Proteome Science, 2006; 4: 3-3 (más artículos en esta revista)

Optimización de la utilización de proteínas extraídas TRIzol-en la superficie reforzada Laser Desorption / Ionization (SELDI) Análisis

BioMed Central
Tsz-Man Kwong (tman@bcm.tmc.edu) [1], Yiting Li (yitingl@bcm.tmc.edu) [1], Tu Dang Anh (tdang@ciphergen.com) [2], Jianhe Shen (jjshen @ Txccc.org) [1], Laszlo Perlaky (lxperlak@txccc.org) [1], C Lau Ching (cclau@txccc.org) [1]
[1] Texas Children's Cancer Center, Departamento de Pediatría, Baylor College of Medicine, Houston, Texas, EE.UU.
[2] Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Investigación con muestras clínicas siempre está obstaculizada por la limitada disponibilidad de las muestras pertinentes, que impliquen la utilización de una sola muestra de múltiples ensayos. TRIzol es un reactivo para la extracción de RNA, pero las fracciones de ADN y de proteínas también se puede utilizar para otros estudios. Sin embargo, poco se sabe acerca del uso de TRIzol-extrajeron las proteínas en la investigación proteómica, en parte porque las proteínas extraídas de TRIzol son muy resistentes a la solubilización.

Resultados

Para facilitar el uso de las proteínas extraídas de TRIzol, primero frente a la capacidad de cuatro diferentes común solubilizing reactivos para solubilizar la TRIzol de proteínas extraídas de una línea celular de osteosarcoma, U2-OS. A continuación analizamos los solubilizados de las proteínas de superficie mejorada Laser Desorption / Ionization técnica (SELDI). Los resultados mostraron que la disolución de las proteínas extraídas TRIzol-con 9,5 M de urea y 2% CHAPS ([3 - [(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] propanesulfonate]) (UREA-CHAPS) fue significativamente mejor que el nivel del 1% en términos SDS Solubilización de la eficiencia y el número de picos de iones detectables. Usando tres diferentes tipos de matrices SELDI (CM10, H50, y IMAC-Cu), hemos demostrado que la detección de pico con proteínas solubilizados por UREA-CHAPS es reproducible (r> 0,9). Más SELDI análisis indicó que el número de iones de los picos detectados en TRIzol extrajeron las proteínas-es comparable a un método de extracción directa, lo que sugiere muchas proteínas aún permanecen en la fracción proteica TRIzol.

Conclusión

Nuestros resultados sugieren que la UREA-CHAPS realizado muy bien en solubilizing TRIzol de proteínas extraídas de SELDI aplicaciones. Fracciones proteicas más de la izquierda después de la extracción de TRIzol ARN podría ser una valiosa fuente para el descuidado pero proteómicos análisis bioquímicos o adicionales cuando no se dispone de muestras.

Antecedentes

TRIzol es un reactivo de la extracción de ARN que se han utilizado en conjunto con el análisis de microarrays y otras aplicaciones [1 - 4]. Una de las ventajas de TRIzol es su capacidad de extracción de ARN, el ADN y las proteínas a partir de una única muestra. Sin embargo, TRIzol está diseñada sobre todo para la extracción de RNA y de la utilización de TRIzol extrajo el ADN y las proteínas para su posterior análisis es todavía limitado. ADN y las proteínas de las fracciones TRIzol extracción son recursos valiosos para los investigadores, cuando la cantidad del material de partida es limitado, tales como las pequeñas clínicas. Además, si las distintas fracciones extraídas de la misma muestra se utilizan para el análisis de las diversas plataformas de alto rendimiento, como la gama de expresión, SNP array, y proteómicos análisis, la correlación de los conjuntos de datos resultante será menos probable que sean afectados por la heterogeneidad del tejido [5, 6]. Nos han informado de que todo el genoma de amplificación de ADN extraído de TRIzol fracción reveló genotípicas similares aberraciones en Affymetrix SNP arrays 10 K en comparación con unamplified DNA y la hibridación genómica comparada tradicionales [7]. Sin embargo, el potencial de utilización de las proteínas extraídas de TRIzol en aplicaciones de la proteómica, como la espectrometría de masas basado en la tecnología es todavía en gran medida desconocidos. Una de las razones es que TRIzol-extrajeron las proteínas son muy resistentes a la solubilización de usar el reactivo solubilizing, 1% SDS como recomendar TRIzol por el manual de usuario. Esto dificulta el uso de estas proteínas para su posterior análisis.

