Cardiovascular Diabetology, 2006; 5: 3-3 (más artículos en esta revista)

Tipo-2 diabetes inducida por cambios en la matriz extracelular vascular la expresión de genes: Relación con el tamaño de los buques

BioMed Central
WeiWei Song (wsong@temple.edu) [1], Adviye Ergul (aergul@mail.mcg.edu) [1]
[1] Program in Clinical and Experimental Therapeutics, the University of Georgia College of Pharmacy, Augusta, Georgia 30912, USA
[2] Vascular Biology Center, Medical College of Georgia, Augusta, Georgia 30912, USA

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Resumen
Antecedentes

Hiperglucemia inducida por cambios en la estructura de la pared vascular contribuyen a la patogénesis de la diabetes microvasculares y macrovasculares. Metaloproteinasas de la matriz (MMP), una familia de enzimas proteolíticas que degradan la matriz extracelular (ECM) proteínas, son esenciales para el remodelado vascular. Hemos demostrado que la endotelina-1 (ET-1) el aumento de media actividad de MMP y la remodelación vascular asociada en la diabetes de tipo 2. Sin embargo, el efecto de la diabetes de tipo 2 y / o ET-1 en la regulación de MMP ECM y la expresión de genes en diferentes camas vascular sigue siendo desconocido.

Métodos

Aorta y la arteria mesentérica muestras fueron aisladas de control, la diabetes Tipo 2-Goto Kakizaki (GK) GK ratas y ratones tratados con un antagonista ET ABT-627. Perfil de expresión génica de MMP-2, MMP-9, MT1-MMP, fibronectina, procollagen tipo 1, c-fos y c-jun, fue determinado por cuantitativa en tiempo real (qRT) PCR. Además, el perfil de expresión génica de aorta fue evaluado por un ECM y moléculas de adhesión específicas vía microarrays.

Resultados

Análisis de los datos qRT-PCR demostró un aumento significativo en los niveles de mRNA de MMPs y ECM proteínas, en comparación con los animales control después de 6 semanas de la diabetes leve. Además, estos cambios fueron comparables en la aorta y mesenterio muestras. En contraste, el tratamiento con un antagonista ET impedido la diabetes inducida por cambios en la expresión de MMPs y procollagen tipo 1 en las arterias mesentérica pero no en la aorta. Microaarray análisis proporcionado pruebas de que la matriz extracelular 27 genes son regulados diferencialmente en la diabetes. Más qRT-PCR con 7 genes seleccionados confirmó la microarrays de datos.

Conclusión

Estos resultados sugieren que la expresión de dos proteínas de matriz andamio y degradantes matriz MMP genes están alterados en camas macro y microvasculares en la diabetes de tipo 2. ET Un antagonismo restaura los cambios en la expresión génica en la mesentérica cama, pero no en la aorta lo que sugiere que ET-1 diferencialmente microvascular regula la expresión de genes en la diabetes de tipo 2.

Introducción

Los cambios en la estructura de la pared vascular producen en la diabetes y contribuir a ambos micro y macrovasculares. Estudios anteriores en streptozosin (STZ) inducido por el modelo de la diabetes tipo 1 documentado el aumento de la proliferación de la íntima y media de espesor, así como la matriz extracelular (ECM) en la deposición microvasculatura como arterias mesentérica tan pronto como 3 semanas de la diabetes experimental [1 - 4]. Hipertrofia y el remodelado vascular aumentada asociada con dedifferentiation expresión de los marcadores de las células del músculo liso vascular también se producen en los buques más grandes, como la aorta [5]. Si bien estos estudios proporcionaron pruebas para la diabetes inducida por alteraciones en la síntesis de ECM y de la estructura vascular de un modelo experimental de diabetes tipo 1 que se caracteriza por muy elevados niveles de glucosa en sangre, en qué grado leve a moderado hiperglucemia como se ha visto en la diabetes de tipo 2 influencias La expresión de genes de las proteínas ECM asociados con el remodelado vascular y si hay diferencias en las microempresas vs macrovasculares cama no se comprenden totalmente.

