BMC Cancer, 2006; 6: 60-60 (más artículos en esta revista)

El ácido zoledrónico tratamiento perjudica proteína geranilado-geranylation de los efectos biológicos en las células de próstata

BioMed Central
M Goffinet (goffinet@icr.fnclcc.fr) [1], M Thoulouzan (thoulouzan@icr.fnclcc.fr) [1], A Pradines (Pradines@icr.fnclcc.fr) [1], I-Lajoie Mazenc ( Lajoie@icr.fnclcc.fr) [1], Carolyn Weinbaum (weinb006@mc.duke.edu) [2], JC Faye (faye@icr.fnclcc.fr) [1], S Séronie-Vivien (seronie @ icr . Fnclcc.fr) [1]
[1] Inserm U563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Departamento "Innovación Oncologie Moléculaire et Thérapeutique", Institut Claudius Regaud de Toulouse, Francia
[2] Universidad de Duke, del Centro Médico del Departamento de Farmacología y Biología del Cáncer, Durham, Carolina del Norte, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Bisfosfonatos que contienen nitrógeno (N-BPs) han sido diseñados para inhibir los osteoclastos mediada la resorción ósea. Sin embargo, ahora se acepta que parte de sus actividades de lucha contra el tumor está relacionado con la interferencia con la mevalonate pathway.

Métodos

Se investigaron los efectos del ácido zoledrónico (ZOL), en la proliferación de células y proteínas en dos isoprenilación tumoral (LnCAP, PC-3,), y uno normal establecido (PNT1-A) línea celular prostática. Para evaluar si la inhibición de la geranilado-geranylation por ZOL perjudica la actividad biológica de GTPasa RhoA, hemos realizado un estudio de la LPA inducida por la formación de fibras de estrés. El efecto inhibidor de ZOL sobre geranilado geranilado transferasa I se verificó bioquímicamente. Actividad de ZOL sobre la biosíntesis de colesterol está determinado por la medición de la incorporación de 14 C mevalonate en colesterol.

Resultados

ZOL inducida dependiente de la dosis de inhibición de la proliferación de las tres líneas celulares a pesar de que parecía más eficaz en la untransformed PNT1A. Cualquiera que sea la línea celular, el 20 μ M ZOL inducida por la inhibición se invirtió por geranilado-geraniol (GGOH), pero ni por farnesol ni mevalonate. Después de 48 horas de tratamiento de las células con 20 μ M ZOL, geranilado-geranylation de Rap1A se abolió que farnesylation de HDJ-2 no fue afectado. La inhibición de la Rap1A geranilado-geranylation por ZOL fue rescatado por GGOH y no por FOH. En efecto, como se observó con el tratamiento por un geranilado geranilado-Inhibidor de tratamiento de las células PNT1-A con 20 μ M ZOL impedido a la LPA inducida por la formación de fibras de estrés. Hemos comprobado que in vitro ZOL no inhibió geranilado-geranilado-transferasa I. ZOL inhibió de la biosíntesis del colesterol de hasta 24 horas, pero a las 48 horas el 90% de esta biosíntesis fue rescatado.

Conclusión

Aunque el ácido zoledrónico es actualmente el más eficiente bifosfonato en el cáncer de próstata metastásico de gestión, su mecanismo de acción en las células de próstata sigue siendo poco clara. Sugerimos en este trabajo que, si bien en primera intención ZOL inhibe FPPsynthase sus principales biológica actitivity está dirigido contra la proteína Geranylgeranylation.

