Proteome Science, 2006; 4: 4-4 (más artículos en esta revista)

Patrón de alteración en las proteínas tratadas con AZT K562 detectados por las células de dos dimensiones y la electroforesis en gel de péptido masiva de huellas dactilares

BioMed Central
Gabriele D'Andrea (gadan@cc.univaq.it) [1], Anna R Lizzi (lizzi83@hotmail.com) [1], Sara Venditti (sarave77@yahoo.it) [1], Laura Di Francesco (eugenia. Schinina@uniroma1.it) [2], Alessandra Giorgi (eugenia.schinina @ uniroma1.it) [2], Giuseppina Mignogna (pina.mignogna @ uniroma1.it) [2], Arduino Oratore () [oratore@univaq.it 1], Argante Bozzi (bozzi@cc.univaq.it) [1]
[1] Department of Biochemical Sciences and Technologies, University of L'Aquila, Via Vetoio, 67100 L'Aquila, Italy
[2] Department of Biochemical Sciences, University La Sapienza, P.le Aldo Moro 5, 00185 Rome, Italy

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Resumen

En este estudio nos informe el efecto de AZT en todo el perfil de expresión de proteínas tanto en el control y el tratamiento AZT-K562 células, que se apreciaba en dos dimensiones y la electroforesis en gel de péptido masa análisis de las huellas dactilares. Geles de dos dimensiones de análisis digital de imágenes de ordenador mostró dos puntos-hasta que apareció regulado en las células tratadas con AZT y una mancha en la actualidad sólo la droga muestras expuestas. Tras la extracción y análisis de las huellas dactilares por péptido en masa, los dos primeros lugares fueron identificados como PDI-A3 y stathmin, mientras que el tercero fue demostrado ser NDPK-A. En cambio, dos puntos de proteínas presentes sólo en las células K562 no tratados, y fueron identificados como SOD1 y HSP-60, respectivamente.

Antecedentes

AZT (3'-azido-3'-deoxythymidine o zidovudina), la primera droga anti-retroviral aprobado para el tratamiento del SIDA, es un nucleósido análogo sintético que inhibe la transcriptasa inversa del VIH actividad in vitro [1]. A menudo se incluye como uno de los mejores anti-VIH de los fármacos de elección 'muy activa en la terapia antirretroviral (HAART), junto con otras organizaciones no análogos de nucleósidos y los inhibidores de la proteasa [2 - 5]. Además de su efecto inhibidor de la transcriptasa inversa, el AZT se sabe que juega un papel clave en muchos otros procesos celulares (por ejemplo, proteínas y lípidos glicosilación [6 - 8], la síntesis de heme [9], la generación de radicales libres [10 - 12], la apoptosis [ 13]].

Así, en los últimos años, respondiendo a AZT genes se han identificado en diversas líneas celulares [12 - 16]. Estos AZT modulada código principalmente de los genes relacionados con las proteínas, ya sea para el crecimiento celular y / o de la homeostasis y el metabolismo. Sin embargo, informes recientes han demostrado que el AZT también pueden activar una serie de cascadas de señalización (NF-kB-dependiente) que participan en muchas otras funciones de vital interés para la celda de la vida [17]. Además, el AZT también está implicado en el daño oxidativo del ADN [18 - 20], en el deterioro funcional y estructural de destrucción de la mitocondria [12, 21] y en la inducción de diversos factores de transcripción [14, 22 - 24].

El objetivo de este estudio fue el de ampliar nuestros conocimientos a AZT-regulado funciones celulares mediante la identificación de productos genéticos que responda a AZT. Con este fin hemos utilizado K562 células sin tratar (control), o expuestos a 20 μ M AZT durante 3 h. Esta concentración de drogas es mayor, pero no muy lejos de la que se encuentra en la sangre de pacientes con SIDA bajo terapia con AZT. Además, el 20 μ M AZT y 3 h de exposición fueron seleccionados también para mejorar los cambios de las nuevas proteínas de bajo AZT influencia, y para obtener las mayores diferencias sin afectar o dañar las células de crecimiento. Después de dos dimensiones en gel de electroforesis, los perfiles de expresión proteica de estos dos muestras de células fueron previamente inspeccionadas y, a continuación, un diferencial sobre la base de comparación péptido masa se realizó un análisis de huellas dactilares. Nuestros resultados mostraron que, con respecto al control de las células, las células tratadas con AZT expuesto PDI-A3 y stathmin sobre regulación (+400% y +140%, respectivamente). Por otra parte, la SOD1 y HSP-60 se encontró que se expresen sólo en el control de las células, mientras que NADPK-A se pone de manifiesto en las muestras tratadas con AZT.