Vascular ECM proteínas como colágeno tipo 1 y 3, fibronectina y thrombospondins no sólo funcionar como andamios proteínas, pero también participan en la matriz de señalización por la interacción con la integrina familia de las proteínas y activar el crecimiento de la promoción de las señales. ECM muestra un equilibrio muy dinámico, donde hay constantes síntesis, la degradación y la reorganización. Volumen de negocios de proteínas de la matriz se rigen por metaloproteinasas de la matriz (MMPs) [6]. Si bien la disminución de la actividad MMP se piensa en general para contribuir a la acumulación de ECM en diabéticos y renales en el tejido vascular de los pacientes con diabetes, y otros han informado recientemente de que hay una pronta activación de MMPs en la hipertensión y la diabetes [7 - 9]. Sin embargo, la regulación transcripcional de las proteínas ECM y MMPs vasculares en diferentes camas y específicamente en la diabetes de tipo 2 que queda por determinar.

Vasoactivos factores, entre ellos la endotelina-1 (ET-1) y la angiotensina II participa en el remodelado vascular diabético como lo demuestran los estudios demostraron que la atenuación de estas respuestas por bloqueo de estos sistemas tanto en la diabetes experimental y clínica. Por ejemplo, Gilbert y sus colegas informaron de que el antagonismo de receptores ET A mesentérica evita la hipertrofia vascular en la diabetes tipo 1 [4]. Otro estudio presentó pruebas de que el bloqueo de la ET-1 inhibe la acción ECM deposición en la aorta y [5]. Nos informó recientemente de que los niveles de ET-1 se encuentra elevado y un ET Un antagonista impide ECM deposición y MMP activación cerebral media en las arterias, pero no en el riñón de Goto Kakizaki-ratas (GK), una organización no obesos modelo de la diabetes de tipo 2 [9, 10]. Por tanto, este estudio fue diseñado para probar la hipótesis de que existe una regulación diferencial de la activación de MMP en micro vs macrovessels en diabetes de tipo 2 y ET-1 contribuye a este proceso.

Métodos
Preparación y tejido animal

Todos los experimentos se realizaron en Wistar macho (Harlan, Indianapolis, IN) y Goto-Kakizaki (criados en casa, derivados de la colonia Tampa) ratas [11]. Los animales fueron alojados en el Colegio Médico de Georgia instalación de cuidado de los animales que es aprobado por la Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio y el estudio fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo. Los animales fueron alimentados estándar rata chow y el agua del grifo ad-libitum. Durante la vivienda, el agua potable mediciones, el peso, y mediciones de glucosa en la sangre se realizaron dos veces por semana. A las 12 semanas de edad, cuando todos los animales se convirtió abiertamente GK diabéticos, transmisores de telemetría para mediciones de la presión arterial fueron implantados como en el informe anterior [12]. Después de 2 semanas de período de recuperación, el control de la diabetes y los animales se les administró un antagonista selectivo ET, ABT-627 (5 mg / kg / día) en el agua potable, o sólo los vehículos [8]. El tratamiento se mantuvo hasta el momento de sacrificar a 18 semanas de edad. Los animales fueron anestesiados con pentobarbital sódico y exsanguinated través de la aorta abdominal. Tras el sacrificio, la cama se cosechó mesentérica, tercer orden arterias mesentérica y aorta torácica fueron aislados de inmediato y poner en RNAlater RNAlater ™ (Ambion, Austin, TX, EE.UU.) para el almacenamiento a -80 ° C.

ARN aislamiento y la síntesis de ADNc

Total de la extracción de RNA se llevó a cabo utilizando el RNeasy ® Mini Kit (Qiagen Inc, Valencia, CA) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. RNA de la calidad de cada muestra fue asegurado por la absorbancia A260/280 por electroforesis y el índice de 1,2% de formaldehído en gel de agarosa. 1.0-2.0 μ g de ARN total fue inversa transcritas en el capítulo único de cDNA MuLV usando la transcriptasa inversa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). RT reacción se llevó a cabo durante 60 min a 42 ° Cy 5 min a 95 ° C en un termociclizador.

