Journal of Nanobiotechnology, 2006; 4: 3-3 (más artículos en esta revista)

Evaluación de la respuesta a la proliferación microbiana nanopartículas inorgánicas

BioMed Central
Darryl Williams N (dnwilli@gmail.com) [1], Sheryl H Ehrman (sehrman@eng.umd.edu) [1], Tracey R Pulliam Holoman (tholoman@eng.umd.edu) [1]
[1] Departamento de Ingeniería Química y Biomolecular, de la Universidad de Maryland, 2113 Edificio 090, College Park, MD 20742, EE.UU.

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Resumen

Con el fin de mejorar la utilización de nanopartículas inorgánicas en los sistemas biológicos, es importante desarrollar una comprensión de la influencia que tienen sobre la salud y la función celular. Se realizaron experimentos para probar la sílice, sílice y óxido de hierro, y las nanopartículas de oro por sus efectos sobre el crecimiento y la actividad de Escherichia coli (E. coli). La microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la dispersión de luz dinámica (DLS) fueron utilizados para caracterizar la morfología y cuantificar la distribución del tamaño de las nanopartículas, respectivamente. TEM también se utilizó para verificar las interacciones entre compuestos de nanopartículas de óxido de hierro y E. Coli. Los resultados de la DLS indicó que las nanopartículas inorgánicas forman pequeños agregados en el crecimiento de los medios de comunicación. Crecimiento estudios se determinó la influencia de las nanopartículas sobre la proliferación de las células en varias concentraciones, lo que demuestra que el crecimiento de E. Coli en los medios de comunicación que contiene las nanopartículas indicó que no manifiesta signos de toxicidad.

Antecedentes

Investigación sobre el impacto de las nanopartículas inorgánicas celular en la salud permitirá a los nuevos acontecimientos en la nanobiotecnología para alcanzar el máximo de sus posibilidades. Una mejor comprensión de las nanopartículas y las interacciones biológicas de células puede conducir al desarrollo de nuevas de detección, diagnóstico, tratamiento y posibilidades, como la mejora de la entrega de drogas dirigida, la terapia génica, la resonancia magnetica nuclear (RMN) de contraste, y la detección de agentes de guerra biológica [1 -- 6]. Lo que no es cierto acerca de la producción de estas partículas es que si, por sí sola, son tóxicas para las células en general.

Citotoxicidad es de gran preocupación y se hará cada vez más a fin de la demanda de nanopartículas crece con el desarrollo de más aplicaciones biológicas. Preguntas, por ejemplo, cómo y si las nanopartículas daño medio biológico, ¿cómo pueden ser persistentes, y en qué medida en que afectan a otros organismos, incluidas las personas que están todas las preocupaciones. Se sabe que las nanopartículas pueden transfect células, sin embargo, las respuestas a las nanopartículas dentro y fuera de las células son desconocidos. Como las nanopartículas son más comunes y ampliamente producida, las probabilidades de sucesos imprevistos con miras a su difusión y acumulación en el entorno de aumento, y podría dar lugar a cambios imprevistos de los sistemas biológicos. En este estudio, E. Coli sirvió como una representación de cómo las células podrían responder a la presencia de nanopartículas en su crecimiento medio ambiente.

El objetivo de la investigación que aquí se presenta es la de investigar cómo las nanopartículas interaccionan con las células microbianas, y qué efecto tienen las nanopartículas sobre su proceso de crecimiento. Las nanopartículas presentan un reto de investigación porque se sabe poco sobre cómo se comportan en relación con los microorganismos, especialmente en el nivel celular. El comportamiento coloidal de nanopartículas de los inorgánicos en el crecimiento microbiano los medios de comunicación fue investigado para determinar la estabilidad de estos sistemas en medios salinos. Estabilidad coloidal es un problema cuando se trata de entornos biológicos debe, en parte, al efecto de la sal sobre las nanopartículas. Aglomeración ocurre causando la sedimentación de las nanopartículas, lo que limita su interacción con el crecimiento de las células, como el E. Coli.

Tres tipos de nanopartículas se utilizaron para llevar a cabo este estudio: de sílice, sílice y óxido de hierro, y oro. El sílice / nanopartículas de óxido de hierro son importantes debido a sus propiedades magnéticas. Ellos podrían ser utilizadas para aplicaciones médicas, como la RM y la ejecución de aplicaciones orientadas de drogas. Otra aplicación sería la de utilizarlos como sensores biológicos. Siendo que están compuestos, la sílice parte de las nanopartículas pueden ser funcionalizadas para atraer diversos elementos biológicos mientras que la porción de óxido de hierro puede facilitar la movilidad en virtud de la presencia de un campo magnético.