Antecedentes

Los bifosfonatos (BPs) se han utilizado en la práctica oncológica por muchos años para reducir las complicaciones esqueléticas y dolor especialmente durante el mieloma y la fase metastásica de los cánceres de mama y de próstata. Durante muchos años sus huesos sugiere la orientación que el principal mecanismo de acción de BPs se inhibición de la resorción ósea por los osteoclastos efectos directos sobre las células óseas o de otro tipo en el microambiente de los osteoclastos inmediata [1]. El retraso en la generación de BPs tienen una nitrógeno que contienen alifáticos de cadena lateral (pamidronato, alendronato, ibandronato) o anillo heterocíclico (zolendronato). Su anti-resortiva potencia es hasta 1000 veces mayor que la de la no-amino BPs y que ejercen sus efectos celulares por injerencia en el mevalonate (MVA) vía [2]. Muchos estudios han investigado la naturaleza de los objetivos enzimáticos de la N-BPs dentro de la vía de la AMEU. In vitro, escualeno sintetasa de la actividad era la que se verán afectados por algunos N-BPs pero ni por ni el pamidronato alendronato [3]. Más recientemente, farnesyl-pirofosfato sintetasa (PPC) se propuso como principal objetivo enzimática de alendronato, risedronato, ibandronato, el pamidronato y in vitro [4 - 6]. Algunos autores sugieren que isopentenyl isomerasa (IPP) también podría ser inhibida por N-BPs novela [4, 5]. In vivo, algunos estudios confirman la hipótesis de una inhibición de la sintetasa del PPC porque la apoptosis [7 - 9] y la activación de la caspasa [7] inducida por varias N-BPs se invirtió por adición de FPP y GGPP o de la célula-permeable análogos, farnesol ( FOH) y geranilado-geraniol (GGOH). Por el contrario, los últimos estudios in vivo, sugiere que la inhibición de la vía por mevalonate N-BPs encuentra abajo el PPC síntesis paso y, de hecho, varios celulares efectos de la N-BPs, como la inhibición de osteoclastos formación [10], la inhibición de la migración de células de cáncer de ovario [11] o la inhibición de la invasión de células de cáncer de mama [12] se habían invertido sólo por GGOH pero no por FOH. Cualquiera que sea el objetivo enzimática (s) de la N-BPs de acuerdo en la mayoría de los informes anteriores que sugieren que la acción de la N-BPs resultados en el deterioro de la isoprenilación de proteínas en los osteoclastos del hueso o explantes [4, 5, 8, 10, 13, 14] como Así como en las líneas celulares tumorales [9, 12, 15 - 17]. No queda claro si la proteína farnesylation y geranilado-geranylation son igualmente afectados por la N-BPs. Algunos datos recientes sugieren que geranilado-geranylation, especialmente de Rho GTPasas, puede ser el blanco principal de su lucha contra el invasor efecto [11, 12] aunque su efecto apoptótico puede estar relacionado con la inhibición de Ras farnesylation [16, 17].

En las células tumorales de próstata, pocos estudios han investigado los efectos celulares o moleculares de la N-BPs, mientras que el zolendronato (ZOL) y el pamidronato (PAM) son ampliamente utilizados para prevenir complicaciones esqueléticas del cáncer de próstata y la terapia de privación de andrógenos [18, 19]. Tras el informe de la inhibición de la invasión de células de carcinoma de próstata por varias N-BPs, incluyendo ZOL [20], PAM y se ZOL demostrado inhibir el crecimiento ampliamente utilizado en tres líneas celulares de próstata, PC-3, UD-145 y LNCaP [21 ]. La actividad antitumoral de alendronato, y ZOL PAM fue correlacionada con sus MWA inhibición de la vía en las células de próstata [15, 17], favoreciendo la hipótesis de una inhibición de la síntesis PPC, proteína geranilado geranylation-No se ha evaluado, aunque parece más GGOH FOH eficaz que rescatar a la apoptosis inducida por ZOL.

En el presente trabajo se investigó i) el efecto de ZOL y MVA-metabolitos derivados sobre tumoral y normal inmortalizado línea de la proliferación celular prostática, ii) la modificación introducida por el ZOL de prenylation estado de farnesylated (HDJ-2) y geranilado-geranylated ( Rap1A) las proteínas en las células de próstata, iii) el impacto de ZOL sobre la actividad biológica de un geranilado-geranylated proteína, RhoA; vi) el efecto de ZOL sobre la biosíntesis de colesterol.