Primer diseño y qRT-PCR

Todos los juegos de oligonucleótidos primers fueron diseñados sobre la base de la secuencia publicada del mRNA. Amplificación esperado longitudes eran de 100 bp - 200 bp. Oligonucleótidos utilizados en este estudio se enumeran en el cuadro 1. La qRT-PCR se realizó en un SmartCycler II (Cefeidas, Sunnyvale, CA), utilizando SYBR ® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). 2-2.5 μ l de cDNA plantilla se utiliza para la qRT-PCR en un volumen final de 25 μ l. CDNA se amplificó con arreglo a la siguiente condición: 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 60 s de 40 a 45 ciclos de amplificación. Fluorescencia cambios fueron controlados con SYBR Green después de cada ciclo. Análisis de la curva de fusión se realizó (0,5 ° C / s aumento de 55-95 ° C con continuas lecturas de fluorescencia) al final de los ciclos de asegurar que solo los productos de PCR se obtuvieron. Tamaño de amplificación y especificidad de reacción fueron confirmados por el 2,5% electroforesis en gel de agarosa. Todas las reacciones se repitieron en 3 carreras por separado PCR usando ARN aislado de 3 juegos de los animales. Los resultados fueron evaluados con el software SmartCycler II. Glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) los cebos se utilizaron para la normalización de las muestras. Seguir de crossover contaminaciones de PCR, RNasa libre de agua (Qiagen Inc, Valencia, CA) fue incluido en el RNA de extracción y utilizada como control negativo. Para garantizar la calidad de los datos, un control negativo se aplica siempre en cada plazo.

CDNA array análisis de la expresión génica

El perfil de expresión de la matriz extracelular y las moléculas de adhesión en los genes se analizó mediante el no radiactivos GEArray Q Ratón serie de genes array (MM-010N, SuperArray Bioscience Corp, Frederick, MD). Esta gama se compone de membrana de 96 matriz extracelular y las moléculas de adhesión en los genes, un plásmido pUC18 control negativo, y cuatro genes de limpieza incluido glyceraldehyde-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), cyclophilin A, la proteína ribosomal L13a, y β-actina. Biotina cDNA sondas fueron desnaturalizados y hibridizada a la matriz extracelular y moléculas de adhesión de genes específicos de los fragmentos de cDNA manchada de las membranas. Después de pre-hibridación con GEAhyb Solución de hibridación (SuperArray) de ADN de esperma de salmón desnaturalizado (Invitrogen). El conjunto de membrana se hibridó con sondas de cDNA desnaturalizado la noche a la mañana a los 55 ° C. Tras el lavado de la membrana dos veces con 2 × SSC, 1% SDS y dos veces con 0,1 × SSC, 0,5% SDS durante 15 min a 55 ° C cada una, la membrana fue bloqueada con GEAblocking Solución Q (SuperArray) por 40 min y se incubaron con alcalinas Fosfatasa-streptavidina conjugado durante 10 minutos a temperatura ambiente. Quimioluminiscente detección se realizó a través CDP-Star sustrato. Los resultados fueron analizados con ScanAlyze y GEArray Analyzer. La relativa de los diferentes niveles de expresión de genes se calcula comparando la intensidad de la señal con la de control interno β-actina.

El análisis de los datos

RT-PCR resultados se informaron como la expresión de genes y en relación a la fe en el cambio genes diana fue determinado por 2 - ΔΔ Ct método, en donde - ΔΔ Ct = (C tTarget - C tActin) GK - (C tTarget - tActin C) y de control de Ct = valor El número de ciclos que la señal cruza el umbral. Para evaluar el efecto del tratamiento ABT-627 en el perfil de expresión génica en el grupo de diabéticos, doble cambio se determinó como (C tTarget - C tActin) GK - (C tTarget - C tActin) GK + ABT-627. Grupo de comparaciones (C vs GK o GK vs GK + ABT-627) se realizaron mediante la prueba t de Student. Por Array estudios, en comparación con la expresión de los genes se analizó utilizando el SAM (Análisis Estadístico de Microarrays) de software [13].

