Head & Face Medicine, 2006; 2: 6-6 (más artículos en esta revista)

Kinetic mediciones de oxígeno por CVC96 L-929 en cultivos celulares

BioMed Central
Ulrich Plate (plateu@uni-muenster.de) [1], Tobias Polifke (Tobias.Polifke @ web.de) [2], Dieter Sommer (sommerd@uni-muenster.de) [1], Jörg Wünnenberg (joerg. Wuennenberg@ukmuenster.de) [1], Hans-Peter Wiesmann (wiesmap@uni-muenster.de)
[1] Departamento de Cirugía Cráneo-Maxilofacial de la Universidad de Münster, Waldeyerstraße 30, D-48129 Münster, Alemania
[2] O2-SCAN GmbH, Mendelstr. 7-48149 Münster, Alemania

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Resumen

En general, y de los animales y el uso de células de oxígeno durante toda su vida. En consecuencia, el uso de oxígeno es un indicador simple para poner a prueba la vitalidad de las células. Cuando la vitalidad disminuye en la entrega de las sustancias tóxicas el descenso se puede observar directamente por el uso de oxígeno de las células. Para obtener información rápida de la vitalidad de las células que hemos medido la tensión de O 2-mediante el ensayo de un nuevo modelo de biorreactor, el Cell Vitalidad Checker 96 (CVC96), en la aplicación práctica. Con este CVC96, pronto una simple prueba existe para la medición de la utilización de oxígeno. A este respecto, la cuestión tenía que ser respondidas si el uso en el laboratorio y si es fácil de oxígeno como parámetro en la vitalidad de prueba también se puede aplicar en el futuro para los problemas en el campo de pruebas de material.

Antecedentes

Un reciente problema para los huesos y cartílagos de la ingeniería de tejidos se alzará escala productos de la investigación a un nivel reproducible de la fabricación de tejidos de sustitución que es clínicamente eficaz, por ejemplo mediante el uso de biorreactores [1, 2]. Biorreactores pueden considerarse como dispositivos en los que biológica y / o procesos bioquímicos se realizan bajo condiciones controladas (por ejemplo, pH, temperatura, presión, el suministro de oxígeno, el suministro de nutrientes y eliminación de residuos). La mayoría de los biorreactores fueron desarrollados inicialmente para probar biomateriales [3]. La supervivencia de las células in vivo, así como en biorreactores depende de la respuesta de las distintas células para el medio ambiente. A mayor tensión de oxígeno, por ejemplo, es necesaria para la diferenciación osteoblástica, mientras que la hipoxia prolongada favorece la formación de cartílago o tejido fibroso [4]. El ajuste de la tensión de oxígeno en biorreactores, por lo tanto, es un aspecto crítico en el diseño de bioreactor. El más simple y más ampliamente utilizado para el bioreactor de hueso y de cartílago ingeniería de los tejidos de hoy es, en efecto, el plato de la cultura [5]. Y de los animales y el uso de células de oxígeno durante toda su vida. En consecuencia, el uso de oxígeno es un indicador simple para poner a prueba la vitalidad de las células.

Vitalidad y pruebas de citotoxicidad se establecen técnicas en diferentes campos, como el cultivo de células de control, de búsqueda de agentes activos y también en otras técnicas médicas. Para el amplio campo de la tecnología médica pertenece también la puesta a prueba de biocompatibilidad en la esfera del desarrollo y el examen de los dientes y huesos de sustitución de los tejidos en cirugía craneo-maxilliofacial. El grupo de investigación de biomineralización y de la ingeniería de los tejidos de este departamento lleva a cabo las pruebas de biocompatibilidad.