Métodos
Materiales y productos químicos

Todo el material para el cultivo de células fue de Dutcher (Brumath, Francia). El crecimiento de los medios de comunicación se compraron Cambrex Bio Science (Verviers, Bélgica) y suero de ternera fetal (FCS) de Invitrogen (Cergy-Pontoise, Francia). El ácido zoledrónico [hidratado sal disódica de 2 - (imidazol-1-il)-hidroxil-etileno-1 ,1-ácido bisphosphonic)] fue suministrado por Novartis Pharma AG (Basilea, Suiza). Disponibilidad de soluciones (4 mM) se prepararon en buffer fosfato salino (PBS) alícuotas y se almacenaron a -20 ° C para ser diluido en medio de cultivo antes de los experimentos. Peptidomimetic prenyl-transferasa inhibidores de la IFA 277 y GGTI 298 [22, 23] fueron un generoso regalo de Pr S. Sebti (Tampa, Florida). Disponibilidad de soluciones (100 mM) se prepararon en DMSO-10 mM TDT alícuotas y se almacenaron a -20 ° C para ser diluido en medio de cultivo antes de los experimentos. Y27632 se adquirió de Calbiochem (La Jolla, California). Mevalonate (existencias MVA = 200 mM), el trans-transfarnesol (FOH; soluciones stock 100 mM en etanol, almacenado a -20 ° C), geranilado-geraniol (GGOH; soluciones stock 100 mM en etanol almacenados a -20 ° C), Escualeno (existencias soluciones de 100 mM en etanol almacenados a -20 ° C FOH), Colesterol, L-α-ácido lysophosphatidic (LPA) y paraformaldehído (PFA) fueron adquiridos de Sigma Aldrich (St Quentin Fallavier, Francia). [14 C]-mevalolactone (56Ci/mmol. Actividad específica) fue de Perkin-Elmer.

Líneas celulares de próstata

LNCaP células tumorales de próstata son las células que expresan una activa pero mutado (T877A) del receptor de andrógenos. En virtud de la estimulación androgénica, estas células producen antígeno específico de la próstata (PSA). PC-3 son las células tumorales de próstata, que no son sensibles a la estimulación androgénica. El PNT1-Una línea celular fue desarrollado por Cussenot et al. [24]. Las células son las células epiteliales normales inmortalizada por SV-40. Expresan el tipo salvaje del receptor de andrógenos pero, en virtud de la estimulación androgénica in vitro, que no secretan PSA en el medio de cultivo. Las tres líneas celulares fueron comprados a partir de la Colección Europea de la Cultura Cell (PC-3: # 90112714; LNCaP clon FCG: # 89110211; PNT1A: # 95012614).

Prostático líneas celulares eran rutinariamente crecido tanto en RPMI 7% FCS (PC-3 y PNT1-A) o en RPMI 10% FCS complementado por 10 mM Hepes y 1 mM piruvato sódico (LNCaP). Todas las células fueron incubadas a 37 ° C en un 5% humidificado incubadora de CO 2.

Proliferación de ensayo colorimétrico

Proliferación se determinó por un ensayo colorimétrico con sulforhodamine descrita por Skehan [25]. Las células fueron sembradas en 96 pozos placas microtiter a obtener finalmente el 80% en la confluencia de control de los pozos. Al final del periodo de tratamiento, las células fueron fijadas con TCA (1 h, 4 ° C) y, a continuación, manchadas de 0,4% sulforhodamine. Después de cuatro lavados con ácido acético al 1% para eliminar los tintes sin encuadernar, las placas se secaron y proteína determinada tinte fue extraído con Tris (10 mM, pH = 10,5). Coloración se cuantificó a 540 nm en una placa microtiter (Multiskan ® Multisoft, Labsystems)

Prenylation análisis de la condición de

Las células se desprendieron entonces lisadas con 150 μ l de buffer de lisis [20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 1% Tritón X-100, 10 mM MgCl 2, 5 mM EDTA, 20 mM NaF, 10 mM PNPP, 2 mM Na Orthovanadate, y de un cóctel de inhibidores de la proteasa (Sigma, Francia, el final de dilución 1 / 100). Las proteínas fueron cuantificados en extractos celulares de un ensayo de Bradford. Cinco a cuarenta μ g de proteína despejado extractos fueron separados en un 12,5% en gel de poliacrilamida-SDS y luego trasladado a un Hybond-P polyvinyldifluoride membrana (Amersham Biosciences). Después de pre-incubación con TBST (25 mM Tris, 140 mM NaCl, 0,1% de Tween 20, pH 8) suplementado con 5% de la leche sin grasa, las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C con el anticuerpo primario diluido en TBST 1% Leche. Después de tres lavados con TBST, las membranas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario marcado por peroxidasa. El anticuerpo se visualiza utilizando el sistema ECL Plus (Amersham Biosciences) y luminiscencia cuantificados con Phophorimager ® (Molecular Dynamics).

