Retrovirology, 2006; 3: 16-16 (más artículos en esta revista)

Propiedades antivirales trimeric de dos proteínas recombinantes gp41

BioMed Central
Delphine Delcroix-Genête (delcroix@cochin.inserm.fr) [1], Phenix-Quan Lan (pq2106@columbia.edu) [1], Marie-Gaëlle Roger (mariegaelleroger@proteinexpert.com) [3], Uriel Hazan ( Hazan@cochin.inserm.fr) [1], Sébastien Nisole (nisole.sebastien @ paris7.jussieu.fr) [1], Cécile Rousseau (ce.rousseau @ free.fr) [1]
[1] Instituto Cochin, Departamento de Enfermedades Infecciosas, 22 rue Méchain, 75014 París, Francia, el INSERM, U 567, CNRS, UMR 8104, Faculté de Médecine René Descartes, UMR 8104-S, 75014 París, Francia
[2] Mymetics Corporation, 14, rue de la Colombière, 1260 Nyon, Switzerland
[3] Protein'eXpert SA, 15, rue des Martyrs, 38027 Grenoble, France
[4] Université Paris 7 Denis-Diderot, UFR de Biochimie, 2 Place Jussieu, 75251 París, Francia

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Resumen
Antecedentes

Como es el primer paso del ciclo de replicación del VIH, el VIH entrada representa un blanco atractivo para el desarrollo de nuevos fármacos antivirales. En este contexto, los inhibidores de la fusión son la tercera clase de fármacos anti-VIH que se utilizarán para el tratamiento, en combinación con los análogos de nucleósidos y antiproteases. Pero el mecanismo exacto de la fusión del VIH mecanismo todavía no está claro. Ectodominio gp41-péptidos sintéticos derivados representan herramientas ideales para aclarar este mecanismo, con el fin de diseño más potentes fármacos anti-VIH.

Resultados

Dos trimeric soluble recombinante de las proteínas gp41, denominado Rgp41B y Rgp41A fueron diseñados. Ambos comprenden la N-y C-terminal heptad repetir regiones del ectodominio de VIH-1 gp41, conectado por un residuo de 7-hidrofílicos enlazador, con el fin de imitar la trimeric fusogenic estado de la glicoproteína transmembrana. Ambas proteínas recombinantes se han encontrado para inhibir la entrada del VIH-1 en las células diana en una forma dependiente de la dosis. Rgp41A, el más potente inhibidor, fue capaz de inhibir tanto X4 y R5 aislados en células HeLa y primaria de los linfocitos T. X4 virus resultaron ser más susceptibles que los aislados R5 a la inhibición por Rgp41A. Con el fin de dilucidar la forma en que la proteína gp41 recombinante trimeric puede interferir con la entrada del VIH-1 en las células diana, que además investigado su modo de acción. Rgp41A fue capaz de obligar a gp120, pero no indujo gp120-gp41 disociación. Además, este inhibidor también podría interferir en los finales de etapa de proceso de la fusión, a raíz de la mezcla de lípidos.

Conclusión

En conjunto, nuestros resultados sugieren que Rgp41A puede unirse a la gp120 y también interferir con un evento tardío proceso de la fusión. Curiosamente, Rgp41A puede bloquear fusión de membranas sin impedir la mezcla de lípidos. Aunque más trabajo será necesaria para comprender plenamente su modo de acción, nuestros resultados sugieren que ya Rgp41A puede interferir con varios pasos de la entrada del VIH.

Antecedentes

El descubrimiento de compuestos antivirales potentes en la década de los 90 suscitó esperanzas de la erradicación del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Sin embargo, el SIDA sigue siendo un importante problema de salud en todo el mundo y, a pesar de la considerable éxito de la terapia antirretroviral de gran actividad (TARGA), la identificación de nuevas dianas para la terapia es muy necesaria [1, 2]. En efecto, si bien el éxito actual de las drogas en la disminución y el control de la replicación viral, la erradicación completa del virus todavía está fuera de su alcance [3, 4]. La persistencia del virus incluso después de largos períodos de tratamiento principalmente el resultado de la presencia de reservorios celulares que contienen virus latentes transcriptionally competentes capaces de producir nuevas partículas infecciosas después de la activación celular [4 - 6]. Estas células con infección latente son una fuente permanente de virus que dan lugar a un rebote de la carga viral después de la interrupción del TARGA [3, 7]. Además, los pacientes a menudo detener el tratamiento debido a la aparición de efectos secundarios y la resistencia viral a menudo se desarrolla, lo que hace una o más de la ineficacia de las drogas. Ahora está claro que un tratamiento eficaz contra el VIH requerirá el uso de múltiples drogas dirigidos a diferentes etapas de la replicativa del VIH-1 ciclo. En este contexto, la entrada del VIH representa un blanco atractivo, como es el caso antes de la infección ciclo [1, 8].

La entrada del VIH es un proceso que implica múltiples interacciones complejas entre las glicoproteínas de la cubierta del virus y los receptores de las moléculas expresadas en la superficie de las células diana [9 - 11]. Sobre las glicoproteínas de trimers consisten de dos subunidades noncovalently asociados, gp120 y gp41, generada por la división proteolítica de la proteína precursora, la gp160. Considerando que la superficie de la subunidad, gp120, es responsable de la unión a los receptores de la superficie celular, CD4 y un receptor de quimioquinas, la glicoproteína transmembrana, gp41, promueve directamente la fusión de las membranas viral y celular, lo que permite al núcleo viral para entrar en el citoplasma de la meta Células [9, 11].