Resultados y discusión

GK ratas mostraron ligeramente elevados niveles de glucosa en sangre que son representativos de los niveles de glucosa en sangre visto en pacientes con diabetes de tipo 2 (Tabla 2]. No se observaron cambios en la presión arterial y el perfil lipídico. Anteriormente hemos demostrado que las ratas son GK hypoinsulinemic y mostrar intolerancia a la glucosa. Euglycemic hiperinsulinemia abrazadera GK estudios indicó que las ratas también son resistentes a la insulina. Estos resultados indican claramente que la resistencia a la insulina en GKs alteración de la secreción de insulina se agrava y da lugar a hypoinsulinemia como se ve en la mayoría de los pacientes con diabetes de tipo 2 que a la larga convertirse en dependiente de la insulina y por lo tanto representan un modelo clínicamente relevantes.

Desde MMP-2, MMP-9 y MMP MT1-MMP son las principales especies que se encuentran en la vasculatura y nuestros estudios anteriores sugirieron tiempo-dependiente de la regulación diferencial MMPs en la diabetes [8, 9, 14 - 16], que primero estudió MMP y colágeno La expresión de genes en la aorta y mesenterio muestras obtenidas en el control de ratas y GK. Los resultados se resumen en la figura 1 demuestra que leve elevación de la glucosa en sangre durante 6 semanas es suficiente para estimular la expresión de genes de MMP-2, MMP-9 y MMP-MT1 en la aorta y mesenterio ambas muestras en un grado similar. Curiosamente, la expresión de colágeno tipo 1 fue mayor en la aorta que en las muestras mesentérica buques de animales diabéticos. Fibronectina expresión es sin cambios en la aorta, pero aumentó significativamente en el mesenterio. C-jun expresión, que está involucrada en el crecimiento inicial de respuesta, mientras que también se aumentó la expresión de c-fos fue menor en el grupo de diabéticos. Sobre la base de nuestros conocimientos, estos resultados son primero que demuestra el aumento de la expresión de genes MMP en las pequeñas arterias mesentérica y en la aorta en la diabetes. Recientemente hemos informado de que MMP proteína y la actividad se incrementa en el medio de las arterias cerebrales GK ratas y esto se asocia con el remodelado vascular caracterizado por el aumento de espesor medial y la disminución de lumen: ratio de los medios de comunicación [9]. Actualidad resultados sugieren firmemente que los cambios en la actividad enzimática paralela cambios en la expresión génica que indican la estimulación del sistema de representación proporcional mixta a nivel transcripcional en la diabetes de tipo 2. Nuestros resultados son coherentes con los informes anteriores que mostraron una mayor expresión de colágeno en la cama mesentérica en la diabetes tipo 1 y además demostrar que este aumento es en mayor medida en las grandes buques muscular [4, 17, 18]. Nuestros resultados sobre fibronectina expresión en la aorta, sin embargo, difieren de un informe reciente de Fukuda et al, que demostraron un aumento de 4 veces en la aorta fibronectina expresión [5]. Esta diferencia puede atribuirse a la utilización de un modelo de la diabetes tipo 1 o el punto de tiempo (26 semanas después de la inducción de la diabetes) en la que se evaluó la expresión de colágeno.