Para abordar este problema, hemos evaluado la eficiencia de TRIzol solubilización de las proteínas extraídas por cuatro solubilizing reactivos de uso común. También se analiza el número de picos detectados de iones y de la reproducibilidad de la cresta de la intensidad solubilizados proteínas en tres diferentes tipos de variedad de superficie mejorada Laser Desorption / Ionization (SELDI). Además, las combinaciones de solubilizing regente y variedad de TRIzol tipo de proteínas extraídas fueron evaluados. Elegimos SELDI para analizar las proteínas, porque es una rápida y sensible de alto rendimiento proteómicos técnica, que se ha utilizado para descubrir biomarcadores en la proteína básica y los estudios clínicos usando cantidad limitada de material [8, 9]. Este es el primer informe de la utilización de las proteínas extraídas de TRIzol en SELDI estudios.

Resultados y discusión
Solubilización eficiencia de los distintos reactivos

Para identificar la mejor solubilizing reactivo, TRIzol de proteínas extraídas de una línea celular humana osteosarcoma (U S-2A) fueron solubilizados con cuatro solubilizing reactivos, es decir, ACN (10% Acetonitrilo, pH 4.8), TRITON (1% Triton, pH 5,3 ), UREA-CHAPS (9,5 M Urea y el 2% CHAPS, pH 9,1) y SDS (1% SDS, pH 5.3). Estos cuatro solubilizing reactivos fueron seleccionados en este estudio ya que son de uso común en la disolución de diversas muestras de las proteínas. La solubilización de eficiencia se calcula como el porcentaje de la cantidad de proteínas solubilizados dividido por el peso inicial de la proteína de pellets. Los resultados mostraron que UREA-CHAPS solubilizados significativamente mayor cantidad de proteínas que los otros tres solubilizing reactivos (Fig. 1]. La eficiencia de solubilización UREA-CHAPS era de 8,8 veces más alto que el de la norma del 1% SDS, que se utiliza a menudo para disolver TRIzol-extrajeron las proteínas. Además de las diferencias intrínsecas de los reactivos, el pH del solvente también desempeña un papel importante en la eficiencia solubilizing. Nuestra conclusión es coherente con Banerjee et al [10], que mostró que el aumento de pH aumenta de manera significativa el rendimiento de la proteína total de proteínas extraídas de TRIzol "pellets".

Número de iones picos detectados por SELDI

Aunque UREA-CHAPS solubilización dio mayor eficiencia, que no estaba seguro si el solubilizados mezcla es adecuada para el análisis proteómicos. Por lo tanto, se utilizó una técnica denominada SELDI proteómicos para medir la cantidad de proteínas detectables en la solubilizados mezclas. Solubilizados proteínas de diferentes experimentos fueron avistados en tres tipos diferentes de SELDI arrays, H4 hidrofóbico, la debilidad de catiónico CM10, y el metal (cobre) vinculante IMAC-Cu. Estos tres diferentes tipos de matrices tienen diferentes propiedades químicas de unión a diferentes subconjuntos de proteínas en la solubilizados mezclas de proteínas. Usando diferentes combinaciones de reactivos y solubilizing gama tipos, podríamos optimizar la condición para el análisis de las proteínas extraídas de TRIzol usando SELDI método.

