Journal of Negative Results in Biomedicine, 2006; 5: 4-4 (más artículos en esta revista)

Papel de HOXA7 a HOXA13 y PBX1 genes en diversas formas de MRKH síndrome (ausencia congénita de útero y vagina)

BioMed Central
Agnès Burel (agnes.burel @ univ-rennes1.fr) [1], Thomas Mouchel (thomas.mouchel @ club-internet.fr) [2], Sylvie Odent (sylvie.odent @ chu-rennes.fr) [3] , Filiz Tiker (filiztiker@yahoo.com) [4], Bertrand Knebelmann (knebelmann@necker.fr) [5], Isabelle Pellerin (isabelle.pellerin @ univ-rennes1.fr) [1], Daniel Guerrier (daniel.guerrier @ Univ-rennes1.fr) [1]
[1] CNRS UMR 6061, Génétique et Développement, Université de Rennes 1, Groupe IPD, IFR140 GFAS, Faculté de Médecine, Rennes, Francia
[2] Servicio de Gynécologie Obstétrique, CHU de Rennes, Rennes, Francia
[3] Unité de Génétique Médicale, Hôpital Sud, Rennes, Francia
[4] Departamento de Pediatría, Baskent University, Hospital de Adana, Adana, Turquía
[5] Servicio de Néphrologie, Hôpital Necker-Enfants-Malades, de París, Francia

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Resumen

El Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH), síndrome congénito se refiere a la ausencia o hipoplasia severa de los genitales femeninos, a menudo descrito como uterovaginal aplasia, que es la principal característica del síndrome. Es la segunda causa de amenorrea primaria después de disgenesia gonadal y ~ ocurre en 1 de cada 4500 mujeres. Etiología de este síndrome sigue siendo poco conocida. De la frecuente asociación con otras malformaciones, síndrome de la MRKH, con la participación de los riñones, el esqueleto y los oídos, sugiere la participación de los principales genes de desarrollo como los de la familia HOX. De hecho mamíferos HOX genes son bien conocidos por su papel crucial durante la embriogénesis, particularmente en el esqueleto axial, hindbrain y desarrollo de las extremidades. Más recientemente, su participación en la organogénesis se ha demostrado sobre todo durante la diferenciación urogenital. Aunque nula mutaciones de los genes HOX en modelos animales no dan lugar a fenotipos similares a MRKH, mutaciones dominantes en sus secuencias de codificación o expresión aberrante debido a la mutación de las regiones de reglamentación podría cuenta para ello. Análisis de la secuencia de codificación de las regiones de HOX genes candidatos y de PBX1, un probable HOX cofactor Mülleriana conducto durante la diferenciación y la morfogénesis renal, no reveló ninguna mutación en los pacientes que muestran las distintas formas de MRKH síndrome. Esto tiende a demostrar que no son HOX genes implicados en el síndrome de MRKH. Sin embargo, esto no excluye otros mecanismos que conducen a la disfunción HOX puede explicar el síndrome.

Antecedentes

La causa más común de agenesia vaginal es la ausencia congénita de útero y vagina y que se menciona también como Mülleriana aplasia, agenesia Mülleriana o Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser (MRKH), síndrome [1]. La frecuencia de este síndrome aún no está del todo clara, aunque informó de la incidencia varía de 1 en 4000 y 5000 los nacimientos de mujeres [1 - 3]. Los afectados son claramente fenotípica mujeres con ovarios normalmente desarrollados [4, 5] y normal 46, XX cariotipo [6, 7]. Etiología del síndrome es poco conocido pero es a menudo asociada con otras anomalías incluyendo defectos renales, sordera y anomalías esqueléticas (asociación MURCS [8]], lo que sugiere la participación de los principales genes de desarrollo tales como los genes HOX [9 - 12].