Los siguientes anticuerpos primarios fueron utilizados: anti-HDJ2 Ab-1 anticuerpo monoclonal de ratón (Interchim; clon KA2A5.6, diluido 1 / 10000), anti-prenylated Rap1A C17 anticuerpo policlonal de cabra (TEBU; ref SC-1482, diluido 1 / 2000 ), La lucha contra la total Rap1A-Krev1 anticuerpo policlonal de conejo (TEBU; ref SC-65, diluted1/1000). Los siguientes peroxidasa etiqueta secundaria de anticuerpos fueron utilizados, todos diluido 1 / 10000: anti-ratón (Biorad, ref 170-6516) anti-cabra (Santa Cruz, ref sc-2033) o anti-conejo (Biorad, ref 170-6515 ).

Visualización citoesqueleto de actina por microscopía de fluorescencia

En el día 0 (D0), PNT1-A células fueron sembradas en coverslips en vidrio de 6 placas para obtener así un 60% confluencia en el día 3 (D3). El día 1 (D1), el suero de las células son de hambre hasta el tratamiento de D3. Después de la exposición a diferentes drogas y, a continuación, después de la estimulación por LPA (20 μ M, 5 horas del D3), las células fueron fijadas con paraformaldehído 3% / PBS por 20 minutos y luego permeabilized con 0,1% Triton-X-100/PBS por 5 minutos . Para visualizar las fibras de actina, la coverslips fueron incubadas con isotiocianato tetramethylrhodamine-etiquetados phalloidin (Molecular Probes) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron vistos en un microscopio Zeiss Axiophot y de las imágenes tomadas con una cámara de Princeton.

In vitro farnesyl transferasa (FTase) y geranilado-geranilado-transferasa I (GGTase I) de la actividad de medición

Para investigar el efecto inhibidor putativo de ZOL sobre prenyl-transferasa actividad, in vitro prenylation ensayos se realizaron. Como sustrato de las proteínas, hemos utilizado bacterially expresó silvestres de tipo H-Ras de proteínas para FTase ensayo y CVLL-H-Ras proteína mutante (geranilado-geranylated forma) para GGTase I de ensayo. 1 μ M sustrato de las proteínas se incubaron con [3 H]-prenyl pirofosfato (0,25 μ M concentración final, la actividad específica 8-10 Ci / mmol, American Radiolabeled productos químicos) y, o bien recombinante FTase o recombinante GGTase I (50 ng) en un medio que contiene una reacción 50 mM Tris, pH 7,7, 20 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 2 mM de TDT, y 5 μ M ZnCl 2. El volumen de reacción fue de 50 μ l. Reacciones procedió durante 10 min a 30 º C y fueron detenidos por la adición de 0,5 ml de SDS 4%. Proteínas totales fue precipitada por la adición de 0,5 mL de ácido tricloroacético al 30%. Después de 20 min, las muestras fueron filtradas a través de 25-mm de filtros de fibra de vidrio (Schleicher y Schuell), que obligaba al prenylated proteína dejando unprenylated proteínas y exceso de prenyl grupos que pasar por el filtro. Tubos de reacción se lavaron con 2 × 2 mL de SDS 4% más el 6% de ácido tricloroacético, y los depósitos, se han añadido a los filtros. Encuadernación proteína fue lavada con otros 4 mL de SDS 4% / 6% de ácido tricloroacético, y 3 × 2 mL de ácido tricloroacético al 6%. Después de secado, de la radiactividad obligado a los filtros se contó en un scintillation counter. Controles negativos se realizaron sin la utilización de proteínas o enzimas sustrato que previamente se inactiva por una incubación de 5 min a 90 ° C. Cada sustrato de la proteína se reaccionó en condiciones estándar con vehículo, Inhibidor específico o ZOL. El nivel de prenylation se expresa como un porcentaje máximo de incorporación de [3 H]-prenyl para cada sustrato, según lo determinado por permitir que el desinhibido reacción a ir hasta el final.