Métodos

Hasta ahora, el curso temporal de reacciones en las células tóxicas influencias se puede observar solamente con un alto aporte de mano de obra el tiempo (y los costos). Debido a esta elevada aportación que hemos probado la nueva tecnología de medición CVC96 con un breve ensayo en aplicaciones prácticas. CVC96 permite la posibilidad de observar y evaluar las pruebas de células también kinetically. Este nuevo campo de pruebas de vitalidad fue la razón fundamental para la aplicación de pruebas en nuestra unidad de investigación. CVC96 es una tapa de 96-y las placas de cultivo celular, que se utiliza en lugar de la estándar de la tapa. CVC96 tiene un pin para cada bien, que se coloca en el medio de un pozo (Fig. 1a, b]. Esto significa, las clavijas se sumergen en el medio de cultivo celular. El pin está en el medio, sin tener contacto con las células en la parte inferior del pozo. La parte superior de cada pin está cubierto por una membrana de gas. Dentro de esta membrana un tinte fluorescente se inserta, lo que demuestra su fluorescencia en la dependencia de la tensión de O 2. Así CVC96 muestra de O 2 dependiente de señales sin contacto de las células o la irritación de las células. En este caso, un simple lector convencional de fluorescencia para placas micro título es suficiente para leer después de la incubación. Durante las mediciones completas no hay contacto de la clavija o colorante fluorescente a las células y no productos químicos que se han añadido, lo que se ahorraría el procedimiento de pipeteado. Dado que las células no están influenciados por la medición, las mediciones se puede repetir en cualquier momento y por lo tanto un perfil cinético puede ser registrado. Esto no es posible con las pruebas de vitalidad, que son ensayos de punto final. Así, es posible obtener los datos más relevantes que hasta ahora, ya que también la velocidad de las respuestas celulares se puede determinar directamente. Además, una clara prueba de evaluación de un posible experimento es a menudo muchas horas antes, porque el "punto final" de un ensayo no tiene por qué ser esperada. La nueva prueba puede ser controlado durante su curso y se detuvo tan pronto como un claro resultado es recibido. Dado que las células no se consumen o afectados durante la prueba, además con el mismo análisis de las células son posibles si es necesario. Por ejemplo después de una prueba experimental de células utilizan también los medios de comunicación se puede tomar con el fin de determinar, después del correspondiente análisis, las tasas de absorción de los materiales tóxicos subletales, porque las células permanecen intactos y contienen sustancias absorbidas. Un control microscópico de las células después de que el ensayo también es posible. El efecto sobre la vitalidad de las células inclusive se pueden recibir visual y correlacionados en un solo ensayo. La prueba práctica se llevó a cabo con CVC96, amablemente prestada por el productor Sanochemia Diagnóstico de las primeras series de productos. El análisis de una utilidad general en un laboratorio es un punto fundamental de interés. Es el objetivo de averiguar si el uso y la medición sería fácil. Otra cuestión es si la calidad y la verosimilitud de los datos recibidos serán convincentes. Por último, la cuestión de nuestra unidad de investigación debe ser contestada, si nuestro proyecto de investigación de este ensayo podría utilizar en el futuro. Los experimentos se llevaron a cabo en la L-929 cultivos celulares (Tab. 1] [6 - 9].

La L-929 cultivos celulares fueron sembradas en 96 pozos. Después de convertirse en confluentes, las células fueron tratadas con tres tipos diferentes de los medios de comunicación: a) los medios de comunicación que habían sido incubados durante 10 días con PMMA (poli-metil-metacrilato), un material inerte preferible para aplicaciones de la tecnología médica, b) los medios de comunicación que habían Sido incubados durante diez días con una matriz de colágeno, un material conocido para apoyar el crecimiento de las células óseas. Además del tratamiento diferenciado células también se midieron las células no tratadas como referencia. Más glutaraldehído, una sustancia química tóxica, se añadió a la L-929 en cultivos de células diferentes concentraciones (0,1%, 1,0%, 10%). Las células fueron mantenidas a 37 ° C en incubadoras de CO 2 durante todo el tiempo experimental y fueron retirados de la incubadora sólo para las mediciones. Las mediciones se llevaron a cabo en un lector de fluorescencia, FLX800T instrumento de Bio-Tek Instruments GmbH, con la que los datos se podrían leer en los archivos discontinuos cinética. Los mismos medios de comunicación modificados con PMMA y colágeno también se realizarán las pruebas de la vitalidad de células de la misma con el siguiente intento de evaluación por un Resazurin-ensayo (CCS-PRINCESS ® Instant CELIA citotoxidad de ensayo-2004).