Nanopartículas de oro se emplean en múltiples aplicaciones de los sistemas biológicos. El oro ha excepcionales propiedades vinculantes, y esto lo hace atractivo para conectar los ligandos para mejorar diversas interacciones biomoleculares. Estas nanopartículas también exhiben un intenso color visible en la región para la detección y espectroscópicos también grandes contrastes, a través de microscopía electrónica de la imagen [7]. A pesar de todas estas aplicaciones de las nanopartículas de oro, todavía hay poco conocimiento en cuanto a la forma en que estos sistemas coloidales efecto entornos microbianos. Nanopartículas de sílice son favorables porque son baratas, fáciles de producir, y tiene superficie de hidróxido de los grupos que los hacen fácil de functionalize

Resultados y discusión
TEM mediciones

Según las micrografías, la morfología de la sílice / nanopartículas de óxido de hierro es aproximadamente esférica. El ratio de la mole de hierro silicio es de aproximadamente 1:1, y la Figura 1 se muestran las nanopartículas con el lado oscuro de óxido de hierro y de la parte más ligera que se sílice. El promedio del tamaño de las partículas fue de 80 nm. Figura 2 es un micrograph de la que se indica que las nanopartículas de oro también son esféricos en forma. Por último, las nanopartículas de sílice fueron analizados utilizando TEM, y los resultados muestran morfología esférica con un tamaño medio de partículas de 60 nm. Figura 3 es un micrograph de las nanopartículas de sílice adoptadas en solución acuosa.

Las micrografías de E. Coli, en presencia de compuestos de nanopartículas de óxido de hierro, indican que las células son capaces de mantener el crecimiento, sin mostrar signos claros de toxicidad. Una mezcla de circular y alargada de células secciones transversales son vistos. Cabe señalar que E. Coli es característicamente forma de vara. Las células se seccionaron y, por tanto, la forma es una función del ángulo de cada elemento en relación con el cuchillo en la sección de diamantes. TEM imágenes de las células cultivadas en ausencia de las nanopartículas también mostró una distribución similar de la sección transversal de formas. Parece haber una asociación de las nanopartículas con la membrana de la célula, como se muestra en las figuras 4a y 4b para E. Coli y compuesto nanopartículas de óxido de hierro. Basándose en el hecho de que la superficie de las nanopartículas son o bien desnudo o revestido PEG, es probable que la interacción entre las partículas y de la membrana no es específica y no específica entre las nanopartículas y un componente particular de la membrana, como una superficie Proteína expresada.

DLS mediciones

Las nanopartículas tienen una tendencia a aglomerarse en la solución debe, en parte, a las características del medio líquido con la adición de sal. En cuanto a las nanopartículas y las interacciones de células microbianas, esto afectará en gran medida el comportamiento de las células. No aglomerados de partículas suspendidas en solución son preferibles para propósitos de prueba, debido a las siguientes:

1) libre movimiento, la única unidad de las partículas tienen más contacto con los microbios.

2) translocación a través de la membrana celular se aceleró debido al tamaño.

LB medios de comunicación contiene una alta concentración de sal (0,2 M) que pueden contribuir a la aglomeración de las nanopartículas. La carga superficial de las nanopartículas en la solución permite a las nanopartículas para atraer a los demás a causa de la influencia de los iones de las sales, por lo tanto, resulta en la formación de grandes aglomerados [8 - 10]. Como resultado de ello, las nanopartículas pueden caer fuera de la solución y resolver a la parte inferior de la agitar frascos.

Con el tiempo aumentó, la media de partículas Radio aumentado. El tamaño de la aglomeración de partículas de sílice oscilaron entre 300-360 nm, como se muestra en la Figura 5. La Figura 6 muestra las mediciones de sílice DLS / óxido de hierro, lo que indica un comportamiento similar en los medios de comunicación LB. En contraste, la figura 7 se muestra el PEG-recubierto las nanopartículas de oro se mantuvo estable en LB medios de comunicación, con lo que conservan su tamaño sin formando grandes aglomerados. DLS medidas fueron tomadas durante el marco de tiempo con el crecimiento de correlación de las mediciones para determinar la forma en la que las partículas se comportaron durante el proceso. Figura 8 es una comparación de las partículas de Au con el compuesto de partículas en suspensión, por una duración de seis horas. Una vez más, las partículas de Au mantener su tamaño y su estabilidad.