El ectodominio de la gp41 contiene un hidrofóbico N-terminal, denominado péptido de fusión [12], y dos regiones heptad repetir, N-HR y HR-C (también designado N36 y C34) que se encuentran en la N-y C-terminal Ectodominio de la gp41, respectivamente [13, 14]. La unión de gp120 secuencial a los receptores celulares provoca cambios conformacionales en la gp41, que adopta una conformación conocida como la pre-horquilla estado intermedio, para la inclusión de la hidrofóbico N-terminal de péptidos de fusión en la membrana de la célula objetivo. Posteriormente, la N-y C-terminal heptad repetir segmentos antiparallel veces en una manera de crear un paquete de seis hélice (6HB) compuesto de un interno trimeric en espiral-bobina de N-terminal rodeada por tres hélices C-terminal HR hélices que pack En las ranuras en espiral de la bobina [15 - 18]. Esta transición de la prehairpin estado intermedio a la estructura estable 6HB trae la membranas celulares y virales en las proximidades y permite la fusión de membrana [19, 20].

Los péptidos sintéticos correspondientes a la N-HR y HR-C de gp41 bloquear la fusión y la infección viral por medio de la unión transitoria expuestos a la gp41 durante HRs de cambios conformacionales, lo que impide 6HB formación [21]. C-péptidos se basan en la gp41 C-HR secuencia y meta la N-HR [22, 23], mientras que la N-HR se cree péptidos derivados de obligar a la C-HR [24, 25]. Ambas N-y C-HR péptidos derivados son capaces de bloquear la fusión inducida gp41, pero C-péptidos son más potentes inhibidores. T-20 (también conocido como DP-178, o Enfuvirtide Fuzeon ®) es un péptido sintético correspondiente a 36 residuos conservados dentro de C-HR. Este péptido inhibe potentemente la entrada viral y la fusión de membranas de las dos cepas de laboratorio adaptado y primaria aislados de VIH-1 [26, 27], y fue el primer inhibidor de la fusión del VIH que se aprobó para el tratamiento de la infección por VIH-1 (para una revisión, ver [28]]. Este inhibidor se cree para prevenir la formación de 6HB por su unión a la N-HR de gp41 [21, 29]. Sin embargo, como para otros agentes anti-VIH, surgen cepas resistentes [26, 30], subrayando la necesidad de nuevos inhibidores de la fusión del VIH. Tales inhibidores representaría herramientas ideales para investigar más a fondo los mecanismos implicados en la gp41 mediada por la fusión y puede abrir nuevas vías para el desarrollo de fármacos anti-VIH.

En este estudio, se presenta el diseño de dos soluble gp41 derivados trimeric proteínas recombinantes producidos en E. Coli, que fueron calificadas como Rgp41A y Rgp41B. Cada una de estas dos proteínas están constituidas de un dominio N-abarca la N-HR (N36) y un dominio C-que abarca la C-HR (C34), asociadas a través de un residuo de 7-enlazador. Ambas proteínas recombinantes veces espontáneamente en trimers e inhiben la entrada del VIH-1 en las células diana en una forma dependiente de la dosis. Rgp41A, el más potente inhibidor, fue capaz de inhibir la entrada de ambos virus X4 y R5 aislados en HeLa-CD4 o HeLa-CD4-CCR5 en las células o linfocitos T primaria. Sin embargo, como ha sido descrito previamente para la T-20 [31 - 33], Rgp41A es un inhibidor más potente contra el virus X4. Con el fin de dilucidar el mecanismo por el cual Rgp41A interfiere con el VIH-1, la entrada en las células diana, que además investigado su modo de acción. Nos muestran que Rgp41A es capaz de obligar a gp120 vinculante, pero esto no parece inducir gp120-gp41 disociación. Además, nos muestran que este inhibidor interfiere con el paso de la tarde el proceso de fusión, a raíz de la mezcla de lípidos. En conjunto, nuestras observaciones sugieren que Rgp41A inhibe la entrada del VIH-1 al actuar en las distintas etapas del proceso de inscripción.

Resultados
Caracterización de proteínas recombinantes

Dos proteínas recombinantes derivados de la pandemia del VIH-1 ectodominio gp41 se han diseñado con el fin de imitar la trimeric fusogenic estado de VIH-1 ectodominio gp41 y se conocen como Rgp41A y Rgp41B. Rgp41A N-implica un dominio de 59 residuos, que abarca la N-HR (péptido o N36) y un C-54 dominio de los residuos, incluida la C-HR (o péptido C34), mientras que el N y C-dominios son de Rgp41B 53 y 47 aminoácidos de longitud, respectivamente. Además, trece (Rgp41A) o veinte cinco (Rgp41B) aminoácidos se han suprimido entre la N y C-dominios, incluido el puente disulfuro. Esta brecha fue entonces sustituido por un enlazador hidrofílico (NH2 SGGRGGS COOH) para el mantenimiento de la N y C-dominios conectados. Una etiqueta 6xHIS se añadió en el C-terminal final de las dos construcciones (LEHHHHHH) con el fin de permitir su depuración inmovilizados por cromatografía de afinidad por iones metálicos (IMAC). Figura 1A muestra una representación esquemática de las dos construcciones. SDS-PAGE análisis de Rgp41A purificada y Rgp41B reveló aparente pesos moleculares de 15 y 14 kD, respectivamente (Figura 1B]. Ambas proteínas recombinantes fueron analizados por la filtración de geles con el fin de determinar su estado oligomeric. Como se muestra por sus perfiles de elución en una columna Superdex 75, que corresponde a un peso molecular aparente de 50 kDa, ambas proteínas a veces aparecen espontáneamente en trimers. Como era de esperar, los espectros de dicroísmo circular de las dos proteínas recombinantes trimeric confirmó la presencia de una alta proporción de α-hélice (no se muestra) [17, 18].