Con el fin de detectar las proteínas con diferentes pesos moleculares, dos niveles de energía láser (bajo y alto) han sido utilizados en el análisis SELDI. Después de los correspondientes perfiles fueron recolectados (Fig. 2], el número de picos detectados de iones se midió. Se encontró que el número de iones con picos de aumento de aumento de la energía láser (Tabla 1]. Esto es coherente con el hecho de que tenemos una gran variedad de masas en el mayor establecimiento de láser en comparación con el láser de los ajustes más bajos. Entre los cuatro solubilizing reactivos, que hemos detectado el menor número de picos de iones (de baja y de alta configuración láser) en el nivel del 1% de proteínas SDS solubilizados preparación con los tres tipos de matriz (número máximo = 10 - 14, la imagen 3]. . Sin embargo, cuando se combinan todos los picos detectados por los tres vectores, el número más alto de los picos de iones se detectó en TRITON o UREA-CHAPS solubilizados proteína preparación (número máximo es de alrededor de 160, Fig 3]. Aunque los tres diferentes vectores están diseñados para capturar las proteínas con diferentes propiedades químicas, algunas proteínas de Mayo se unen a múltiples tipos de matriz. Por lo tanto, el único número de picos podrían ser inferiores a los números que aparecen más arriba. Curiosamente, el número de proteínas solubilizados detectado por SELDI que no existe correlación entre la concentración de proteínas de las mezclas de proteínas, lo que sugiere que el número de iones picos detectados por SELDI puede verse afectado por otros factores distintos de la concentración de proteínas, como la eficacia vinculante de la Solubilizing reactivos a los arrays. Por otra parte, la sensibilidad de SELDI puede ser ya lo suficientemente alto como para detectar picos de iones en las muestras con concentraciones bajas de proteína. Cuando se comparó a los distintos tipos de variedad, la combinación de UREA-CHAPS reactivo y CM10 gama capturado el mayor número de picos (número máximo = 75, Fig. 3]. Sin embargo, los preparativos TRITON solubilizados proteína mostraron un número relativamente más consistente de detectar picos en los tres tipos de matriz (número máximo = 48-58, Fig. 3].

Reproducibilidad

A continuación, se midió la reproducibilidad de la solubilización y la detección mediante el cálculo de la pareja paramétrico de Pearson coeficientes de intensidad en el pico triplicado solubilización experimentos realizados en días diferentes (Fig. 4]. Además, la reproducibilidad de los puntos duplicados de la misma prueba también se calculó. Los coeficientes de Pearson CM10, H4, y IMAC-Cu fueron 0,96, 0,82, 0,90, respectivamente. La alta correlación de las dos manchas de la misma experiencia sugiere que la variabilidad de las mediciones SELDI fue baja. La reproducibilidad de CM10 resultado es consistente con un estudio reciente, utilizando el mismo tipo de chip [11].

En comparación con el reproducibilidad global, el nivel del 1% SDS solubilización fue la más baja entre los cuatro solubilización reactivos de la prueba (r = 0,76 - 0,83, Fig. 4]. ACN mostraron reproducibilidad de alta gama y con H4 TRITON mostró alta reproducibilidad con CM10 y H4 arrays. Sin embargo, sólo UREA-CHAPS solubilización mostraron consistentemente altos de reproducibilidad en los tres tipos array (r> 0,9) (Fig. 4]. UREA-CHAPS junto con IMAC-Cu gama alcanzado el más alto entre todos los reproducibilidad solubilizing reactivo-combinaciones de tipo array (Fig. 4].

