Journal of Experimental & Clinical Assisted Reproduction, 2006; 3: 3-3 (más artículos en esta revista)

Etapa de las variaciones de la anandamida hidrolasa actividad en el útero del ratón naturales durante el ciclo de estro

BioMed Central
Francesca G Klinger (klinger@uniroma2.it) [1], Natalia Battista (battista@med.uniroma2.it) [2], Massimo De Felici (defelici@uniroma2.it) [1], Mauro Maccarrone (Maccarrone @ med. Uniroma2.it) [2]
[1] Department of Public Health and Cell Biology, University of Rome Tor Vergata, 00133 Rome, Italy
[2] Department of Biomedical Sciences, University of Teramo, 64100 Teramo, Italy
[3-00133 Roma, Italia

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Resumen

Estudios recientes han demostrado que los cannabinoides endógenos son importantes moduladores de la fertilidad en los mamíferos. En particular, una función del sistema endocannabinoide en las primeras etapas de desarrollo del embrión, oviductales transporte de los embriones, el embarazo y el trabajo de mantenimiento se ha demostrado en roedores y / o en los seres humanos. En el presente trabajo, se informe el análisis de la actividad de FAAH y contenido de proteína en el útero del ratón en función de las etapas del ciclo del celo natural. Variaciones de la actividad de FAAH se discuten en relación a los cambios en los niveles de esteroides sexuales y a la posible acción de AEA sobre la remodelación de los tejidos uterinos.

Introducción

Estudios recientes han demostrado que los cannabinoides endógenos (bioactivos de ácidos grasos y ésteres, amidas denominan endocannabinoides) son importantes moduladores de la fertilidad en los mamíferos [1, 2]. El endocannabinoide anandamida (N-arachidonoylethanolamine, AEA) y congéneres, cannabinoide CB1 y CB2 receptores, la AEA-síntesis de las enzimas N-acetiltransferasa (NAT) y N-acylphosphatidylethanolamine (NAPE) específicos de fosfolipasa D, la AEA transportador de membrana (AMT) y AEA hidrolizado de la enzima ácido graso amida hidrolasa (FAAH), forman el sistema endocannabinoide. Un papel de este sistema en las primeras etapas de desarrollo del embrión [2], oviductales transporte de los embriones [3], el embarazo y el trabajo de mantenimiento [4, 5], se ha demostrado en roedores y / o en los seres humanos.

Durante el embarazo precoz, una adecuada señalización endocannabinoide en el útero y en el embrión preimplantatorio (ambos expresan receptores CB1, FAAH y AMT), y posiblemente también en las células inmunes circulantes, que parece ser crucial para el desarrollo y la implantación del embrión [2]. En particular, los altos niveles de AEA causa la inhibición de la proliferación en el trofoblasto interimplantation sitios y blastocisto inducir la apoptosis, mientras que los bajos niveles de la AEA en lugares de implantación favor trofoblasto diferenciación y derivación [4, 6 - 8]. En roedores, la variación de los niveles de AEA en el útero grávido ha sido directamente correlacionado con FAAH expresión y actividad uterina en los tejidos [4, 9, 10]. Curiosamente, FAAH actividad y la expresión de mRNA en el nivel puede ser modulada en el útero grávido por el propio blastocisto, y de las hormonas sexuales [4, 10, 11]. Además de embarazadas útero y el embrión preimplantatorio, oviducto es también un objetivo para la acción endocannabinoide. De hecho, en el ratón CB1 deficiencia provoca la pérdida temprana del embarazo debido a la retención de los embriones en el oviducto [3].

En el presente trabajo, se informe el análisis de la actividad de FAAH y contenido de proteína en el útero del ratón en función de las etapas del ciclo natural el celo. Variaciones de la actividad de FAAH se discuten en relación a los cambios en los niveles de esteroides sexuales y a la posible acción de AEA sobre la remodelación de los tejidos uterinos.