Gp41 recombinante de las proteínas inhiben la entrada del VIH-1 en las células CD4 + HeLa

Gp41 recombinante de las proteínas se probaron primero por su capacidad de inhibir la infección de células HeLa P4.2 por aislados del VIH-1. En la primera serie de experimentos, a análisis en la dependiente de la concentración de efecto inhibidor Rgp41A y Rgp41B sobre el VIH-1 partículas pseudotyped con el sobre las glicoproteínas de la X4 aislar el VIH-1 o la LAI R5 cepa de VIH-1 de ADA. Con este fin, los virus se mezcla con dosis crecientes de proteínas recombinantes antes de la infección. Las células fueron incubadas con la mezcla de 4 h y enjuagarse varias veces para eliminar virus y libre proteínas recombinantes. Después de una incubación de 48 horas a 37 ° C, el virus de replicación se calcula midiendo luciferase actividad en extractos de células. Desde los buffers usados para la solubilización de proteínas recombinantes gp41 mostró algunas efecto citopático, que dio lugar a un descenso de la artefactual luciferase señal, el efecto inhibidor de proteínas recombinantes fue sistemáticamente en comparación con el mismo volumen de buffer. La Figura 2 muestra los resultados de un experimento típico. Ambas construcciones, inhibió la entrada de la X4 pseudotyped virus en la célula huésped, mientras que sólo Rgp41A tiene la capacidad de inhibir también la entrada de partículas pseudotyped con R5 ADA Env. Como era de esperar, gp41 derivados de las proteínas trimeric no tuvo ningún efecto sobre el virus de estomatitis vesicular (VSV)-pseudotyped sobre los virus (no se muestra). IC50 valores se calculan a partir de estas curvas y se informa en la Tabla 1. Rgp41 mostró IC50 valores de 56 y 156 nM para el VIH-1 LAI y ADA-pseudotyped virus, respectivamente. Rgp41B tiene una IC50 valor de 429 nM para LAI-pseudotyped virus. Similares experimentos se realizaron en el laboratorio-X4 adaptado virus VIH-1 LAI y NDK o R5 del VIH-1 y YU2 ADA. En cuanto a pseudotyped virus, Rgp41A mostraron un mejor efecto inhibitorio que Rgp41B. Los resultados se resumen en la Tabla 1. Sorprendentemente, mientras que Rgp41A mostró un IC50 valor de 156 nM sobre ADA pseudotyped partículas de VIH-1, que no mostró efecto inhibitorio sobre el correspondiente tipo salvaje del virus VIH-1 ADA. En cambio, Rgp41A efectos inhibidores sobre la X4 cepa del VIH-1 y NDK el R5 cepa del VIH-1 se YU2 débil, pero significativa, con valores de CI50 de 844 y 489 nM, respectivamente. Asimismo, figuran para la comparación en el cuadro 1 son los valores de IC50 T-20 en cada virus. Este inhibidor es aproximadamente 25 veces más eficaz que Rgp41A para bloquear el VIH-1 LAI entrada en células HeLa-CD4. En consonancia con los datos anteriores, la T-20 no es tan eficaz en R5 aislados, como YU2 y ADA, como en la X4 virus, como el VIH-1 LAI y NDK [31].

Rgp41A también bloquea la entrada de virus X4 en PBL

Propiedades antivirales de la Rgp41A fueron probados en la PBLs de infección por el VIH-1 de laboratorio de cepas adaptadas. Similares experimentos se realizaron en paralelo con T-20 (Tabla 2]. En este modelo, el Rgp41A significativamente bloqueado la entrada de X4 virus en la célula huésped, pero no tuvo ningún efecto sobre los virus R5 a prueba, lo que sugiere que las propiedades antivirales de la Rgp41A no sólo dependen de la cepa de virus, sino también en el tipo de células. Cálculo de los valores IC50 (Cuadro 2] reveló que el VIH-1 NDK fue de aproximadamente 4 veces más susceptibles a la inhibición por el T-20 que por Rgp41A. IC50 valores de la Rgp41A sobre el VIH-1 LAI y NDK son 356 y 322 nM, respectivamente.

Rgp41A pueden interactuar con gp120 soluble monomérico

Con el fin de determinar el mecanismo de acción de los más potentes trimeric proteína recombinante, Rgp41A, primero a prueba su capacidad de obligar a VIH-1 gp120. Algunos VIH-1 inhibidores de la entrada del acto por medio de la unión de glicoproteínas en el sobre a fin de interferir con su interacción con los receptores celulares. Este es el caso de sCD4 y también para la T-20, que acaba de poner de manifiesto al interactuar con gp120 del virus X4, y en menor medida con gp120 de virus R5 [33]. Esta interacción probablemente contribuye al mecanismo por el que T-20 bloquea la entrada de virus X4 en la célula huésped [33]. Desde ambos Rgp41 construye C34 contienen la secuencia de los T-20, que puso a prueba su capacidad de interactuar con un monómero soluble recombinante gp120 de la X4 virus VIH-1 IIIB. A tal fin, placas de 96 pozos fueron recubiertos con varias dosis de la Rgp41 proteínas y, a continuación, se incubaron con las monomérico gp120. El importe de gp120 obligado a Rgp41 proteínas se determinó utilizando anticuerpos anti-gp120. Como se muestra en la Figura 3, el monómero gp120 obligado a ambos Rgp41 proteínas en una forma dependiente de dosis. Curiosamente, Rgp41B mantenerse significativamente menos gp120 que Rgp41A, lo que sugiere una mayor afinidad de la gp120 de Rgp41A que para Rgp41B.