El papel de los entes locales vasoactivos factores vasculares en diabéticos remodelación ha sido un área de investigación activa. Dado que la hiperglucemia estimula la producción de ET-1, el más potente vasoconstrictor con mitógenos y profibrotic propiedades, impulsado estudios con antagonistas de los receptores de ET para determinar la participación de las ET en el sistema diabético complicaciones vasculares [4, 19 - 21]. Sin embargo, una gran mayoría de estos estudios se realizaron utilizando modelos experimentales de diabetes tipo 1 o de los animales obesos. Recientemente hemos demostrado que los niveles de ET-1 se encuentra elevado en el modelo GK [9]. Así, el actual estudio investigó el papel de la ET-1 endógena de las micro y macrovasculares de la expresión génica en el modelo GK. Los resultados se resumen en el cuadro 3 demuestran que el bloqueo de la ET Un subtipo de receptor en una fase temprana del proceso de la enfermedad no impide a la diabetes inducida por el aumento en la expresión de las proteínas ECM MMPs y en la aorta. Sin embargo, el antagonismo de receptores ET completamente atenúa los aumentos de MT1-MMP y colágeno tipo 1 y la expresión parcialmente impide cambios en la MMP-2, MMP-9 y fibronectina expresión. Estos nuevos hallazgos sugieren que existe una diferencia de la regulación de la expresión génica ECM microvasculares en la diabetes de tipo 2. Los resultados confirman las conclusiones de Gilbert et al. Que el bloqueo del receptor ET A hipertrofia previene microvasculares en la diabetes tipo 1 y se extiende estos resultados a la diabetes de tipo 2 [4].

Con el fin de determinar si la expresión de otras proteínas ECM es alterado en el modelo GK, de aorta perfil de la expresión génica se investigó mediante un ECM y la vía de moléculas de adhesión específicas microarrays enfoque (Fig. 2]. Genes que mostraron un cambio significativo en la expresión (p <0,05 vs control) se agruparon en las moléculas de adhesión, las proteínas ECM y de las proteasas en la Tabla 4 y demostrado que un total de 27 genes de los 96 genes son regulados diferencialmente en ratas GK. Hubo aumentos significativos en diversas integrinas y MMPs confirmando nuestra qRT-PCR resultados. Incremento en la expresión de moléculas de adhesión es importante en la diabetes, no sólo para facilitar la adherencia y penetración de las células inflamatorias, pero también a transmitir el ECM-generado señales de las células del músculo liso subyacente. Hemos observado disminuciones en thrombospondin-2 (TSP-2), pero los aumentos de TSP-3 y -4 expresión y de la falta de cambio en la TSP-1. Estos resultados son particularmente interesantes en relación con la interacción de TSP con MMP-2 y otras proteínas ECM [22 - 24]. TSP-2 pertenece a una familia glicoproteína extracelular, y es que participan en las interacciones célula-matriz incluyendo la inhibición de MMP-2 por su unión a la proteína activa, así como el descenso MMP expresión [24 - 26]. TSP-2 ratones knock-out mostrar defectos en la formación de colágeno fibril y apego a las proteínas ECM. En este estudio se observó disminución de TSP-2 y MMP-2 aumento de la activación. Por lo tanto, es razonable especular que disminuyó TSP-2 expresión puede contribuir a un aumento de MMP-2 y la disminución de la activación de células de la matriz resultante archivo adjunto en un ambiente más libre para las células del músculo liso vascular y migrar a remodelar en la diabetes. Sin embargo, hay que reconocer que los estudios actuales se refieren únicamente a la expresión de genes de las proteínas ECM y debe extenderse a la de proteínas y nivel de actividad para ser más definitivo.

En conclusión, la diabetes leve puede estimular un patrón de la expresión de genes que promueve la remodelación de los dos micro y macrovessels. Aunque ET-1 contribuye a la alteración en el perfil de expresión génica en la microvasculatura través de la activación de un subtipo de receptor ET, macrovasculares cambios en la expresión génica son independientes de ET-1.

Contribuciones de los autores

WeiWei Song realizó todos los experimentos y Adviye Ergul participó en todos los aspectos experimentales y la preparación del manuscrito.

Agradecimientos

Este trabajo recibió el apoyo de subvenciones de NIH (HL076236-01, DK074385), la Asociación Americana de Diabetes y la subvención de Investigación Pfizer Atorvastatina Premio a la Investigación Adviye Ergul. Los autores desean agradecer a los Laboratorios Abbott para el ABT627 compuesto.