[14 C] de la biosíntesis del colesterol en las células PC3

El experimento se llevó a cabo tal y como se describe por Awad [26]. En pocas palabras, PC3 células fueron sembradas en placas de 6-y así tratados con ZOL para 2, 22, 46 horas y [14 C]-mevalolactone (2,25 μ Ci / ml) se añadió a la mediana por 2 horas más, el medio fue removido , Las células se lavan dos veces con PBS, y se trata por 1 ml de NaOH (2 M). La mezcla se incubó a 37 ° C durante 30 min. Y luego 0,5 ml de metanol con 100 μ g de colesterol no radiactivos se añadieron. Saponificación se llevó a cabo a 70 ° C durante 1 hora y unsaponified lípidos se extrajeron hexano tres veces. Después del secado (en virtud de argón) los "pellets" se disuelve en cloroformo y separados por cromatografía en capa fina (gel de sílice F / acetato de etilo). [14 C]-Colesterol fue revelado y cuantificado por autorradiografía con Phophorimager ® (Molecular Dynamics).

Resultados
El ácido zoledrónico inhibe la proliferación de LNCap, PC-3 y A-PNT1 células

El efecto de ZOL sobre el crecimiento celular se evaluó en las tres líneas celulares de próstata: las células fueron tratadas desde D1 a D5 con ZOL de 5 a 20 μ M. La proporción frente a la proliferación de pozos de control fue evaluado por un ensayo colorimétrico sulforhodamine. Los resultados se muestran en la figura 1. ZOL inhibe la proliferación de las tres líneas celulares de forma dosis-dependiente. La falta de línea celular tumoral PNT1-A fue más afectados (IC 50 = 11 μ M). PC-3 células mostró una sensibilidad intermedia (IC 50 = 18 μ M) y las células LNCaP que parecía ser el más resistente (IC 50> 20 μ M). Estos resultados coinciden con los obtenidos anteriormente por otros de crecimiento [21, 27] o [15] la viabilidad de DU145, PC-3 y LNCaP en presencia de ZOL. Además, el presente trabajo muestra que ZOL es más eficaz en la inhibición del crecimiento de las células de la línea celular untransformed-A PNT1.

La inhibición de la proliferación por ZOL se invierte por geranilado-geraniol

N-BPs se han descrito para interferir con la mevalonate pathway. Por lo tanto, investigamos si la inhibición de la proliferación observada con 20 μ M ZOL podría ser revertido por metabolitos de la vía MVA: VAM (100 μ M), el precursor de todos los esteroles y no isoprenoids esteroles, escualeno (SQUA, 100 μ M), el precursor Isoprenoids cíclico de esteroles es decir, farnesol (FOH, 10 y 20 μ M) y geranylgeraniol (GGOH, 10 μ M). A diferencia de FPP y GGPP, gratis isoprenols FOH y GGOH son capaces de entrar en las células con facilidad [28], por lo tanto, pueden ser utilizados para prenylation de salvamento a través de un itinerario. Las células fueron sembradas a lo descrito previamente y tratada cada 48 horas con 20 μ M ZOL en la presencia o ausencia de los distintos metabolitos de D1 a D5. Los resultados se muestran en el gráfico 2. En cuanto a la sensibilidad diferencial de las tres líneas celulares a ZOL, los resultados fueron similares a los obtenidos con anterioridad, aunque dos días de la exposición ya dio lugar a una mayor inhibición del crecimiento de células con 20 μ M ZOL. En las concentraciones utilizadas, ninguno de los productos derivados de la AMEU alterado la proliferación (datos no presentados). Además, ni MVA, SQUA, o FOH podría revertir la inhibición de la proliferación inducida por 20 μ M ZOL. En cambio, GGOH completamente rescatados de la proliferación de las tres líneas de células de la próstata cuando se añade al medio de cultivo al mismo tiempo que 20 μ M ZOL. Sin embargo, la reversión de ZOL inducida por la inhibición de la proliferación por GGOH pero no por FOH no está de acuerdo con el objetivo de bioquímica ZOL, PPC sintasa.