Rgp41A no induce la liberación de gp120 de células HeLa que expresan sobre el VIH

Desde gp41 recombinante parece ser capaz de interactuar con un monómero soluble gp120, que investigó si esta interacción podría conducir a la liberación gp120 de la superficie del virus. Ese fenómeno ha sido reportado en sCD4 y propuestas para explicar al menos una parte de sus propiedades antivirales [37 - 39]. Para probar gp120 derramamiento inducida por gp41 recombinante, que expresa la células HeLa env gen de la LAI virus (HeLa-LAI) se incubaron con Rgp41A o sCD4. Después de la incubación, la cantidad de gp120 presente en el sobrenadante se determinó por ELISA. Como se muestra en la figura 4, Rgp41A no indujo la liberación de gp120 de la LAI células HeLa-, en comparación con el control, mientras que sCD4 inducida por la liberación de una cantidad significativa de gp120. Este resultado sugiere que Rgp41A inhibe la entrada del VIH en la célula huésped por un mecanismo que no implique derramamiento gp120.

Rgp41A inhibe la fusión entre células que expresan el gen env objetivo y células que expresan receptores de VIH

Como célula a célula experimentos de la fusión podría ser conveniente modelos para analizar el mecanismo por el que las proteínas Rgp41 inhibir la entrada del virus en la célula huésped, que pusieron a prueba la eficacia de Rgp41A para inhibir la fusión entre células HeLa que expresaban el gen env de diversas cepas del VIH (HeLa - Env células) y HeLa P4.2 células que expresan receptores de VIH (células diana). Con este fin,-Env células HeLa se incubaron con Rgp41A antes de la incubación con células objetivo, en una concentración que inhibe el 90% de VIH-1 LAI infección (IC90). Fusión celular se vigila con la medida de la actividad β-galactosidasa. Como se muestra en la Figura 5, la amortiguación Rgp41A parece inhibir parcialmente la célula a célula de fusión, que refleja, probablemente, su citotoxicidad. De hecho, se observó 45 a 55% de reducción de la actividad β-galactosidasa con Rgp41A solubilización de amortiguación. En comparación con el buffer solo, Rgp41A inhibido casi 4 veces la fusión entre células HeLa-Env expresar el VIH X4 sobres (LAI y NDK) y las células diana, pero no tiene efecto significativo sobre las células que expresan el R5 dotación (ADA). Así, en este modelo, Rgp41A actividad parece estar restringida a los sobres a prueba de VIH X4. Para fines de comparación, también incluyó en este experimento T20. En una concentración que inhibe el 90% de VIH-1 LAI infección (0,2 μ g / ml), T20 inhibe sólo alrededor del 50% de syncytia formación (Figura 5].

Célula a la fusión es inhibida por Rgp41A en una fase tardía durante el proceso de fusión

T-20 fue recientemente demostrado inhibir el proceso de fusión de membranas en una fase tardía, después de que el intercambio entre los lípidos de las células que expresan el entorno y las células diana [35]. Se investigaron en la que el paso del proceso de fusión Rgp41A actos. Con este fin, la expresión de células HeLa X4 LAI sobre y células HeLa P4.2 objetivo eran etiquetados con dos sondas fluorescentes hidrofóbicas, DiO y DiI, respectivamente. Etiquetados-LAI células HeLa fueron pre-incubadas con Rgp41A, T-20, PBS o Rgp41A de amortiguación y, a continuación, se incubaron con células de la etiqueta meta. Después de 6 horas a 37 ° C, la cantidad de células doble fluorescente se mide por el análisis de citometría de flujo. Doble fluorescente células resultado de un intercambio de los lípidos de membrana durante el proceso de fusión entre LAI-HeLa y células objetivo. Paralelamente, la eficiencia de fusión fue evaluada por la medición de syncytia formación utilizando un ensayo X-Gal. Como se indica en la figura 6, el porcentaje de células doble fluorescente fue alrededor de un 12% cuando las células fueron incubadas con PBS, y el X-Gal ensayo mostraron la formación de muchas grandes syncytia, como se esperaba. No se observó diferencia significativa cuando el buffer de Rgp41A se utilizó. En dosis bajas (10 nM), el T-20 tenía un efecto limitado sobre el intercambio de lípidos desde alrededor del 7% de la doble fluorescente se observaron células, que corresponde a una reducción de aproximadamente el 37% de la membrana de intercambio. Sin embargo, bloqueado syncytia formación, como lo demuestra el escaso número y el tamaño de syncytia en el plato. En cambio, en dosis más alta (400 nM), T-20 ha abolido completamente syncytia formación y más del 95% de los lípidos de cambio. Rgp41A inhibió syncytia formación pero que no impiden el intercambio de lípidos, ya que el tratamiento de las células con Rgp41A no modificar significativamente la cantidad de células doble fluorescente. Por lo tanto, estos resultados sugieren que Rgp41A, como para la T-20 a bajas dosis, inhibe el proceso de fusión en una fase tardía después de la mezcla de lípidos, ya que parece bloquear la formación de syncytia sin impedir el intercambio de lípidos entre HeLa-LAI Las células CD4 y las células que expresan.

Discusión

En este estudio, dos soluble trimeric VIH-1 gp41 proteínas recombinantes, se mostró de inhibir el VIH-1 en proceso de fusión. Ambas construcciones comprenden N y C dominios conectados por un residuo de 7-hidrofílicos enlazador y se muestra a veces espontáneamente en un trimer, confirmando que estas proteínas puede simular el paquete de seis hélice de la gp41 ectodominio fusogenic en su estado [15 - 18, 40 ]. Lu et al. Anteriormente descrito una gp41 derivados de la construcción de llamado N34 (L6) C28, formado por la gp41 derivados N34-C28 y péptidos asociados por un residuo de 6 enlazador. Esta proteína, que tiene la misma estructura general como Rgp41B (N53 (L7) C47) y Rgp41A (N59 (L7) C54), se encontró a la forma altamente termoestables α-helicoidal trimers [41].

