de una parte humoral respuesta de fosfato de aluminio o de la formulación de PBS . La prueba de concepto de pDNA vacunas antirrábicas en modelos animales sugieren que el desarrollo de una vacuna eficaz para los humanos pDNA de inmunización deben ser alcanzables.

La protección contra la infección por rabia depende principalmente de la inmunidad humoral [14]. La inyección intramuscular de pDNA en PBS se ha demostrado que trate de obtener potente celular, pero relativamente bajo respuestas de anticuerpos [15, 16]. Por lo tanto, la utilización de formulaciones sólidas que impulsan respuestas de anticuerpos se espera que mejore el rendimiento de un pDNA más allá de que la vacuna contra la rabia alcanzables con pDNA en PBS. Complejación de inmunógeno-codificación pDNA con sistemas de lípidos catiónicos, como DMRIE-DOPE y Vaxfectin ™ [15] ofrece un potencial de mejora a la relativamente escasa respuesta humoral suscitado por pDNA en PBS. Por ejemplo, Hartikka y compañeros de trabajo [17] mostró un aumento de 20 veces en los títulos de anticuerpos contra la influenza nucleoproteína al formular pDNA con Vaxfectin ™ en comparación con los títulos obtenidos con pDNA en PBS. Recientemente, Hermanson y compañeros de trabajo [18] ha demostrado con éxito la protección de los conejos en contra de una dosis letal de los aerosoles de esporas de ántrax después de la vacunación con una pDNA: DMRIE-DOPE vacuna. Fischer y colaboradores [9] fueron capaces de obtener títulos de protección de los caballos después de una única inyección de pDNA: DMRIE-DOPE. Además, Fischer demostró que los títulos obtenidos después de la administración de la rabia pDNA: lípidos catiónicos son más altos que los obtenidos después de la administración de pDNA: Adju-Phos ® anticuerpos detectables y no se obtuvieron después de una inyección de pDNA en PBS.

Anterior publicado trabajos [9, 19] indica que pDNA: lípidos catiónicos formulaciones podrían resultar éxito en la recaudación de los títulos de anticuerpos protectores rabia en mamíferos más grandes. En particular, los datos sobre Fischer caballo pDNA vacunas [9] indican que DMRIE-DOPE podría utilizarse como un componente de una vacuna de este tipo y, además, pDNA: DMRIE-DOPE vacunas actualmente se están evaluando en ensayos con seres humanos [20]. Sin embargo, no existen datos publicados sobre el efecto de diferentes formulaciones de lípidos catiónicos sobre los títulos de la rabia. Nuestros resultados sugieren que los lípidos catiónicos Vaxfectin ™ parece ser un mejor candidato que DMRIE-DOPE pDNA para la formulación de una vacuna contra la rabia. Además, el aumento de los títulos se observaron en baja dosis de la vacuna en ratones cuando DMRIE-DOPE se utilizó en una proporción molar 4:1 (pDNA: lípidos catiónicos), frente a la ratio de 2.5:1 informó anteriormente [9]. La vacunación de los conejos con pDNA: DMRIE-DOPE traducido en altos niveles de anticuerpos neutralizantes que persiste durante un período mínimo de 195 días, por otra parte, los datos de los estudios indican que el conejo de protección títulos se pueden obtener con dosis bajas (10 μ g) de pDNA: lípidos catiónicos . El hecho de que los anticuerpos protectores se observaron 21 días después de pDNA administración de todas las formulaciones de lípidos catiónicos probado apoya el uso de pDNA vacuna de la rabia después de la terapia de exposición. En resumen, nuestros datos sugieren que la elección de los lípidos catiónicos sistema, así como la pDNA: lípidos catiónicos pueden ofrecer mejora importante para la respuesta humoral a la rabia pDNA vacunas.