Resultados y discusión

Para identificar las proteínas cuya expresión es sensible a AZT, se realizó en dos dimensiones mediante electroforesis en gel de proteínas K562 extractos de las células cultivadas durante 3 h, en ausencia o en presencia de 20 μ M AZT. Master mapas de control y tratados con AZT K562 células fueron generados por el análisis con el software ImageJ [25, 26] después de la detección de 624 puntos por una mediana sensibilidad, como la tinción de azul brillante micelar Coomassie G250 [27, 28]. Fingerprinting por MALDI-ToF-MS análisis permitió la identificación de cinco puntos.

Las principales diferencias encontradas al comparar los dos conjuntos de muestras, el control no tratados y los tratados con AZT células, se la sobre regulación de las dos proteínas, la aparente inducción de una proteína y la aparente silenciamiento de la expresión de dos proteínas AZT. Después de los cinco PMF proteínas posteriormente fueron identificados como proteínas A3 disulfuro isomerasa (PDI-A3) y stathmin (hasta reguladas 4 y 1,4 veces, respectivamente, Fig. 1, panel derecho); nucleósido difosfato quinasa A (NDPK-A, que fue Aparentemente en la actualidad, sólo el tratamiento de muestras; Fig. 1, panel derecho), la superóxido dismutasa citosólica (SOD1) y 60 kDa de proteínas de choque térmico (HSP-60) (ambas al parecer en la actualidad sólo la muestra de control; Fig. 1, panel de la izquierda; Tabla 1]. La proteína identificada manchas indica en la Fig. Cifra 1 por números (1-5) se detectaron por duplicado en dos muestras diferentes preparaciones; los lugares indicados en la Fig. 1 por ni (no identificado) apareció sólo en el representante Coomassie Blue manchadas 2DE gel (Fig. 1]. A nuestro entender, esta observación es el primero que muestra el efecto directo de AZT en la expresión de proteínas específicas.

Nuestros resultados demuestran que AZT regula la expresión de PDI-A3, un elemento esencial plegables catalizador y acompañante de la sala de emergencia [29 - 33]. Esta proteína presenta abundantes disulfuros en proteínas (actividad oxidasa) y cataliza la reorganización de disulfuros incorrecta (actividad isomerasa). Markovic et al. [34] confirmó recientemente un papel para una actividad de oxido-reductasa, es de suponer que de PDI, en los acontecimientos que siguen a la dotación obligatoria del VIH a la membrana celular de los receptores meta. De hecho, se ha informado de que la reducción de la gp 120 disulfuro de bonos por PDI viral durante la interacción con la superficie de linfocitos es un requisito estricto de la fusión [35, 36]. Sin embargo, se ha informado de que PDI-A3 podrá regular la señalización inactivada por secuestrar y activado Stat3 [37] y es por lo general hasta regulados a raíz de un estrés ER [38, 39]. En este sentido, intriguingly, aunque AZT es conocida para inhibir la actividad de la transcriptasa inversa del VIH, podría en parte favorecen la entrada del VIH en la célula a través de PDI-A3. Esta hipótesis debe ser apropiada efectivamente el apoyo de experimentos específicos, que están más allá del objetivo del presente estudio.

El otro por la modulación de la expresión de la proteína AZT identificados por 2DE se stathmin (oncogénica 18; phosphoprotein p19), que fue de 1,4 veces hasta regulada en células tratadas con AZT. Esta proteína es un regulador de los microtúbulos (MT) que se une la dinámica tubulina heterodimers y desestabiliza MTs mediante la promoción de catástrofes (es decir, la transición de creciente a la disminución de MTs) [40]. Curiosamente, se ha constatado que los microtúbulos de proteínas también contiene una enzima, a saber NDP quinasa responsable de la síntesis de nucleósidos triphosphates sino que también participa en varios procesos de regulación relacionados con la proliferación de las células, el desarrollo y la diferenciación [41]. En particular, el llamado NDPK-A, codificada por el gen nm23-H1, sólo se encuentra en el citosol y se asocia a la progresión del tumor y la metástasis. Por el contrario, los llamados NDPK-B, codificada por el gen nm23-H2, es un factor de transcripción de c-myc y se encuentran tanto en el citosol y en los núcleos [42]. Así, en condiciones experimentales los 1,4 veces sobre regulación de stathmin, y la consiguiente presencia de NDPK-A en los tratados con AZT K562 células indicaron un efecto general de la droga en el sistema de microtúbulos. En este contexto, cabe señalar que los agentes capaces de perturbar microtúbulos y algunas rutas de tráfico intracelular (por ejemplo, nocodazole, colchicina), reducir la capacidad de AZT para inhibir la citotoxicidad de ricina a causa de una alteración en la translocación a la membrana citosol [43 ].