Infección experimentos con pseudotyped o de tipo salvaje virus VIH-1 en HeLa-CD4 o HeLa-CD4 de las células CCR5 reveló que ambos Rgp41A y Rgp41B tienen la capacidad de interferir con la entrada del VIH-1 en las células diana. Cabe señalar que tanto Rgp41 trimeric proteínas han agregado a la propency en solución, especialmente Rgp41A, presumiblemente debido a la presencia de la N-recursos humanos [16]. El alto grado de insolubilidad de Rgp41A nos llevan a utilizar un buffer de solubilización que resultó ser tóxica para las células. Por lo tanto, Rgp41A efecto aparente en la entrada del VIH-1 fue sistemáticamente frente a los efectos de su disolución buffer solo.

El más potente inhibidor es Rgp41A, que inhibe la infección de células HeLa-CD4 por el VIH-1 LAI y ADA Env pseudotyped virus IC50 con valores de 56 y 156 nM, respectivamente. Su eficacia en los virus de tipo salvaje parecía más débil, con valores de CI50 de 289 nM para el VIH-LAI a 844 nM para el VIH-1 NDK. Por comparación, N34 (L6) C28 IC50 valor sobre el VIH-1 IIIB infectividad es de 1,5 μ M [42], lo que indica que la Rgp41A es de aproximadamente 5 veces más eficaz que el N34 (L6) C28 para inhibir la infección por virus X4.

En cambio, Rgp41A muestran ningún efecto sobre el R5 cepa de VIH-1 de ADA. Curiosamente, el VIH-1, ADA se ha informado anteriormente a ser especialmente resistentes a los diferentes inhibidores de la entrada [43, 44]. Este aislamiento de VIH-1 parece, por tanto, a comportarse de manera diferente en comparación con otros conocidos aislados del VIH-1 por una razón que aún no se ha investigado. Más en general, parece menos R5 aislados susceptibles a la inhibición que Rgp41A cepas X4. Esta mayor sensibilidad de los virus X4 se ha observado anteriormente con la C-HR derivados inhibidor de la fusión, T-20 [31, 32]. La segunda construcción, Rgp41B, que contiene más corto y N C dominios, inhibe X4 mal aislados del VIH-1 LAI y NDK, a las concentraciones micromolar, y es inactivo contra las cepas R5.

Seguidamente, examinó el mecanismo por el cual Rgp41A interfiere con el VIH-1, la entrada en las células diana. Nos demuestran que la proteína recombinante trimeric fue capaz de interactuar con monomérico gp120 derivados de un X4 aislar el VIH-1. Sin embargo, esta unión no parece dar lugar a la liberación de gp120, un mecanismo en parte responsable de la inhibición de la infección por sCD4 [37 - 39]. De este modo, podría ser posible que Rgp41A puede unen preferentemente a gp120 del virus X4, la prevención de su interacción con CD4 y / o CXCR4. Esta hipótesis explicaría mejor su eficacia contra los virus X4 entrada, aunque esto aún no ha sido plenamente investigado. Curiosamente, el inhibidor de la fusión T-20 se muestra también de obligar a gp120 de X4 cepas de VIH-1 en un CD4 inducida, V3 bucle de forma dependiente [33]. Esta unión fue demostrado para evitar la interacción de gp120-CD4 complejos con el CXCR4 coreceptor.

Con el fin de determinar si pueden afectar Rgp41A diferentes etapas del proceso de entrada de una manera similar como T-20 [33, 45], que pusieron a prueba la capacidad de Rgp41A para bloquear el proceso de fusión. Como era de esperar, la molécula trimeric puesto de manifiesto su capacidad para inhibir potentemente la fusión entre X4 Env-expresando células y células diana que expresan CD4 y CXCR4. Esta inhibición se produce en una fase avanzada de este proceso, como lo revela la incapacidad de Rgp41A membrana para evitar los intercambios, incluso a altas concentraciones que bloquean de manera eficaz la formación de syncytia. Una vez más, esta observación es una reminiscencia de los anteriores resultados descritos para la T-20 en concentraciones bajas [35, 46, 47]. T-20 se cree que actúan por medio de la unión transitoria expuestos a la triple bobina varados en espiral-NH2-terminal de hélices, lo que impide la formación de 6-HB. Este mecanismo de acción está de acuerdo con la conclusión de que la fusión de poro antes de las formas de plegado de la 6HB se ha terminado [48]. A diferencia de T-20 y otros inhibidores de la fusión anteriormente descrita, que son pequeños péptidos derivados gp41-capaces de unirse transitoriamente a los expuestos HRs de gp41, Rgp41A es una molécula bastante grande (aproximadamente 50 kD). La espera para la conformación Rgp41A es un trimer de giros, simulando la fusogenic conformación de la gp41 de VIH-1. Independientemente de su gran tamaño permite la trimeric proteína para acceder a gp41 durante sus cambios conformacionales que queda por esclarecer. Sin embargo, el hecho de Rgp41A inhibe la fusión sin ningún efecto sobre los lípidos de la mezcla sugieren que también podría interferir en la formación 6HB.