Experimentos de crecimiento

Los resultados generales indicaron que el crecimiento de E. Coli expuestos a la sílice, sílice y óxido de hierro, y las nanopartículas de oro fue sin inhibiciones. Curvas de crecimiento fueron generados por E. Coli creciendo en 100 mL de LB medios de información que contienen sílice / nanopartículas de óxido de hierro en una concentración de 2,2 × 10 -3 g / mL de solución. Bajo estas condiciones de crecimiento, no hay pruebas de que las nanopartículas impedido el crecimiento de las células microbianas. Figura 9 ilustra las curvas de crecimiento E. Coli creciente con y sin sílice / nanopartículas de óxido de hierro. Los resultados indican que hay poca diferencia entre las dos curvas.

Otro experimento se realizó usando nanopartículas de sílice puro en el mismo volumen que el de sílice y óxido de hierro experimento. El crecimiento de datos fue tomada por 3,3 × 10 -2 g / mL de solución de sílice en 100 mL de LB medios de comunicación. Figura 10 muestra las curvas de crecimiento de este experimento.

Al igual que con el sílice y sílice / experimentos de óxido de hierro, un estudio de toxicidad se realizó a través de las nanopartículas de oro en una concentración de 1,1 × 10 -4 g / ml. Las partículas de oro muestran una mayor estabilidad en solución debido a la capa de PEG en la superficie. Esto permite que las partículas suspendidas para permanecer en solución; también, que sean capaces de sostener su primera radio de 30 nm. Figura 11 indica que hay poca, en su caso, los efectos sobre el crecimiento derivados de la presencia de las nanopartículas de oro.

Un último experimento se llevó a cabo para probar la influencia de los compuestos de nanopartículas de óxido de hierro sobre E. Coli a concentraciones mucho más elevadas que los anteriores experimentos. La suma de los compuestos de nanopartículas se aumentó a 2,2 × 10 -2 g / mL en un matraz y 4,4 × 10 -2 g / mL en un matraz. Mediciones de la densidad óptica, se da en la figura 12, mostró que E. Coli no fue inhibido por el aumento en la concentración de nanopartículas.

Magnética experimento

A 100 ml de suspensión de células situado sobre un portaobjetos de vidrio, se tomaron de una suspensión de células de crecimiento con 2,2 × 10 -3 g / ml de sílice de las nanopartículas de óxido de hierro. Un cilíndrico neodimio-hierro-boro imán permanente (Ciencia Arbor, Ann Arbor, MI) se colocó dos pulgadas de distancia en el lado derecho de un portaobjetos de vidrio, sentado en un microscopio confocal digital de la imagen. La figura 13 muestra el movimiento de E. Coli como consecuencia de la posición externa imán junto a la diapositiva. Algunas células moción exhibido a lo largo de las líneas de campo magnético (indicado por la plaza en la Figura 13], pero no todas las células se movió en la dirección del campo (células de relieve con círculos). Esto sugiere que no todas las células están en contacto con nanopartículas, y también que las células no estaban siendo arrastrado por la mayor parte de movimiento de fluidos resultantes de la moción de nanopartículas magnéticas solo.

Conclusión

Los estudios preliminares se realizaron para determinar si las nanopartículas afectar el crecimiento de las células microbianas mediante el estudio de cultivos de células en presencia de varios nanopartículas inorgánicas. La evidencia experimental indica que las interacciones entre E. Coli y las nanopartículas utilizadas en este estudio fueron inespecíficos. E. Coli no mostró signos claros de inhibición del crecimiento, utilizando los métodos presentados en este documento. Por supuesto, es posible que haya más cambios sutiles en función de la célula beta y el comportamiento detectable en el gen o la proteína. A los efectos de este estudio, es importante para mostrar resultados preliminares que describen los efectos de las nanopartículas inorgánicas bajo condiciones normales de crecimiento utilizando los métodos conocidos para medir el crecimiento microbiano celular. Sin embargo, como una nota de advertencia, los resultados presentados no pretenden ser generalizado más allá de los materiales y los sistemas biológicos y las condiciones aquí presentadas.

Métodos
Inorgánica nanopartículas

Cuadro I da las especificaciones para cada tipo de nanopartícula (sílice, sílice y óxido de hierro, y oro) que se utiliza en este estudio. Las nanopartículas de sílice fueron hechas por base catalizó la hidrólisis del TEOS [11]. Sílice / nanopartículas de óxido de hierro se llama-generada a partir de pentacarbonilo de hierro y hexamethyldisiloxane en un premezclado metano / oxígeno / nitrógeno llama [12]. Cada partícula contiene gamma-Fe 2 O 3 y sílice en una proporción molar 1:1. Por último, las partículas de oro se produjo a través de reacción con citrato de sodio HAuCl 4 en el agua seguido de la adición de glicol polietileno (PEG) para revestir la superficie [13].