Los últimos dos proteínas que parecían ser expresado solamente en el control de las células, se identificaron como HSP-60 y SOD1, respectivamente. HSP-60 se localiza principalmente en la mitocondria [44], pero también es descrito como asociado a la membrana celular [45, 46]. La importante función de la HSP-60 es su participación en el plegamiento de las proteínas en la mitocondria de importación, una vez plegada correctamente la proteína no puede ser un objetivo de carácter vinculante para HSP-60 [47]. Curiosamente, se ha informado de que HSP-60 interactúa con gp41, una proteína transmembrana de anclaje de la proteína de superficie gp120 de la cubierta del virus del VIH, además gp41 media la fusión entre el virus y la membrana de la célula huésped, un paso que es esencial para Entrada viral [48]. Desde la unión de la HSP-60 a gp41 aumenta la infectividad del virus, ayudando tanto a los virus de anclaje a la superficie de la célula y para escapar del ataque del sistema inmunológico [48], AZT puede reducir la actividad biológica de gp41 por silenciar La expresión de HSP-60, lo que impide la entrada del VIH en la célula. Esta atractiva hipótesis, que está vinculada a través de gp41 HSP-60, podría contrarrestar el efecto de AZT en gp120 a través de PDI-A3, tal como se describe anteriormente. Además, se ha informado también de que HSP-60 estimula la actividad del VIH-1 retrovirales integrasa, una enzima que cataliza un paso crítico en el ciclo infeccioso de este retrovirus, es decir, la integración del VIH-1 proviral DNA en el genoma nuclear de células [49].

En cuanto a SOD1, la otra proteína que parece ser silenciada en presencia de AZT, que pertenece a una familia de enzimas ubicuo, que se encuentra en todas las células aeróbicas, que se cree que de principios de defensa contra los efectos nocivos de aniones superóxido (O 2 -) Por dismuting a peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) y el oxígeno molecular (O 2) [50]. Hay dos tipos de SOD en tejidos de mamíferos: un Cu 2 Zn 2 en la SOD citosólica (SOD1 o SOD-c) y Mn-SOD en la mitocondria [51]. La SOD1 fue identificado como terreno n. 5 en nuestro 2DE (Fig. 1]. Curiosamente, se ha determinado anteriormente que el tratamiento de AZT Tat ratones provoca casi el 80-90% de supresión de la actividad SOD-Mn [52]. Por lo tanto, un efecto similar de AZT en SOD1 no se puede excluir en nuestra condiciones experimentales. Desde que se ha informado de que la SOD extracelular (EC-SOD) de la actividad de plasma sanguíneo disminuye en pacientes infectados por el VIH en comparación con sujetos sanos, y también la actividad de la SOD células mononucleares disminuye con el VIH asociados progresión de la enfermedad [53], nuestro Resultados están en línea con estas observaciones y proporcionar un nuevo instrumento para un mejor conocimiento de la toxicidad inducida por AZT en pacientes con SIDA tratados con este fármaco.

Conclusión

En conclusión, a la fecha, este es el primer informe que sobre-expresión de PDI-A3 y stathmin junto con NDPK-A apariencia, tratados con AZT en las células K562, mientras HSP-60 y SOD1 se detectaron sólo en el control de células no tratadas. Por supuesto, arriba / abajo regulación de estas proteínas podría ser no sólo excluyentes, sino, probablemente, parte de un grupo más grande de las proteínas indetectable con nuestro sistema. Sin embargo, otros estudios están en curso extender nuestras observaciones a otros tipos de células con el fin de comprobar si el anterior informó alteraciones son una característica general de la AZT-células expuestas o que representan un peculiar comportamiento de un determinado humanos mieloide crónica (K562) leucemia de células La línea.

Materiales y métodos
Materiales y productos químicos

Todos los productos químicos, pero cuando se especifican de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). El sistema Multiphor así como el lineal Immobiline tiras secas gradiente de pH 3-10 (11 cm de largo) son de Amersham (Milán, Italia).