Materiales y métodos
PDNA y formulaciones

De ADN que codifica la glicoproteína rabia silvestre tipo G (G protein; cepa CVS) fue subcloned de plásmido pKB3-JE13 [22] (Clone # 40280; ATCC, Manassas, VA) en el plásmido VR1051 expresión utilizando la restricción Eco RI sitio. El plásmido resultante fue designado VR7203. VR1051 es similar a la descrita previamente VR1055 construir [22], con excepción de la clonación múltiple sitio. La expresión de la proteína G se probó in vitro por transfecting VM92 (células de melanoma murino; Vical Inc, San Diego, CA) con células VR7203 utilizando lipofection. La presencia de la proteína G en transfección sobrenadantes fue confirmado por Western blot utilizando un anti-rabia anticuerpo monoclonal (QED Bioscience, cat # 20501; San Diego, CA) (datos no presentados).

DMRIE-DOPE consiste en una proporción de 1:1 molar DMRIE: (±)-N-(2-Hydroxyethyl)-N, N-dimetil-2 ,3-bis (tetradecyloxy)-1-propanaminium bromuro y DOPE: 1, 2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine [23]. El DMRIE-DOPE lípidos se mezcla diluida al 1,5 mM con agua estéril y se añadirán a un volumen igual de pDNA (2 mg / ml en PBS 2 ×) y vortex brevemente. El final de ADN: los lípidos catiónicos molar ratio de 4:1 formulación fue bien o 2.5:1, en función del grupo de prueba.

Vaxfectin ™ consiste en una mezcla equimolar de VC1052 ((±)- N-(3-aminopropil)-N, N-dimetil-2, 3-bis (myristoleyloxy)-1-propanaminium bromuro) y DPyPE (Diphytanoylphosphatidyl-etanolamina). Preparación de Vaxfectin ™ y sus formulaciones se describe en detalle por Hartikka y compañeros de trabajo [17]. Brevemente, la razón molar de pDNA: lípidos catiónicos de Vaxfectin ™ formulación es 4:1. PDNA se disuelve en el 0,9% de NaCl, 20 mM Na fosfato (pH 7.2) en el doble de la concentración final. Vaxfectin ™ es suspendido de una película seca estado en el 0,9% de NaCl al doble de la concentración final.

Animal procedimientos

Todos los animales fueron aprobadas por los procedimientos del IACUC y Vical cumplido con las normas establecidas en la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (EE.UU. Departamento de Servicios de Salud, NIH, Bethesda, MD) y el USDA (Washington, DC), Ley de Bienestar Animal Y el Bienestar de los Animales Reglamento.

Grupos de diez, de seis a ocho semanas de edad ratones BALB / c (Jackson Labs; Bar Harbor ME) fueron vacunados por bilaterales inyección intramuscular de lípidos catiónicos-formulado pDNA (2 o 5 μ g; L 50 μ por trayecto) en el Músculo cuádriceps grupo. Los ratones fueron sangrados en días 1 y 21 de la órbita por punción sinusal. El final se hizo sangrar por punción cardiaca 48 días después de pDNA administración. Las muestras de suero se les realizó pruebas de anticuerpos neutralizantes por la rápida inhibición de fluorescencia Focus Test (RFFIT).

Grupos de tres conejos blancos Nueva Zelandia (Harlan Sprague-Dawley; Oxford, MI), recibido el plásmido VR7203 formulado con DMRIE-DOPE (4:1 ADN: lípidos catiónicos molar ratio) en PBS en un volumen total de 0,5 mL por inyección intramuscular ( Rectus femoris bilaterales inyección); pDNA dosis varió de 10 μ g de 1 mg, dependiendo del experimento. Control positivo grupos recibieron una dosis única de IMRAB ® 3 (Merial, Lyon, Francia), un comercialmente disponible la vacuna contra la rabia veterinaria. Los animales fueron sangrados a intervalos regulares hasta el final del estudio. Suero fue probado para neutralizar a los títulos de la rabia por RFFIT.