N34 (L6) C28 también se ha encontrado para inhibir el VIH-1 mediada por Env fusión de membranas, de acuerdo con nuestros resultados [41]. Curiosamente, la potencia de estos trimeric HR1-HR2 proteínas para inhibir la entrada del VIH-1 parece proporcional a la la longitud de la N-y C-terminal de dominios, y menos el más potente inhibidor de N34 (L6) Rgp41A y C28, respectivamente [ 41]. Los péptidos sintéticos correspondientes a la N-HR y HR-C de gp41 bloquear la fusión por medio de la unión transitoria expuestos a la gp41 durante HRs de cambios conformacionales, lo que impide 6HB formación [21]. C péptidos son inhibidores potentes de la infectividad del VIH-1 con la actividad en nanomolar concentraciones, mientras que la N-péptidos inhibidores son relativamente pobres, presumiblemente debido a su tendencia a la solución global en [16]. Muchos grupos han tratado de diseño más potentes inhibidores de la combinación de múltiples HR1 y HR2, como N (CCG)-gp41 (HR1-HR1-HR2) [49], 5-Helix (HR1-HR2-HR1-HR2-HR1) [ 25], HR121 (HR1-HR2-HR1) [41], HR212 (HR2-HR1-HR2) [41] o de otros N-péptidos derivados de los inhibidores como IQN17 o IQN23 [24]. Aunque algunas de estas construcciones tienen un fuerte efecto inhibitorio, su modo de acción preciso es todavía poco clara.

En el caso de Rgp41A y B, la única diferencia entre las dos moléculas es trimeric la longitud de la N-y C-terminal de gp41 derivado de los dominios, que se diferencian por sólo 6 y 7 de residuos, respectivamente. En consecuencia, sería interesante para explicar la razón por la que el efecto inhibidor de la entrada del VIH en Rgp41A sistemáticamente es mucho más alto que su homólogo B, a pesar de que ambos tienen la misma estructura general. En este contexto, la synthetis intermedio de las construcciones que contienen N-y C-terminal de dominios de aumentar lenghts sería especialmente informativa con el fin de identificar los factores determinantes de esta diferencia de actividad antiviral.

Conclusión

Ambos Rgp41 proteínas se encontraron para inhibir la entrada del VIH-1 en las células diana en una forma dependiente de la dosis. Rgp41A, el más potente inhibidor, se encontró que inhibe tanto X4 y R5 aislados en células HeLa y primaria de los linfocitos T. Rgp41A fue capaz de obligar a gp120, pero no indujo gp120-gp41 disociación. Además, este inhibidor interfiere con el paso de la tarde el proceso de fusión, a raíz de la mezcla de lípidos.

Teniendo en cuenta nuestros resultados, también es posible que Rgp41A, al igual que T-20, puede actuar en diferentes etapas del proceso de inscripción. Aunque el mecanismo exacto de acción de estos inhibidores de la entrada del VIH será difícil de desentrañar, que, sin duda, ayudará a dilucidar los complejos mecanismos implicados en el proceso de entrada del VIH.

Materiales y métodos
Líneas celulares y plásmidos

HeLa-CD4-LTR-LacZ (conocida también como HeLa P4.2) establemente células CD4 humanos expresan la molécula y contener la β-galactosidasa de codificación gen (lacZ) bajo el control transcripcional de la pandemia del VIH-1 repetición terminal larga (LTR). Ellos fueron amablemente proporcionados por el Dr M. Alizon (Institut Cochin, París, Francia). HeLa-Env/ADA (o HeLa-ADA) células estable expresar el sobre de la cepa VIH R5 trópico ADA. HeLa-Env/LAI (o HeLa-LAI) y HeLa-Env/NDK (o HeLa-NDK) células de expresar LAI estable y NDK env genes de los virus X4 y NDK LAI, respectivamente. Δ20 células HeLa se derivan de las células HeLa-Env/LAI y contienen una deleción en el gen env. Ambas líneas celulares fueron amablemente proporcionados por el Dr M. Alizon (Institut Cochin, París, Francia). HeLa-Env Δ20 células HeLa y estable también expresar la proteína Tat del VIH. Todas las líneas de células adherentes se cultiva en la Dulbecco modificado a medio Eagle (MEDM, Invitrogen) suplementado con 5% de suero de ternera fetal (Invitrogen), 50 U / ml de penicilina, 50 μ g / ml estreptomicina (Invitrogen) y 2 mM de glutamina (Invitrogen).

El pCMV-CCR5 plásmido (amablemente dado por el doctor T. Dragic, Nueva York, EE.UU.) contiene el gen CCR5 bajo el control del promotor CMV. El plásmido proviral Δ pNL4.3-env-Luc contiene la NL4.3 env-suprimido provirus incluido el reportero luciferase genes insertados en la nef ORF [34]. La LAI y ADA8 expresión plásmidos puerto y la LAI ADA8 env genes, respectivamente, bajo el control de la epidemia del VIH-1 LTR. El pEnv-VSV-G plásmido codifica VSV-G dotación fue un regalo del doctor P. Sonigo (Institut Cochin, París, Francia). El pADA, pJRCSF y pYU2 proviral plásmidos codifican proviral genomas de los virus R5 trópico, mientras que el pNL4.3 y pNDK proviral plásmidos codifican proviral genomas de los virus X4 trópico.

Anticuerpos y reactivos químicos

La oveja anti-gp120 anticuerpo monoclonal D7324 (Aalto) se planteó en contra de un péptido C-terminal de la gp120. Sueros de los pacientes VIH + fueron un regalo de Profesor JC Nicolas (hospital Tenon, París, Francia). HRP-junto anti-humano y anti-anticuerpos ovejas fueron adquiridos de Caltag y DAKO, respectivamente. El HRP sustrato ABTS de Roche se usa a una concentración de 1 mg / ml. Las sondas fluorescentes hidrofóbicas DiO y DiI se adquirieron de Sigma Aldrich. El inhibidor de la fusión T-20 y los CD4 soluble (sCD4) se obtuvieron a través de los NIH SIDA Investigación y Referencia del Programa de Reactivos. La proteína recombinante gp120 del VIH-1 IIIB se adquirió de biotecnología avanzada Incorporated.