El homeobox genes (HOX) pertenecen a una gran familia de 39 genes organizados en cuatro grupos, HOXA, HOXB, HOXC y HOXD, cada uno en un cromosoma diferente. Durante la organogénesis, las proteínas codificadas por estos genes actúan a través de diversos y muy complejos spatiotemporal combinaciones para activar la identidad posicional de las células embrionarias. Esto determina el patrón y la serie de sesiones de identidad a lo largo de la anterior-posterior eje del esqueleto y una variedad de sistemas orgánicos [13]. Por ejemplo, el 30 de HOX proteínas participar en la elaboración de la columna vertebral, 12 para el tracto digestivo y 7 para el tracto urogenital [14]. Más precisamente, conductos Mülleriana (primordios de los oviductos, útero, el cuello uterino y la vagina anterior), el desarrollo parece involucrar a un número relativamente reducido de genes HOX en el modelo murino. De hecho, HOXA7 [15], HOXA9 a HOXA13 [16], así como HOXD9 a HOXD13 [17], se expresan a lo largo de la diferenciación Mülleriana conducto. Sin embargo, la alteración de los genitales femeninos es sólo observado en HOXA10,-A11 y A13-ratones deficientes (homocigotos inactivación de los genes): - en HOXA10 - / - ratones, la parte superior del útero se transforma en oviducto, la uterotubular La salida es anormal, así como el epitelio uterino y anterior homeóticos transformación de la zona lumbar se ha producido [18]; - en HOXA11 - / - ratones, el útero es más delgado y más corto de lo normal y glándulas endometriales no han desarrollado [19], en HOXA13 - / - ratones, el conducto distal Mülleriana no ha desarrollado [20]. Por último HOXA10 a HOXA13 también se expresan en el riñón en desarrollo [21] y ambos son necesarios para la correcta patrón del esqueleto [22].

HOX proteínas comparten en común una muy conservadas 60 aminoácidos vinculante motivo de ADN denominado homeodomain. Las proteínas que contienen este dominio son factores reguladores que controlan la expresión de genes diana [23]. Su alta especificidad biológica proviene de la cooperación específica con cofactores que contribuyen a modular la especificidad de ADN vinculante. Los miembros de los tres aminoácidos de bucle extensión (HISTORIA) homeodomain clase de proteínas que conforman la PBX proteínas de mamíferos [24] y el MEIS-HISTORIA como factores o MEINOX grupo (MEIS de mamíferos y PREP1 proteínas) [25] son ahora considerados como esenciales Cofactores heterotrimeric formando complejos con HOX proteínas que regulan la transcripción de genes objetivo específico [26]. Entre estos cofactores, PBX1 es de gran interés en cuanto a las malformaciones encontradas en el síndrome de MRKH: es necesario para el desarrollo del esqueleto y del patrón [27], la morfogénesis renal [28] y, sobre todo, su inactivación de genes conduce a la falta de estructuras Mülleriana [29] . Curiosamente, PBX1 se expresa en la Mülleriana ductos en el tracto genital inicio de la diferenciación que es, ausente de Wolffian conductos (los primordios de interior tracto genital masculino) durante el mismo período y en ambos sexos [30].

Estos datos globales nos llevó a investigar HOXA7,-A9,-A10, A11-A13-y genes, así como PBX1, en varios MRKH pacientes que muestran una amplia variedad de malformaciones, aislados de aplasia uterovaginal a grave MURCS asociación. Sin embargo nulas las mutaciones de estos genes no den lugar a MRKH-fenotipo como en el modelo murino. Esta es la razón por la que decidió la búsqueda de mutaciones simples o discretos dentro de su codificación y de empalme de las secuencias. De hecho, dominante o la pérdida de la función de las mutaciones pueden afectar a la capacidad de las proteínas para cumplir su función biológica como ya se demostró para HOXD13 [31, 32].