Células y condiciones de crecimiento

Humanos mieloide crónica (K562) leucemia de células se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC), mantenido en crecimiento exponencial en el medio RPMI 1640 bicarbonato (pH 7,2) suplementado con 10% (v / v) inactivado por calor suero fetal de ternero (FCS ), 2 mM de glutamina y 0,1 mg / mL de penicilina y estreptomicina tanto y mantenerse a 37 ° C en un ambiente humidificado de 5% de CO 2 en el aire. Células, sin semillas, en una densidad de 3 × 10 5 células / mL, fueron incubadas en ausencia o en presencia de 20 μ M AZT durante 3 h en la rutina de los experimentos. Otras condiciones experimentales también fueron juzgados (de 2 a 40 μ M AZT de 5 min a 48 h), pero aquí las que se informó fueron los que dieron tanto la mejor reproducibilidad de los datos y las principales diferencias entre los no tratados (control) y tratadas con AZT Muestras de células. Por lo tanto, una dosis o un tiempo de respuesta de curva de respuesta no se incluyeron ya que no es necesario. Células en la fase de crecimiento exponencial se ha cosechado para los experimentos. Sin embargo, el crecimiento de las células no mostró ningún cambio apreciable en todas las condiciones experimentales que utilizan. Conteo de células y la viabilidad fueron determinadas en distintos momentos por el método de exclusión con azul de tripan.

Células de tratamiento para el análisis proteómicos

K562 celdas, solos o incubadas con 20 μ M AZT durante 3 horas a 37 ° C, se lavaron dos veces con PBS (20 mM K-buffer fosfato, pH 7,2, con 150 mM NaCl). El pildoradas células (1 × 10 6 células) fueron tratados con 10 μ l de buffer de lisis (8 M urea, 2% CHAPS, el 0,3% de TDT, 2% IPG buffer de pH 3-10 (Amersham, de Milán, Italia), 5 μ l Bromofenol azul) a 4 ° C por 20 min. Cell extractos fueron sonicated 4 veces durante 10 s cada uno, a la máxima potencia en un baño de hielo y luego se centrifuga durante 15 min a 15000 g (4 ° C). La clara sobrenadantes que contienen las proteínas soluciones fueron recogidos y almacenados a -80 ° C durante no más de una semana antes de la posterior análisis. La concentración de proteínas fue determinada de acuerdo a Bradford [54].

Bidimensional en gel de electroforesis (2DE)

Aproximadamente 800 μ g de extracto de proteína de cada muestra fueron tratados con 2-D Clean-Up Kit (Amersham, de Milán, Italia) para eliminar los altos niveles de sal y otros compuestos de interferencia. Los pellets (200 μ g) se resuspendió en 150 μ l de solución de rehidratación (8 M urea, 0,5% v / v Triton X-100, 20 mM DTT, 2% v / v IPG buffer de pH 3-10) para la primera dimensión de la FEI. Once cm de largo, pH 3-10 pH inmovilizados gradiente lineal tiras se rehidrata con la muestra y luego se centró según el método de Bjellqvist et al. [55]. En pocas palabras, se IPG tiras equilibrado durante 10 minutos con el IPG equilibrio de amortiguación (0,5 M Tris-HCl pH 6,8, 6 M urea, glicerol 30% v / v, SDS 1% w / v, 0,6% de TDT w / v). Después de 10 minutos se repitió el procedimiento con otro IPG equilibrio buffer que contiene 0,3% w / v en lugar de la Academia de TDT y 5 μ l de solución de azul de bromofenol. Para la segunda dimensión, en un gel vertical de la losa del 12,5% de acrilamida se utilizó y SDS-PAGE se realizó a los 20 mA por gel durante 60 minutos a una temperatura ambiente. Geles de la noche a la mañana se tiñeron con azul de Coomassie coloidal (0,1% w / v Coomassie G250 azul brillante, el 34% v / v metanol, el 3% v / v de ácido fosfórico, y el 17% w / v de sulfato de amonio), mientras que destaining se realizó con un Solución de 5% v / v en ácido acético, hasta un claro de fondo se logró [56]. Cinco réplicas para cada condiciones (control y tratados con AZT) se hicieron. Además, los mismos experimentos se repitieron dos veces y las manchas que se reproduce constantemente, así como los que mostraron una diferencia de intensidad superior al 25%, fueron analizados.

Proteínas patrón de análisis

La 2DE geles fueron escaneados por una estación de trabajo PC estándar y se analizaron con el software ImageJ [25, 26] (Fig. 1]. Un fósforo conjunto fue creado a partir de los patrones de proteínas de los dos extractos celulares independientes (control de las células K562, K562 tratados con AZT células). Spot cantidades de los geles se normalizaron para eliminar la no expresión relacionada con variaciones en la intensidad in situ. Los resultados fueron evaluados en términos de terreno píxeles. El análisis estadístico permitió el estudio de las proteínas que se aumentó significativamente (o disminución).