Neutralizar título determinación e interpretación

Rabia neutralizar títulos fueron determinados por fluorescencia de enfoque rápido de los ensayos inhibición (RFFIT) en Atlanta Salud Asociados (Cumming, GA) por medio de la rabia y el CVS estándar de las técnicas de ensayo. En pocas palabras, diluciones de suero inactivado por calor son incubadas con una cantidad fija de virus de la rabia (cepa CVS) por 60-90 min a 37 ° C. Residual de la infectividad del virus se determinó inoculando cultivos celulares con el virus. Focos de virus de las células infectadas están manchadas y detectados por fluorescencia y contados. Según la Organización Mundial de la Salud de la Comisión de Expertos rabia [1] y los Estados Unidos Centros para el Control y Prevención de Enfermedades un anticuerpo nivel de> 0,5 Unidades Internacionales (UI) / ml de suero indica una positiva respuesta de anticuerpos protectores a la vacunación.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con el programa informático SAS (SAS Institute, Cary, NC). Un modelo lineal general (GLM) se ha realizado con la formulación, la dosis variables como la clase y de los datos experimentales, como la variable dependiente. La interacción plazo de formulación de dosis fue examinado en el modelo GLM. Método de Tukey y el contraste declaración se utilizaron para el grupo de sabios comparaciones. Significación estadística fue determinada a α = 0,05 con nivel 2 caras de prueba.

Resultados
La vacunación de los conejos con la rabia proteína G pDNA resultados sostenidos en el alto de protección neutralizar títulos

Grupos de tres conejos fueron vacunados con cualquiera de los DMRIE-DOPE-formulado VR7203 plásmido (4:1 ADN: lípidos catiónicos ratio) o la vacuna contra la rabia convencionales, IMRAB ® 3. Conejos en el grupo de pDNA fueron vacunados en Días 1, 28 y 56 con 1 mg (inyección bilateral; 500 μ μ g/500 L por pierna) de DMRIE-DOPE-formulado pDNA y sangría a intervalos regulares para la recogida de suero. Animales en la IMRAB ® 3 grupo recibió una sola administración de la vacuna (1 ml) y se desangrado al mismo tiempo que el grupo de pDNA. Suero de todos los animales ha títulos (Figura 1] más alto que el 0,5 UI / mL umbral de día 21. El suero de los conejos vacunados con pDNA llegado a significar alrededor de 100 títulos de UI / mL por día 41. PDNA títulos en el grupo se mantuvo alta durante la duración del estudio (195 días) se redujo a alrededor de 50 UI / mL en la conclusión del estudio. Los animales del grupo control presentaron títulos de los 4 a 8 UI / ml después de la gama Día 21 sangrar.

Administración única de la rabia proteína G pDNA resultados en los títulos de alta protección en conejos

Con el fin de evaluar la respuesta inmunológica a una sola administración pDNA, grupos de tres conejos fueron vacunados con una única inyección intramuscular de una de las 300 μ g o 10 μ g de la rabia que expresan la proteína G-pDNA formulado con DMRIE-DOPE (4:1 ADN: catiónico Proporción de lípidos). Un grupo control fue inyectado con un comercial de la vacuna contra la rabia veterinaria, IMRAB ® 3. Los animales fueron sangrados a intervalos regulares y de la rabia neutralización títulos fueron obtenidos por RFFIT ensayo (Figura 2]. Los tres grupos han neutralizar títulos de protección (es decir, a 0,5 UI / ml) 21 días después de la vacunación; alto neutralizar títulos se mantuvieron durante la duración del estudio (120 días). Títulos el día 21 se acerca de un orden de magnitud mayor en los 300 μ g pDNA grupo de dosis en comparación con la dosis de 10 μ g grupo. La vacunación con 300 μ g de DMRIE: DOPE-formulado pDNA resultado en la neutralización títulos que no fueron estadísticamente diferentes de los obtenidos con la vacuna contra la rabia convencionales. La vacunación con el 10 μ g pDNA dosis dado lugar a los títulos de protección alrededor de la mitad de un registro más bajo que los obtenidos con los 300 μ g pDNA dosis en el día 120, pero aún casi dos órdenes de magnitud más alta que el umbral de protección (0,5 UI / mL) y no estadísticamente diferentes De los títulos obtenidos mediante la vacuna convencional.