Comparación entre directos e TRIzol extracciones

A pesar de que estaban interesados principalmente en el uso de TRIzol de proteínas extraídas en este estudio, para evaluar la utilidad de las proteínas extraídas de TRIzol en SELDI aplicaciones, también comparó el número de proteínas extraíbles TRIzol mantenerse en la fracción proteica a la de un método de extracción directa. Con este fin, UREA-CHAPS, que mostró la mayor eficiencia de solubilizing TRIzol de proteínas extraídas en este estudio, se utilizó para extraer directamente las proteínas de la célula U2-OS de pellets. Peak números detectados por SELDI mezclas de la proteína extraída de los dos enfoques se compararon sobre CM10 arrays. (Tabla 1]. Los resultados mostraron que el número de picos extraídos del método directo es muy comparable a la extracción de TRIzol unido a la misma UREA-CHAPS solubilizing reactivo (Tabla 1]. El número de picos detectados en nuestro estudio es también similar a un estudio previo usando SELDI análisis de las proteínas extraídas directamente (número máximo = 50). [12] Sin embargo, dado que las proteínas vinculadas a una determinada gama SELDI es sólo un subconjunto del proteoma celular, el número real de especies de proteínas en la TRIzol-extrajeron las proteínas debe ser aún mayor. Además, el fraccionamiento o immunodepletion también seguir aumentando el número de proteínas que se detectó mediante la reducción de efecto de la represión abundantes proteínas. Por lo tanto, creemos que una parte considerable de las proteínas es aún conservado en TRIzol-extrajeron fracciones proteicas. Estas fracciones proteicas deben ser valiosa para el análisis proteómicos, especialmente si otra muestra de tejido de la misma no está disponible.

Conclusión

En este estudio se evaluaron la utilización de las proteínas extraídas TRIzol-SELDI-basado en el análisis proteómicos. Nuestro estudio es útil para la investigación proteómica clínica, que sólo podrá disponer de las muestras de tamaño limitado y tenemos que confiar en TRIzol tanto para extraer ARN y proteínas de la misma muestra. Entre los cuatro solubilizing reactivos de la prueba, SDS-solubilizados proteínas mostró la menor pico números reproducibilidad y pobres, lo que sugiere la incompatibilidad de las existencias con SELDI. Aunque SDS es recomendar por el TRIzol manual, la utilización de las existencias se debe evitar en SELDI basada en aplicaciones de proteómica. Por otra parte, UREA-CHAPS realizado muy bien en solubilizing TRIzol-proteína extraída. SELDI análisis detectó gran número de picos en UREA-CHAPS solubilizados, TRIzol-extrajeron las proteínas y mostró coherente reproducibilidad entre los tres tipos de SELDI matrices utilizadas. También solubilizados número similar de picos en TRIzol-extrajeron las proteínas en comparación con el método de extracción directa, lo que sugiere que parte importante de las proteínas es aún presentes en la fracción proteica TRIzol. Además, desde UREA-CHAPS es un uso común solubilizing o reactivo de extracción [13, 14], el uso de UREA-CHAPS para solubilizar TRIzol-extrajeron las proteínas podría extenderse a otras técnicas de proteómica, como 2-D gel. A partir de los resultados de nuestro estudio, ACN, y la TRITON UREA-CHAPS son compatibles con todos los SELDI aplicación. Desde diferentes tipos de chips detectar diferentes subconjunto de proteínas, la selección de chip tipo debe basarse en las proteínas de interés.

Métodos
Reactivos

TRIzol reactivo se adquirió de Invitrogen (Carlsbad, CA). Isopropanol, el clorhidrato de guanidina, [3 - [(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] propanesulfonate] (CHAPS) fueron adquiridos a Sigma (St. Louis, MO). Acetonitrilo y urea fueron de Fluka (Buchs, Suiza). Triton fue de Supelco (Supelco Park, PA). McCoy 5A del medio, la penicilina-estreptomicina, la tripsina-EDTA, de búfer fosfato salino y el 10% fueron de Gibco SDS-Invitrogen (Grand Island, NY). Suero fetal bovino se fromGemini (Woodland, CA). DC proteína Kit de ensayo fue de Bio-Rad (Hercules, CA).

Cultivo de células

Osteosarcoma Humanos U-2 OS línea celular (HTB-96) se adquirió de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las células fueron cultivadas a 37 ° C en la McCoy 5A suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U / mL de penicilina y 100 μ g / ml de estreptomicina en el 5% de CO 2.

La extracción de proteínas usando TRIzol

Las células fueron digeridos con 0,25% de tripsina-EDTA, lavar tres veces con buffer fosfato salino-y pildoradas por centrifugación a 200 g durante 10 minutos. La célula se almacena en gránulos de -80 ° C antes de su uso. Un mililitro de reactivo TRIzol se añadió a cada 60 mg de células de pellets. Después de la extracción de ADN y ARN, las proteínas se precipitó por isopropanol. La proteína de pellets se lavan tres veces en 0,3 M guanidina hydrochloride/95% de etanol, luego se centrifuga y se lava con un 100% de etanol. Después de la centrifugación y la eliminación de etanol, la bolita se seca en SpeedVac. Proteína pellets se almacenaron a -20 ° C antes de su uso.