Cultura de los medios de comunicación y la cultura condiciones

Por el rápido crecimiento de las células microbianas, Luria Bertani (LB), se preparó y medianas esterilizada para cada experimento. Un conjunto de 250 ml También se agite los frascos esterilizados antes de la experimentación. 100 mL de medio LB se transfirió a cada matraz. Varias concentraciones de nanopartículas fueron cuidadosamente colocados en cada frasco, dejando una como control para realizar el seguimiento del crecimiento normal de las células microbianas sin nanopartículas. Los experimentos se realizaron con un control negativo (frasco que contiene las células más medios de comunicación) y un control positivo (frasco que contiene las nanopartículas, más los medios de comunicación). Tanto de las negativas y positivas de los valores de control obtenidos a partir de mediciones de la densidad óptica se restará de los valores experimentales (frascos que contienen las células, los medios de comunicación, y nanopartículas). Las curvas de crecimiento representan la diferencia entre los controles y los valores experimentales.

Cada frasco fue inoculado con 1 mL de E. Coli (pBR322 JM105) cultivados en medio líquido LB. Los frascos se agita a 180 rpm y 37 ° C en un baño de agua agitando. Mediciones de la densidad óptica de cada frasco se tomaron cada treinta minutos para registrar el crecimiento de los microbios a través de la inoculación de finales de la fase exponencial usando un espectrofotómetro fijado en 600 nm. La tasa de crecimiento de las células microbianas que interactúan con las nanopartículas se determinó a partir de una parcela de la bitácora de la densidad óptica contra tiempo.

Morfología de partículas usando microscopía electrónica de transmisión

La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se ha utilizado para obtener imágenes de las nanopartículas. Sílice / óxido de hierro se prepararon las muestras para TEM de imágenes mediante la inserción de una malla TEM (cobre recubierto con formvar) en polvo seco utilizando pinzas de celebrar la cuadrícula. La cuadrícula se muestra entonces la ligera aprovecharse para eliminar cualquier exceso de partículas, y la grilla se colocó en la imagen para TEM. Las nanopartículas de oro y sílice en suspensión, y las muestras fueron preparadas por la inserción de la malla TEM líquido en cada muestra. La muestra se rejillas entonces permitió que se seque al aire la noche a la mañana.

Caracterización de las nanopartículas de dispersión de luz dinámica

Uno de los métodos más comunes utilizados para caracterizar farmacéutica coloides es dispersión de luz dinámica (DLS). Análisis de la distribución de tamaño de las nanopartículas se realizó con un DLS autocorrelación herramienta conocida como Photocor ®. DLS medidas fueron tomadas de las nanopartículas en agua destilada y en medios de cultivo LB. Con este procedimiento, la diferencia entre el comportamiento de las nanopartículas en soluciones con y sin sal se comparó.

Nanopartículas / celular estudios de interacción utilizando TEM

Después de caracterizar las diversas nanopartículas, se realizaron experimentos para observar la relación entre los compuestos de nanopartículas de óxido de hierro y E. LB coli en los medios de comunicación. Celular / nanopartículas se observaron interacciones Zeiss EM10 utilizando un microscopio electrónico de transmisión de CA en la Universidad de Maryland Biológica Ultraestructura Fondo. Las muestras de E. Coli fueron retiradas en los puntos a fines de la fase exponencial (densidad óptica ~ 0,6). Después de la recogida, que se suspende y se centrifuga a temperatura ambiente en 0,12 M Millonig del buffer fosfato a pH 7,3 y luego con glutaraldehido al 2%. Las células fueron "pellets" de nuevo, luego lavados con buffer, y luego secundaria fija con 1% OsO 4. En este punto, que fueron lavadas con agua destilada y luego postfixed con un 2% de acetato de uranilo, lavarse con doble amortiguación y agua destilada, deshidratados en una serie de etanol y óxido de propileno inmersiones, y embebido en resina de Spurr. Un cuchillo de diamantes se utilizan para la sección incrustados células. Las secciones fueron teñidas con post-2,5% acuosa y acetato de uranilo 0,2% acuosa citrato de plomo.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

DW llevado a cabo todos los experimentos y análisis de datos. SH y TH concibe el estudio y participaron en su diseño y la coordinación y la ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Nos gustaría reconocer doctor Isaac Koh para ayudar con algunos de los DLS la recopilación de datos, el Prof Sara Majetich de abastecimiento de las nanopartículas de oro para este estudio, y Tim Maugel de la Universidad de Maryland Biológica Ultraestructura Facilidad para ayudar con la preparación TEM. Esta investigación fue parcialmente apoyado por NSF-MRSEC financiación inicial a través de la subvención (DMR-0080008). El apoyo adicional fue posible a través de la Fundación Sloan y la de Ciencias e Ingeniería de GEM Consortium.