Métodos
Tejido uterino recogida durante el ciclo de celo

El ciclo de 4-5 días el celo de ratón fue supervisado por el examen de frotis vaginal y clasificados en cinco etapas; proestro, estro, temprano o tarde-y metoestro dioestrus [12]. CD-1 ratones fueron asesinados por dislocación cervical y de útero rápidamente eliminado en M2 sin BSA [4], cortado en pequeños trozos y rápidamente congelados y almacenados a -70 ° C.

Determinación de la actividad de FAAH y contenido de proteína

La hidrólisis de 10 μ M [3 H] AEA (223 Ci / mmol, de Perkin Elmer Ciencias de la Vida, Boston, MA) por el ácido graso amida hidrolasa (EC 3.5.1.4; FAAH) fue ensayada en la actividad uterina extractos (20 μ g / Prueba) [4], por la medición de la liberación de [3 H] ácido araquidónico, a pH 9,0, en fase reversa por cromatografía líquida de alta resolución [4]. FAAH actividad se expresó como pmol arachidonate liberadas por min / mg de proteína.

FAAH contenido de proteína se determinó en homogeneizado uterino (20 μ g / prueba) por ensayo inmunoenzimático (ELISA), realizado según lo informado [13]. Para la prueba de ELISA de conejo anti-anticuerpos policlonales FAAH [13] fueron preparados por Primm Srl (Milán, Italia) y se utilizaron como primer anticuerpo (diluida 1:300), mientras que la cabra anti-conejo conjugados fosfatasa alcalina (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) fueron utilizados como segundos anticuerpos (diluido 1:2000). Color desarrollo de la alcalina phsphatase reacción fue medida a 405 nm, utilizando p-nitrofenil fosfato como sustrato, y la prueba de ELISA fue lineal en el rango de 0-50 μ g / así de homogenado [13].

Los datos reportados en este trabajo son los medios ± SD de por lo menos cuatro experimentos independientes, cada uno realizado por duplicado. El análisis estadístico se realizó con técnicas de la U de Mann-Whitney test, la elaboración de los datos experimentales a través de la InStat 4 programa (GraphPAD Software para la Ciencia, San Diego, CA).

Apreciación

El útero se somete a la remodelación celular durante cada ciclo sexual, con el fin de estar preparados para un posible embarazo. En ausencia de embarazo, el útero cambios son reversibles que permitan la preparación en un ciclo posterior. En caso de éxito de apareamiento y la fecundación, sin embargo, los cambios en el útero de tomar otra ruta para apoyar el embarazo. Los cambios celulares uterino durante el embarazo y el ciclo se rigen por la que circulan los niveles de esteroides sexuales ováricos estradiol (E2) y progesterona (P).

Los resultados de nuestros análisis muestran que la actividad de FAAH en el útero del ratón cambiado en función de las etapas del ciclo del celo, y que el contenido de proteínas FAAH en paralelo la actividad de la enzima (Fig. 1]. En particular, la actividad de FAAH más alto contenido de proteína y se registraron en proestro, seguido de una disminución progresiva en celo y metoestro; finalmente, dioestrus se caracteriza por los valores más bajos para ambos parámetros, hasta el 20% o ~ ~ 50% de la proestro Valores, respectivamente (p <0,01 para dioestrus versus proestro en ambos casos). En una variedad de tejidos de alta actividad de FAAH hidrolizado se ha asociado con bajos niveles de AEA y viceversa, tanto en el sistema nervioso central [14] y en la periferia [15]. En particular, en un estudio anterior hemos demostrado que la actividad uterina FAAH se correlaciona inversamente con los niveles de AEA uterino, de manera que el aumento de FAAH implicados AEA inferior [11]. Sobre este telón de fondo, podemos especular que los niveles de AEA son muy probable que sea baja en proestro, y que progresivamente, con un incremento máximo en dioestrus.