La disolución de la proteína de pellets utilizando reactivos solubilizing

La proteína a partir de pellets se extrae de 30 mg de células de pellets. Entonces se divide en cuatro partes y cada parte se disolvió con 50 μ l de uno de los cuatro reactivos solubilizing durante dos horas: a saber ACN (10% Acetonitrilo, pH 4.8), TRITON (1% Triton, pH 5.3), UREA-CHAPS (9,5 M de urea y 2% CHAPS [3 - [(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio] propanesulfonate], pH 9,1) (ProteinChip Guía de Aplicación, Ciphergen Biosystems, Fremont, CA) y SDS (1% SDS, pH 5,3, el reactivo TRIzol Manual, Invitrogen, Carlsbad, CA). SDS solubilización se realizó a los 50 ° C con ocasionales vórtice de acuerdo con el manual de TRIzol. Solubilización por otros tres reactivos se realizó a temperatura ambiente con agitación velocidad a 150 rpm (Ciphergen del ProteinChip Guía de Aplicación). Después de la incubación, las muestras fueron centrifugadas a 16000 g durante 10 minutos a 4 ° C para eliminar cualquier partícula material. Proteína soluciones alicuotar y almacenados a -20 ° C antes de su uso. El proceso de disolución se repitió dos veces más en distintos días (n = 3) para medir la reproducibilidad de los métodos de la solubilización. Para comparar la solubilización eficiencia, la concentración de proteínas de las diferentes muestras se midieron solubilizados por Lowry basado en DC (detergente-compatible) ensayo de la proteína. Para la disolución de prueba de eficiencia, la proteína pellets fueron pesados y la solubilización de eficiencia se calcula como el porcentaje de la cantidad de proteínas de la solubilizados dividido por el peso de la proteína de pellets.

Captura de solubilizados proteínas usando SELDI arrays

Volúmenes iguales (5 μ l) solubilizados de proteínas diluido con carácter vinculante de amortiguación (1:5) de los diferentes experimentos se avistó a tres diferentes tipos de matrices SELDI, H4 hidrofóbico, la debilidad de catiónico CM10, y el metal (cobre) vinculante IMAC3 (Ciphergen Biosystems, Fremont , CA). El pH de las muestras se confirmó diluido a ser la misma antes de aplicar a la matriz. Captura de proteínas se realizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante del equipo (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA). Por H4 gama vinculante, arrays fueron premeditados, con 75% de acetonitrilo en un humidificado cámara de 3 min. Después enjuague con agua grado HPLC, 5 μ l de la muestra que se ha diluido (1:5) en acetonitrilo 5% se aplicó a cada lugar en la matriz. Los arreglos fueron incubadas durante 20 min y lavar tres veces con PBS con 10% Acetonitrilo y 100 mM NaCl. Después de aire de secado, de 0,5 μ l saturados de alfa-cyano-4-hidroxi ácido cinnamic (CHCA) se aplicó dos veces en cada lugar.

Por CM10 gama vinculante, spots fueron pre-humedecida con CM10 dos veces bajo el rigor de amortiguación (0,1 M de acetato de sodio, pH 4.0) durante 5 min. Entonces 5 μ l de la muestra diluida en baja rigor de amortiguación (1:5) se aplicó a cada lugar y se incubaron durante 1 h. Spots se lavaron tres veces con bajo rigor de amortiguación y luego dos veces con agua grado HPLC. Después de aire de secado, de 0,5 μ l de ácido saturado Sinapinic (SPA) se aplicó dos veces en cada lugar.