ZOL perjudica in vivo geranilado-geranylation de Rap1A sin menoscabar farnesylation de HDJ-2

Para investigar los efectos de ZOL sobre farnesylation y geranilado-geranylation, analizamos i) Rap-1A, exclusivamente geranilado-geranylated pequeña GTPasa implicados en la regulación de la transmisión de la señal de Ras, ii) HDJ-2, exclusivamente farnesylated acompañante co - Proteína clásicamente utilizado como un marcador de FTase inhibición [29]. Western-blot análisis de estas proteínas se realizaron después del tratamiento por 20 μ M ZOL, o por peptidomimetic inhibidores específicos de farnesylation (IFA-277) o geranilado-geranylation (GGTI-298). Los resultados se muestran en la figura 3. Tratamiento por IFA 277 (10 μ M, 48 horas) se debió, como se esperaba, en la acumulación de la unfarnesylated HDJ-2 que migra más lento que el farnesylated formas. Por el contrario, los tratamientos con GGTI-298 o ZOL (20 μ M, 48 horas) no modificó HDJ-2 farnesylation. En este momento estamos en tela de juicio la eficacia in vivo de ZOL sobre la vía mevalonate y decidió a buscar sus efectos sobre las proteínas geranilado-geranylation.

ZOL perjudica Rap1A geranilado geranylation-GGPP mediante la prevención de la producción y no GGPP incorporación a la proteína

De hecho, existe una analogía estructural entre el bifosfonato radical de ZOL y el pirofosfato grupo de células de sustratos FTase y GGTases, respectivamente FPP y GGPP, y algunos de los análogos de bisfosfonatos se PPC demostrado inhibir FTase [30]. Para impugnar estas dos hipótesis, que pusieron a prueba la capacidad de ZOL para prevenir GGPP incorporación en sustrato proteínas in vitro e in vivo. Los resultados se muestran en la figura 4. In vitro, que mide la actividad GGTase I, en la ausencia o presencia de 10 y 50 μ M ZOL. A diferencia de GGTI-298, que suprime totalmente la actividad GGTase I, ZOL no afectar la actividad enzimática de GGTase I (figura 4A]. También se verificaron ZOL que no limitó la actividad enzimática de FTase (datos no presentados). En vivo, GGOH utilizados como sucedáneo de GGPP, porque se ha demostrado que puede GGOH rescate Rap1A geranilado-geranylation en células tratadas con lovastatina, [31]. En células de la próstata, de rescate de Rap1-A-geranilado geranylation se obtuvo cuando el 10 μ M GGOH se añadió al mismo tiempo a 20 μ M ZOL. Esta recuperación se observó ni después ZOL / FOH incubación, ni después de GGTI / GGOH incubación (figura 4B].

Así, la inhibición de la geranilado-geranylation por ZOL parece el resultado de un bloqueo en la síntesis de GGPP de PPC en lugar de la inhibición de la transferencia enzimática de la proteína GGPP en su sustrato.

ZOL perjudica LPA inducida por la formación de fibras de estrés, un celular dependiente de RhoA geranilado-geranylation

RhoA es una pequeña GTPasa, que es exclusivamente geranilado-geranylated. RhoA geranilado geranylation-es crucial para su actividad biológica, en especial para su actividad específica en la formación de fibras de estrés en virtud de LPA estimulación [32]. Por este motivo, investigó el efecto de ZOL en la formación de fibras de estrés inducido por estimulación LPA. Entre las tres líneas celulares de próstata, sólo PNT1-A células forman un estrés fácilmente detectable la red de fibra óptica en respuesta a la LPA. Por lo tanto, hemos elegido esta línea celular para el experimento. PNT1-A células fueron cultivadas como se ha descrito anteriormente y estimulado por 25 μ M LPA durante 5 horas. En estas condiciones, el estrés numerosas fibras apareció (fig 5B1 y 5B2]. Con un tratamiento previo por Y27832 (10 μ M, 10 min), un inhibidor de kinasa Rho, el estrés de fibra de inducción fue totalmente abolida (figura 5C]. Del mismo modo, cuando PNTI-A células fueron tratadas con GGTI-298 (10 μ M, 24 horas) antes de la estimulación LPA, el estrés no parece fibras (figura 5D]. Cuando PNT1-A células fueron tratadas por ZOL (20 μ M, 48 horas) antes de la estimulación LPA, el estrés de fibra formación también fue totalmente abolida (fig 5E]. Por lo tanto, sugerimos que la inhibición de la geranilado-geranylation por ZOL afecta a la actividad biológica de las proteínas geranylated geranilado-, como se indica en este documento de la pequeña GTPasa RhoA.