Vaxfectin ™ - formulado rabia proteína G pDNA induce mayor neutralizar títulos que DMRIE-DOPE-pDNA formulado después de administración única en ratones

El efecto diferencial de DMRIE-DOPE y Vaxfectin ™ formulaciones sobre los títulos de neutralización de la rabia fue explorado por vacunar a los ratones con una sola administración de los lípidos catiónicos-formulado pDNA. Dos pDNA se utilizaron dosis (2 μ g y 5 μ g); DMRIE-DOPE se formuló en un molar ratio (pDNA: lípidos catiónicos), de cualquiera de 2.5:1 o 4:1; Vaxfectin ™ fue formulado en una proporción de 4:1 molar (PDNA: lípidos catiónicos). Neutralizar a los títulos de 48 días después de la vacunación de ratones con Vaxfectin ™ - formulado VR7203 fueron estadísticamente superiores (p = 0,004) a los obtenidos de la administración de pDNA: DMRIE-DOPE en cualquiera de dosis (Figura 3]. Además, en la 2 μ g pDNA dosis, títulos obtenidos después de la administración de pDNA: DMRIE-DOPE en proporción 4:1 (ADN: lípidos catiónicos) fueron ligeramente superiores a los títulos del sector de la administración en el ratio de 2.5:1; títulos de los 4 : 1 y 2.5:1 ratios fueron estadísticamente indistinguibles unos de otros en la 5 μ g pDNA dosis. Suero de todos los animales en la Vaxfectin ™ en el grupo de 2 μ g dosis mostró de protección mientras que los títulos de neutralizar hasta el 20% de los ratones en el DMRIE-DOPE grupos no respondieron a la vacunación.

Discusión

El valor de las formulaciones de lípidos catiónicos humoral en la mejora de las respuestas a las vacunas pDNA está bien documentada [9, 16, 19]. En concreto, la eficacia de un pDNA: DMRIE-DOPE vacuna contra la rabia (2.5:1 pDNA: lípidos catiónicos molar ratio) fue demostrado de forma convincente por Fischer y compañeros de trabajo utilizando un modelo de caballo. Desarrollo de un pDNA de vacuna antirrábica para uso humano requiere de la evaluación de la mejora de las formulaciones de lípidos catiónicos incluidos distintos sistemas como Vaxfectin ™ y la determinación de pDNA óptima: lípidos catiónicos. Nuestros datos proporcionan una idea de la formulación de posibles mejoras a través de dos sistemas diferentes de lípidos catiónicos. También proporcionamos los datos que comparan la inmunogenicidad de la rabia pDNA disponible en el comercio a una vacuna de virus inactivado.

Neutralizar a los títulos obtenidos después de la vacunación de ratones con 2 o 5 μ g de lípidos catiónicos-pDNA formulado indican que Vaxfectin ™ puede mejorar la respuesta inmunológica en comparación con DMRIE-DOPE y, en consecuencia, representa un buen candidato para la formulación de una vacuna contra la rabia pDNA, y potencialmente otros Vacunas, que dependen principalmente de una respuesta de anticuerpos para la protección. Niveles de anticuerpos neutralizantes en la pDNA: Vaxfectin ™ grupos de ratones fueron estadísticamente superiores a los observados en el pDNA: DMRIE-DOPE grupos, ya sea en 4:1 o 2.5:1 molares. La diferencia entre Vaxfectin ™ y DMRIE-DOPE se puso de relieve en la dosis más baja (2 μ g, p = 0,004), sin dejar de ser estadísticamente significativo en la dosis de 5 μ g (p = 0,009). Curiosamente, los títulos de anticuerpos neutralizantes para el DMRIE-DOPE grupos formuladas en la proporción molar 4:1 fueron consistentemente más elevado que el de la razón molar grupos de 2.5:1. Una vez más, la diferencia entre el DMRIE-DOPE grupos se acentuó en la parte inferior pDNA dosis. La diferencia entre los GMTs (media geométrica de Titer) de los dos DMRIE-DOPE proporciones utilizadas es estadísticamente marginales y requerirá una investigación más a fondo. Es importante señalar que se presentan los títulos de anticuerpos neutralizantes para un sólo punto del tiempo (48 días después de la vacunación), ya que las diferencias en relación GMT podría cambiar con el tiempo. Sin embargo, nuestros datos indican que la formulación de pDNA con Vaxfectin ™ suscita rápido y robusto respuestas humorales a la proteína G rabia. Además, todos los ratones en el Vaxfectin ™ grupos niveles de anticuerpos muy por encima del umbral de protección (0,5 UI / mL), mientras que no hubo animales de respuesta en el DMRIE-DOPE grupos a la dosis baja (2 μ g).