Las concentraciones séricas de estradiol (E2) y progesterona (P) en el CD-1 mouse celo ciclo han sido cuidadosamente analizadas en estudios anteriores [16, 17]. Se ha demostrado que hay dos picos en ambos E2 y las concentraciones de P endógeno. El más alto nivel E2 ocurre en el proestro, seguido de un pequeño pico a fines de metoestro. La concentración sérica de P muestra un pequeño pico a principios de celo y un gran pico amplio que se extiende por ambas metoestro y dioestrus. Tras el éxito de la fertilización, tanto E2 y P son necesarios para la implantación y la receptividad uterina.

Mediante la superposición de los datos de la literatura sobre los niveles endógenos de la E2 y P con el presente análisis de FAAH, parece que los niveles más altos de E2 y de los niveles más bajos de P coincidir con la máxima actividad de FAAH (es decir, el más bajo de los niveles locales AEA) , En cambio, una baja actividad de FAAH (es decir, un alto nivel de los locales AEA) y la disminución de los paralelos E2 y el aumento de las concentraciones de P, respectivamente. En conjunto, estos datos sugieren que en las no embarazadas útero endógena E2 y P ejercer efectos opuestos sobre la actividad de FAAH, siendo la primera la hormona estimulante y la segunda inhibitoria. Esto parece incompatible con el ratón embarazadas útero, donde el tratamiento con E2 y exógenos P-abajo FAAH modula la actividad [4].

Entre los diversos efectos que la variación de la actividad de FAAH y la consiguiente diferentes niveles locales AEA podría ejercer en el útero, la acción sobre el músculo liso parece de particular interés. Se ha demostrado que los endocanabinoides ejercer un potente y directo efecto relajante sobre miometrio humano embarazadas [18] y coordinar oviductales contracción del músculo liso del embrión durante el transporte [3]. Además, la proliferación y la apoptosis de los tejidos uterino también son posibles objetivos de la acción endocannabinoide [19 - 22]. De hecho, la actividad pro-apoptótica de la AEA ha sido documentada en varias células y tejidos [21], incluyendo ratón blastocisto [2]. Es bien sabido que uno de los acontecimientos fundamentales de los cambios celulares uterino es el volumen de negocios de células sistémica, que consiste en la renovación celular de la proliferación y la muerte celular por apoptosis. Si bien los índices de proliferación del epitelio uterino son más altos en el proestro día, epiteliales apoptóticas índices son más bajos en el mismo día. Un patrón inverso se demostró uterino entre la proliferación celular y la apoptosis en el celo día [23 - 25]. El aumento de la proliferación de las células del útero se ha correlacionado con el aumento de la secreción ovárica E2 en el proestro día [26], mientras que el aumento de la apoptosis del epitelio uterino en el celo día ha sido atribuida a la disminución de los niveles séricos de E2 [27]. Además, una serie de estudios en seres humanos también mostró que preovulatorio ovárica de estrógeno estimula la secreción glandular uterino proliferación de las células epiteliales, en especial en el endometrio funcional, durante la fase de proliferación. Un rápido aumento en el índice apoptótico se observó tanto en el epitelio y estroma durante los últimos días del ciclo (fase secretora tardía), con un índice máximo en el segundo día de la menstruación [28]. Sobre la base de nuestro estudio, es posible especular que en proestro bajos niveles de AEA podría favorecer la proliferación de los tejidos uterino, en tanto que en metaestrus-dioestrus altos niveles de AEA contribuir a la muerte celular programada.

En conclusión, el informe que aquí el análisis de la actividad de FAAH y contenido de proteína en el útero del ratón, que muestra las variaciones en función de las etapas del ciclo del celo que puede estar relacionado con los cambios de los niveles de esteroides sexuales y la remodelación tisular. En el presente los datos pueden constituir la base de nuevos estudios sobre las medidas de señalización endocannabinoide en este órgano, y sobre su impacto en la fisiología de la reproducción.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

FGK y NB se han producido la mayor parte de los resultados y han participado en la redacción del manuscrito. MM MDF y han hecho contribuciones a la igualdad de la concepción y el diseño y el análisis y la interpretación de los datos también. Todos los autores han dado la aprobación final de la versión del manuscrito que se publicó.

Agradecimientos

Esta labor fue apoyada por el MIUR italiano PRIN concesión 2004-2005.