ZOL Inhibe la biosíntesis del colesterol hasta 24 horas

Cuatro horas de tratamiento de las células PC3 con ZOL 20 μ M inhibe la biosíntesis del colesterol total (Fig 6A], lo que sugiere que ZOL, como se informó anteriormente, puede inhibir la farnesyl pirofosfato sintetasa en el cruce de la vía mevalonate a la biosíntesis del colesterol o la isoprenilación de proteínas. Sin embargo, antes de 24 horas después, aproximadamente el 10% de la biosíntesis fue rescatado, hasta alcanzar el 90% después de 48 horas (Fig. 6]. Los mismos resultados se obtuvieron con LnCAP y PNT-1A (datos no presentados).

Discusión

Aunque el ácido zoledrónico se utiliza ampliamente en el cáncer de próstata metastásico de gestión, se dispone de pocos datos acerca de sus efectos moleculares en las células de próstata [15, 20, 21]. Nuestro trabajo muestra que, en células de la próstata, ZOL perjudica proteína geranilado-geranylation pero no farnesylation. Este resultado contrasta con el bien documentado in vitro de la inhibición de la sintetasa del PPC está representada por muchos N-BPs [4 - 6, 33] incluidos ZOL [33]. Sin embargo, resultados contradictorios acerca de la inhibición de la sintetasa del PPC por la N-BPs se han obtenido in vivo. De hecho, algunos estudios apoyan la inhibición de la sintetasa del PPC, alterar la PPC, GGPP y, en consecuencia, la producción [7 - 9, 15, 17], mientras que otros equipos de sugerir la existencia de un objetivo adicional enzimática de la N-BPs, aguas abajo de la sintetasa del PPC [ 11, 12, 34]. Nuestros resultados con ZOL prestar más apoyo a esta última hipótesis y corroboran otras dos obras efectuadas en mamario MDA-MB-231 [12] y de ovario Caov-3 [16] las líneas celulares tumorales. En el primer informe [12], se demostró que el efecto anti-invasiva de ZOL resultado de una inhibición de RhoA geranilado-geranylation. En tratada con alendronato Caov-3 células, Sawada et al. Rho mostró inhibición de la activación a través de GGPP agotamiento y sugirió que este representaba para la inhibición de la inhibición de la LPA inducida por el estrés de fibra, que se observó. Este efecto biológico es, por lo general relacionados con la actividad de RhoA.

Conclusión

En el presente trabajo se demuestra que las principales actividades biológicas de ZOL son sostenidos por su efecto inhibidor de la proteína-geranilado geranylation. Mostramos por el estudio de la biosíntesis del colesterol que esta alteración de geranilado-geranylation es tiempo-dependiente relacionado con una inhibición de la FPPsynthase seguido de, o simultáneamente, la inhibición de la GGPPsynthase. Los estudios in vitro demuestran que este efecto no está relacionado con la inhibición de la GGTase I

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Los autores de los contibutions a esta investigación se recogen en el orden en que aparecen, con la excepción de SSV, que supervisó la investigación y la preparación del manuscrito. MT MG llevado a cabo y la biología celular y CW estudios enzimáticos. AP, ILM proporcionado consejos útiles en estudios de inmuno-, JCF y SSV concibe el estudio y participaron en su diseño y coordinación. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final

Historia previa a la publicación

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Agradecimientos

Nosotros gracias C. Giamarchi útil para los debates y las contribuciones técnicas