Producción y purificación de trimeric soluble recombinante de las proteínas gp41

El trimeric proteína recombinante Rgp41A y Rgp41B fueron proporcionados por Protein'eXpert (Grenoble, Francia), y elaborada con la siguen. En pocas palabras, el VIH-1 gp41 secuencias correspondientes a Rgp41A y Rgp41B fueron clonados entre las NdeI y la XhoI sitios de la pET21b y vectores de expresión pET20b (Novagen), respectivamente, lo que permite la producción de la proteína recombinante 6xHIS abrigaban una etiqueta en su C-terminal. Competente Escherichia coli BL21 (DE3) se transforma con cada uno de los vectores y crecido en medio LB a 37 ° C hasta que un 0,6 de absorbancia a 600 nm se llegó. La producción de la proteína recombinante fue inducida por la adición de 1mM IPTG. Dos horas después de la inducción, las bacterias fueron cosechadas y lisadas en el buffer de las proteínas (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 8) por sonicación. La suspensión fue centrifugada a 40000 g durante 30 min a 4 ° C para separar las proteínas solubles (sobrenadante) de las células y proteínas insolubles desechos (pellets). Rgp41 proteínas purificadas de sobrenadante por cromatografía de afinidad utilizando quelación Sepharosa ™ Fast Flow (Amersham Biosciences) y eluye utilizando elución buffer (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, imidazol 500 mM, pH 8). Rgp41A que contienen fracciones se combinaron y dializados contra 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 200 mM imidazol, pH 8. Rgp41B que contienen fracciones se combinaron y dializados contra 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, pH 8. Pureza de las proteínas recombinantes fue verificada por el 12% SDS-PAGE. El oligomeric situación de la proteína recombinante se determinó por cromatografía de filtración en gel usando Superdex 75 HR 10/30 (Amersham Biosciences). Columnas equilibrado y se eluye con 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl; 200 mM imidazol, 5% glicerol; pH 8 en el caso de Rgp41A y con 50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, el 5% de glicerol, pH 8 en El caso de Rgp41B. La curva de calibración se obtuvo con el estándar de las proteínas globulares.

Rgp41A y Rgp41B fueron patentados por Mymetics Corporation (ref PCT/IB2004/002433).

Producción de VIH-1 y de laboratorio-pseudotyped cepas adaptadas

Las existencias de pseudotyped virus se generaron por la co-transfecting células HEK293 con la proviral plásmido pNL4.3-Δ env-Luc y uno de los env codificación de los plásmidos. Las existencias de virus adaptado laboratorio fueron obtenidos por transfecting células HEK 293 con la proviral plásmidos pADA, pYU2, pNL4.3 o pNDK. Cuarenta y ocho horas después de transfección, el sobrenadante fue filtrado que contiene los virus y las reservas del virus se valora por p24 ELISA (Coulter).

La producción y activación de PBL

Células mononucleares de sangre periférica fueron aisladas de la sangre humana sobre Ficoll (Ficoll-Paque PLUS, Amersham Biosciences), lavados varias veces en PBS, EDTA 0,3 mM congelados y almacenados en el suero de ternera fetal complementado con un 10% de DMSO. Para los linfocitos de sangre periférica (PBL), la producción, las existencias rápidamente fueron descongelados y lavados en RPMI, 10% de suero de ternera fetal. Las células se cultivaron en placas de 6-bien en RPMI, 10% de suero de ternera fetal. PBL se activan con 5 μ g / ml PHA (DIFCO) y, tres días más tarde, con 40 U / ml IL-2 (Proleukin, Chiron). Después de dos semanas de la IL-2 induce la proliferación, las células fueron utilizados para experimentos de la infección.

Cell infecciones

P4.2 HeLa transfectadas con pCMV-CCR5 o PBL se cultivaron en placas de 48 pocillos (de unos 5 × 10 4 células por así). Antes de la infección, las concentraciones de pseudotyped fijo o de laboratorio adaptadas virus se incubaron durante 15 minutos con un rango de concentraciones Rgp41 (de 0,0025 a 0,03 μ g / μ l) o con el mismo volumen de Rgp41 solubilización de amortiguación específicos. Después de la incubación, la mezcla se han añadido a las células. La cantidad de virus así fue añadido por el equivalente a 10 ng de p24. Cuatro horas después de la infección, las células fueron lavados varias veces para eliminar virus y libre proteínas recombinantes y cultivadas durante 48 h. Infectividad viral se vigila con la medida de la actividad en la celda luciferase lisados en el caso de las células HeLa pseudotyped infecciones por virus. Para las infecciones de laboratorio con adaptado cepas del VIH-1, la infección se vigila con la medida de la actividad β-galactosidasa en la celda lisados. Por último, las infecciones de PBL fueron seguidos por la medición de la cantidad de p24 en el sobrenadante.

Cell-a la fusión de células de ensayo

- Env células HeLa fueron sembradas en placas de 48 y (10 5 células por así), ya sea con Rgp41A (0,03 μ g / μ l), Rgp41A de amortiguación o PBS. Quince minutos más tarde, las células diana (HeLa P4.2 o P4.2 HeLa transfectadas con pCMV-CCR5) se han añadido a los pozos (10 5 por pocillo) y co-cultivos fueron incubados durante 6 horas a 37 ° C.

Beta-galactosidasa de ensayo

Las células cultivadas en placas de 48-así se lisadas en 200 μ l de buffer de lisis (60 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM KCl, 10 mM MgSO 4, 2,5 mM EDTA, 1,25 ‰ NP40, 50 mM β - Mercaptoetanol) a 10 min. Un volumen equivalente de la reacción de amortiguación (61,9 mM Na 2 HPO 4, el 18,1 mM NaH 2 PO 4, 10 mM MgCl 2, 10 mM β-mercaptoetanol, 6 mM clorofenol-β-D-galactosa) fue añadido a la lisado. Cinética se realizó midiendo la absorbancia a 575 nm durante 30 min. La actividad β-galactosidasa corresponde a la pendiente de la curva.