Por IMAC3 gama vinculante, manchas estaban cubiertas dos veces con solución de carga (100 mM sulfato de cobre) por 15 min. Las matrices fueron luego enjuagados con agua grado HPLC funcionando durante 10 s para eliminar el cobre y luego enjuagarse con solución de neutralización (100 mM de acetato de sodio, pH 4). Después enjuague con agua corriente durante otros 10 s, spots fueron incubadas en 5 μ l de buffer vinculante (0,5 M NaCl en PBS) durante 10 min. Cinco microlitros de muestra diluida en buffer vinculante (1:5) se aplicó a cada lugar y se incubaron durante 1 h después de que las manchas se enjuagarse 6 veces con carácter vinculante de amortiguación y luego dos veces con agua grado HPLC. Después de aire de secado, de 0,5 μ l saturados de SPA se aplicó en cada lugar dos veces.

SELDI y análisis de datos

Las matrices fueron colocados en el Sistema de Proteínas Biológica II espectrómetro de masas para la lectura (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA) y el tiempo de vuelo espectros se generaron a través de dos diferentes (bajo y alto) de láser in situ protocolos. El láser de bajo punto de protocolo para la detección de proteínas de bajo peso molecular con la configuración de la intensidad del láser 185, la sensibilidad del detector de 6 y la optimización van desde 1000 a 9000 Da Da. El láser de alta in situ protocolo con la configuración de la intensidad del láser 250, detector de sensibilidad 8 y optimización de 10 kDa a 150 kDa se aplicó para detectar las proteínas de alto peso molecular. Centro de pulso y deflector automático de la configuración se aplican en terreno los protocolos.

Peak detección se realizó a través ProteinChip Software 3.1 (Ciphergen Biosystems, Fremont, CA). La masa molecular por debajo de 2000 Da fueron eliminados del análisis porque esta zona contiene aductos y artefactos de la Energía Asimilar molécula (EAM) y posiblemente otros contaminantes químicos. Solubilizados espectros de las muestras con el mismo reactivo y se generan por la misma condición de láser se agrupan de referencia y resta. Los espectros se normalizaron al total actual de iones de m / z a partir de 1500 para la proteína de bajo peso molecular o de 10000 para la proteína de alto peso molecular. Picos fueron automáticamente con una relación señal / ruido de> 5 y los picos se agruparon utilizando segundo paso pico de la selección con relación señal / ruido de> 2. Un 0,7% de la masa ventana fue seleccionado para obtener óptimos etiqueta de picos. Pico de la información se ha exportado a Excel y pico número se calcula para cada espectros. Para el análisis de la reproducibilidad, que se estima picos se añadieron para asegurarse de que el pico de la información no es completa para cada grupo.

Paquete estadístico SPSS (SPSS, Chicago, IL) fue utilizado para el cálculo de los coeficientes de Pearson. En nuestro análisis de la reproducibilidad, todos los picos fueron utilizados para los cálculos de correlación. Por el terreno duplicados, que se realiza en el mismo día, pero los repetidos experimentos se realizaron en días diferentes. Los datos de la duplicación de los puntos por primera vez en promedio antes de que fueran utilizados en el cálculo de la reproducibilidad de los resultados obtenidos a partir de replicar experimentos realizados en días diferentes.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto. TAD es un empleado de Ciphergen Biosystems, Inc, el fabricante de SELDI arrays y lector.

Contribuciones de los autores

Yiting Li y Shen Jianhe participaron en la ejecución técnica del proyecto. Tu Dang Anh participó en el análisis de datos y la ejecución de algunos de los experimentos. Laszlo Perlaky preparó el cultivo de células. Lau Ching siempre y dirección de proyectos y la financiación de este proyecto, y participó en la preparación del manuscrito. Tsz-Man Kwong analizaron los datos y dirigió el estudio.

Agradecimientos

Damos las gracias a Wong Kwong-Kwok y Carolyn Pena de revisar el manuscrito. Este trabajo es parcialmente apoyado por el NIH subvención CA81465 (CL), Carl C. Anderson, y Sor Marie Jo Anderson Charitable Foundation (TKM), y Robert J. Kleberg, Jr y Helen C. Kleberg Foundation.