Conejo inmunogenicidad datos aquí presentados confirman que la persistencia de altos títulos neutralizantes se puede obtener con dosis bajas pDNA. De hecho, una sola dosis de 10 μ g de DMRIE-DOPE-formulado pDNA suscitó neutralizar los títulos de casi dos órdenes de magnitud en el umbral de protección (0,5 UI / ml) que persisten durante al menos 120 días después de la administración. La magnitud y duración de la respuesta fue equivalente a la obtenida con una sola administración de una vacuna veterinaria tradicional de la rabia. El límite superior de la respuesta humoral a DMRIE-DOPE-pDNA formulado en el conejo se determinó mediante la administración de tres dosis de 1 mg. Los títulos de anticuerpos obtenidos después de este régimen de vacunación llegó a 100 UI / ml a día 41 y no aumentó el día 56 después de la inyección de refuerzo. Altos títulos se mantuvieron durante la duración del estudio (195 días). La magnitud de esta respuesta fue estadísticamente equivalente a la obtenida después de una única inyección de 300 μ g de lípidos catiónicos-formulado pDNA vacuna. La cinética de la respuesta después de una única administración, de 10 μ g de pDNA fueron más lentos que los observados tras la administración de 300 μ g de la vacuna. Títulos en el día 21 fueron alrededor de un orden de magnitud inferior a la dosis de 10 μ g en comparación con el grupo de 300 μ g grupo. Sin embargo, los títulos fueron estadísticamente equivalentes a día 91 y se mantuvo similar en la duración del estudio. Esta última observación sugiere que la dosis-dependiente la cinética de la respuesta deben ser considerados en el diseño de una vacuna después de la exposición de las aplicaciones, como las dosis bajas podrían utilizarse para vacunas destinadas a la profilaxis pre-exposición.

En conclusión, nuestros datos sugieren que la elección de los lípidos catiónicos y la optimización de pDNA: lípidos catiónicos pueden ofrecer significativo aumento de la respuesta humoral a la proteína G rabia y potencialmente otros antígenos. En concreto, el uso de Vaxfectin ™ en una rabia pDNA formulación puede aumentar la eficacia al tiempo que se prevé la entrega de las dosis bajas de pDNA. Los resultados de esta investigación proporcionan información valiosa para el desarrollo de una vacuna contra la rabia pDNA para el mundo en desarrollo.

Abreviaturas

Pb, pares de bases; GMT, la media geométrica de Titer; UI, Unidad Internacional; PBS, buffer fosfato salino; pDNA, ADN plásmido

Agradecimientos

Estamos agradecidos por las discusiones científicas con el Dr Peter Hobart. Agradecemos a los Dres. David Kaslow, Alain Rolland, Holly Horton, Gary Hermanson, Carl Wheeler, Marston Manthorpe, Larry Smith y Alan Engbring para la revisión crítica del manuscrito. Agradecemos el valioso apoyo técnico de Denis Rusalov en Farmacia, así como Jane Morrow, Sylvia Salapski y el resto del personal de Vical Vivarium. Damos las gracias a Lilly Chen de asistencia con el análisis estadístico de los datos.