Luciferase ensayo

Las células cultivadas en placas de 48-así se lisadas en 200 μ l de buffer de lisis (25 mM Tris pH 7,8, 8 mM MgCl 2, 2 mM de TDT, 1% Tritón X-100, el 15% de glicerol) antes de añadir 100 μ l de buffer de lisis que contiene 0,25 mM luciferin y 1 mM ATP. Luciferase actividad se midió en un Luminometer Berthold (Lumat LB9507).

P24 titulación

La proteína p24 fue titulada usando el VIH-1 p24 Antígeno Kit de ensayo (Coulter), de acuerdo con las instrucciones del proveedor. En pocas palabras, las células infectadas o de las poblaciones virales fueron lisadas en Triton X-100 y la introdujo en lisados pozos pre-recubiertos con ratón anti-p24 anticuerpos monoclonales. Encuadernación p24 fue revelado utilizando biotina-junto humanos contra el VIH, seguida de IgG HRP-junto streptavidina. HRP reacción fue iniciada por la adición de la HRP pozos en el sustrato y se detuvo 30 minutos después, con la detención de amortiguación. La absorbancia a 450 nm fue determinada. Purificado p24 se utilizó para generar las curvas de calibración.

Rgp41 interacción de las proteínas gp120 con monomérico

Immobiliser placas de la proteína (EXIQON) fueron revestidos con Rgp41 proteínas (200, 100 o 50 ng en 15 mM Na 2 CO 3, 35 mM NaHCO 3 por así). Después de la noche a la mañana de revestimiento a 4 ° C, los pozos fueron lavados varias veces con PBS-Tween (PBS 1 ×, el 0,05% de Tween 20), saturado de PBS con 10% de suero fetal de ternera 2 h y lavado de nuevo con PBS-Tween. Monómeras gp120 recombinante derivado de VIH-1 IIIB diluida en PBS-Tween, se añade al bien (2 ng por pocillo). Las placas fueron incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente y lavados varias veces con PBS-Tween. Gp120 obligado a Rgp41 fue etiquetada con gp120 anticuerpos anti-D7324 diluida en PBS-Tween por 2 horas a temperatura ambiente, seguido de secundaria conjugado HRP-anticuerpos diluida en PBS-Tween de una hora adicional. Las placas fueron lavadas exhaustivamente con PBS-Tween. El sustrato HRP se añade a los pozos y la absorbancia a 405 nm se midió 10 minutos más tarde.

Gp120 liberación de las células HeLa-Env

HeLa-Env y Δ20 células HeLa (4 × 10 6 células por tubo de 200 μ l MEDM, 10% de suero de ternera fetal) se incubaron con Rgp41A (0,03 μ g / μ l), Rgp41A de amortiguación, sCD4 (50 μ g / ml) o PBS a 37 ° C. Seis horas más tarde, sobrenadantes se cosecharon para cuantificar la cantidad de gp120 en libertad. A tal efecto, 96-así Immobiliser placas de proteínas (EXIQON) fueron revestidos noche a la mañana a 4 ° C con anticuerpos anti gp120-D7324 diluido en 15 mM Na 2 CO 3, 35 mM NaHCO 3, pH 9,6. Wells se enjuaga varias veces con PBS-Tween. Sobrenadantes fueron depositados en los pozos y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de varios lavados, un humano anti-VIH en suero se añadió en los pozos y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron y HRP-junto secundaria anticuerpos diluida en PBS-Tween se añadieron en los pozos de una hora adicional a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron exhaustivamente antes de la adición de sustrato HRP. La absorbancia a 405 nm se midió 1 h después del inicio de la reacción. Se obtuvieron las curvas de calibración con purificada del VIH-1 IIIB gp120.

Análisis de la mezcla de lípidos

- Env células HeLa y células HeLa P4.2 objetivo eran etiquetados con 2 μ M DiO y DiI, respectivamente, como ha sido descrito previamente [35]. Después de la célula de etiquetado, de una célula a célula de fusión de ensayo se realizó como se describió anteriormente, en presencia de Rgp41A (50 μ g / ml), Rgp41A de amortiguación, T-20 (10 nM o 400 nM) o PBS. Co-cultivos fueron incubados durante 6 horas a 37 ° C. Las células fueron entonces separados de los pozos con PBS, 15 mM citrato, pH 7 y fijos con PBS el 2% de formaldehído. Doble células fluorescentes, que contienen tanto DiO y DiI, fueron detectados por dos colores XL 2 Beckman Coulter cytometer utilizando el Sistema II ™ software. Al menos 10 4 células fueron contados para cada muestra. Paralelamente, algunas células fueron sometidas a un ensayo de X-Gal, a fin de estimar célula a la eficiencia de fusión, tal como se describe anteriormente [36].

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

DDG llevado a cabo las infecciones por el VIH, las células para los experimentos de fusión de células, ELISA y ensayos de la mezcla de lípidos. PLQ participó en los experimentos de inhibición del VIH y también en el diseño experimental y análisis de datos. MGR producido y realizado el análisis estructural de las proteínas Rgp41. UH concibe el estudio y participaron en su diseño y coordinación, así como en la redacción del manuscrito. SN participó en el análisis de los datos y redactó el manuscrito. CR participó en el diseño experimental y el análisis de datos y realiza también la infección por el VIH y de células para los experimentos de fusión de células. Todos los autores han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a Laura Burleigh y Ara Hovanessian útil para el debate y la lectura crítica del manuscrito. Damos las gracias a la investigación NIH SIDA y el Programa de reactivos de referencia para el tipo de regalo de los reactivos. PL.Q. Cuenta con el apoyo de una donación de Mymetics Corporation. Mymetics Corporación apoya este trabajo.