Resultados y discusión

Vida humana y animal y el uso de células necesitan oxígeno, de manera que el medio de cultivo con las células vivas contiene relativamente menos oxígeno que la atmósfera circundante. Difunde continuamente oxígeno en el medio de cultivo celular. Glutaraldehído induce la muerte de células y, por tanto, el consumo de oxígeno por las células vivas y se reduce el porcentaje de oxígeno en la célula aumenta mediano (Fig. 2, arriba). No sólo evolucionan resultados claros, que reflejan la fila de las diferentes concentraciones de la sustancia tóxica glutaraldehído, pero, además, esta cinética de registro es la base para más adelante la información. Un claro resultado correcto de los ensayos ya se traduciría en 5-10 horas. Así que el tiempo de trabajo para llegar en primer utilizable resultados se pueden guardar en este experimento cinético. Además del principio de idoneidad de las pruebas para el esclarecimiento de los efectos citotóxicos también es muy importante para las aplicaciones clínicas de conocer la aplicabilidad de este ensayo clínico se refiere a los materiales, aquí PMMA y matriz de colágeno (Fig. 2, la parte inferior). Estas dos sustancias se incubaron con células de mediano según el cual la influencia de las dos sustancias en las células es suficientemente conocido, y ambos son utilizados en la investigación médica y dental aplicación. Los medios de comunicación fueron manipulados esterilizados nuevamente, respectivamente, y las células utilizados como medios de comunicación en los siguientes experimentos CVC96. La medición del consumo de oxígeno celular es una herramienta suficiente para la caracterización de la célula de promoción o una alteración en la actividad de células in vitro por los biomateriales.

Las diferencias entre la influencia de la matriz de colágeno, que muestra como se espera a un claro efecto estimulante sobre las células y la de PMMA, que no mostró diferencias al medio sin tratar, es claramente visible (Fig. 2, la parte inferior). También para esta pregunta clara los resultados se puede observar después de 5 a 10 horas.

La comparación de las mediciones por un Resazurin ensayo muestran tendencias idénticas (Fig. 3]. Para esta primera prueba práctica de CVC96, la Resazurin ensayo que se ha hecho sólo con n = 8, ya que los efectos de PMMA y colágeno son bien conocidos [10 - 13]. Si bien el degradado medio PMMA-muestra idéntica a la vitalidad medio sin tratar una clara estimulación se puede observar con la matriz de colágeno. Desde la Resazurin-ensayo muestra un consumo de "punto final" determinación sólo un punto de medición después de 20 h de incubación se registra.

El uso de los nuevos ensayos de CVC96-es más fácil en relación a los ensayos estándar, debido a que el trabajo de pipeteado medidas no son necesarias. La calidad de los datos y su fiabilidad aumento de cinética de evaluación. Los experimentos pueden llevarse a cabo en menos tiempo, porque en muchos casos no normalizada temporal de punto final de la medición tiene que ser esperado.

Conclusión

Hasta ahora sólo los resultados de las primeras pruebas de la praxis puede ser demostrado. Superando esta primera prueba práctica en el futuro, la validez de los datos en relación con las pruebas estándar debe ser investigado intensamente a fin de que posteriormente cuestiones fundamentales de la biocompatibilidad pueden ser investigados por materiales puros y mixtos. Consideramos que CVC96 como un interesante ensayo que permite nuevas posibilidades de las investigaciones sobre la base de observaciones y cinética da nuevas perspectivas y resultados más rápidos. Por lo tanto, debería ser ampliamente validado después de ser puesto en el mercado por el productor. Esto incluirá estadísticos pertinentes pruebas con diferentes tipos de células y un mayor número n de la prueba material.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia. O2-SCAN GmbH no tiene ningún interés financiero en el presente estudio.

Contribuciones de los autores

HPW y UP han diseñado y administrado el estudio. TP ha analizado los datos. DS ha preparado los cultivos celulares y de las sondas. JW ha medido las unidades fluorescentes. Todos los autores han contribuido a la preparación del manuscrito.

Agradecimientos

Este proyecto cuenta con el apoyo de subvención WI 1769/1-2 de la Deutsche Forschungsgemeinschaft.