Identificación de proteínas por espectrometría de masas

Spots seleccionados manualmente fueron extirpados de geles y un gran número de muestras simultáneamente fueron digeridos con tripsina-En el uso de gel Digest96 Kit ™ (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.), con arreglo a las instrucciones del fabricante. Una mínima parte alícuota de la mezcla obtenida péptido tríptico fue mezclado con un volumen igual de una solución de α-cyano-4-hidroxi-trans-cinnamic ácido matriz, saturada en el 50% v / v acetonitrilo que contiene 0,1% v / v TFA, y Manchas en una placa de MALDI objetivo. Matrix asistida por láser de desorción / ionización de tiempo de vuelo-espectrometría de masas (MALDI-ToF-MS) se realizaron análisis en un Voyager ™ STR-DE instrumento (Applied Biosystems, Framingham, MA, EE.UU.), equipado con un láser de 337 nm de nitrógeno y Reflector de funcionamiento en modo de espera. Misa datos fueron obtenidos por la acumulación de varios espectros de disparos de láser con una tensión de aceleración de 20000 V. Todos los espectros de masa fueron calibrados externamente utilizando una mezcla estándar péptido que contiene des-Arg-bradicinina (904.4681), la angiotensina I (1296,6853), 1-17 ( 2093,0867) y 18-39 (2465,1989) de hormona adrenocorticotropa fragmentos. Dos tríptico autolíticas péptidos también fueron utilizados para la calibración interna (m / z 842,5100 y 2807.3145) (Tabla 1]. Validación de las identificaciones de espectrometría de masas se intentó por correspondencia en la base de datos Swiss-2DPage http://www.expasy.ch.

Búsquedas en bases de datos

Una masa monoisotopic lista de cada proteína terreno se obtuvo de MALDI-ToF datos después de la exclusión de los valores de masa contaminante espera (autolíticas tríptico péptidos tríptico humanos y fragmentos de queratina), automáticamente logrados por el programa PeakErazor http://www.protein.sdu.dk / Gpmaw / Ayuda / PeakErazor / peakerazor.html. Estos péptidos masa huellas dactilares (PMF) se utilizaron para buscar candidatos proteína humana en el SWISS-PROT base de datos utilizando el motor de búsqueda de Mascotas en el sitio http://www.matrixscience.com, con los siguientes parámetros: una división perdido el permiso, 50 Ppm medición de la tolerancia y al menos cinco se pongan en venta péptido masas. Oxidación en metionina (variable modificación) y S-carboxyamidomethylation en residuos de cisteína (fijo modificación) también fueron considerados. No después de la traducción modificaciones se permitió. Identificaciones positivas fueron aceptadas con valores de p (la probabilidad de que el fósforo se observó un suceso) a 0,05 (cuadro 2].

Abreviaturas

AZT: 3'-azido-3'-deoxythymidine o zidovudina; 2DE: en dos dimensiones electroforesis en gel; TDT: 1,4-dithio-DL-threitol; ER: retículo endoplasmático; VIH: virus de la inmunodeficiencia humana; HSP-60: 60 KDa de proteínas de choque térmico; IEF: inmunoelectroforesis; IPG: gradiente de pH inmovilizados; MALDI-ToF-MS: matriz asistida por láser de desorción / ionización-tiempo de vuelo de la espectrometría de masas; NDPK-A: nucleósido difosfato quinasa A; PDI-A3: proteína Disulfuro isomerasa A3; PMF: péptido masiva de huellas dactilares; SOD1: superóxido dismutasa citosólica; TFA: ácido trifluoroacético.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

GD'A fuertemente elaborado el proyecto, el diseño y la redacción del manuscrito; ARL ha participado en la siembra, el mantenimiento y el tratamiento de las células K562; SV llevó a cabo en dos dimensiones electroforesis en gel de análisis; LDF participó en el análisis de la proteína patrón de las imágenes digitales; AG realizó la identificación de proteínas mi espectrometría de masa; GM participado en búsquedas en bases de datos; AO participó en la redacción del manuscrito; AB ha participado como experto en farmacología AZT y en la revisión crítica del manuscrito.

Agradecimientos

Este trabajo fue parcialmente apoyado por fondos de PRIA (Progetti di Rilevante Interesse d'Ateneo) 2001, de PRIN (Progetti di Rilevante Interesse Nazionale, MIUR 2004), y de la ex MURST 60%. Los autores desean agradecer a la Prof ME Schininà (Centro di Eccellenza di Biologia Molecolare, Università La Sapienza, Roma, Italia) por su valiosa contribución en el análisis de las huellas dactilares péptido masa.