Casos clínicos
Paciente 1

Este paciente fue inicialmente evaluada por un reflujo vesicoureteral que requiere tratamiento quirúrgico en el que un pequeño riñón izquierdo y un parcial agenesia uterina con cuerno rudimentario izquierda se notó. Esto último fue confirmado por laparoscopia cuando tenía 13 años. Otro examen reveló varias anomalías esqueléticas: coxa valga, la desigualdad en la longitud de pierna, flexus cuello de cisne, así como vértebra L4 y sacro malformación. A los 18 años de edad, laparoscópica asistida Vechietti procedimiento [33] se realizó. Finalmente su cariotipo fue normal.

Paciente 2

Este 25 años de edad, una mujer blanca fue inicialmente evaluada por la proteinuria. El examen reveló un derecho único de la pelvis renal y agenesia uterovaginal. Tenía normal desarrollo sexual secundario. Riñón biopsia mostró focal y segmentaria hyalinosis. Spine radiogramas eran normales. Su cariotipo fue normal. A las 26, fue tratada por sigmoide colpoplasty [34]. Durante la cirugía, agenesia uterovaginal se confirmó con los pequeños cuernos uterinos rudimentarios.

Paciente 3

Este joven de 20 años fue evaluado mujer blanca de amenorrea primaria. Tenía normal desarrollo sexual secundario. No hubo dolor abdominal cíclico. La historia familiar sin complicaciones. MRKH El diagnóstico fue confirmado por laparoscopia. Ausencia de derecho de ovario y trompa de falopio se observaron durante la cirugía. Sin embargo, la ecografía mostró riñones normales.

Los pacientes de 4 a 6

Estos pacientes son tres hermanas turco ya descritos [35] (pacientes III2, III3, III5 de pedigrí). Curiosamente, en esta familia, la cuarta hermana (III4) no se vio afectada pero dos tías paternas (II6 y II7), entre 8 hermanos, son estériles y se les dijo que no tenía útero. Tres hermanas Este caso corresponde a la típica MRKH con síndrome de amenorrea primaria, secundaria normal desarrollo sexual y la ausencia de la vagina en la evaluación física. La agenesia Mülleriana fue confirmada por ecografía y la resonancia magnetica de la pelvis. Los cariotipos fueron normales. Pielografia intravenosa y de la columna vertebral radiogramas eran normales en cada caso.

PCR Amplification and sequencing

ADN genómico total fue preparado a partir de leucocitos de sangre periférica de acuerdo con los procedimientos normales [36]. Locales de revisión ética y procedimientos se siguen consintiendo. PCR primers fueron diseñados para amplificar HOXA7, HOXA9, HOXA10, HOXA11, HOXA13 (Tabla 1] y la codificación de PBX1 exones (Tabla 2]. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en 25 μ l contiene 500 ng de ADN genómico, PCR buffer (50 mM KCl, 10 mM Tris HCl, pH 9,0), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 10 pmol de cada primer y 2,5 U Taq polimerasa ( Promega). Mediante amplificación por PCR se realizó utilizando el "aterrizaje", con un primer paso de desnaturalización a 96 ° C durante 3 min. Seguido por 19 ciclos de touchdown de 45 s a 96 ° C, 45 s en una primera temperatura de fusión (Tm), de 69 ° C (con un 1 ° C Tm disminución por cada ciclo), y 60 s en 72 ° C. La amplificación fue alcanzado por 11 ciclos de 45 s a 96 ° C, 45 s a 50 ° C, y 60 s en 72 ° C, con una extensión final a 72 ° C durante 10 min. Por la N-terminal del exón 1 del gen HOXA13, DMSO (5%) se agregó a la mezcla de PCR. 6 μ l PCR producto previamente controlado en un gel de agarosa al 2%, se incubaron con 5 unidades de exonuclease I (Amersham Biosciences) y 1 unidad de camarón fosfatasa alcalina (Amersham Pharmacia), con el fin de digerir resto de los cebos y no incorporado a inactivar nucleótidos. La reacción enzimática fue detenido por un paso a 90 ° C durante 15 min. Bidireccional secuenciación de los productos de PCR se logró utilizando el BigDye Terminator química (PE Applied Biosystems) y cada uno de exón primers específicos. Electroforesis y análisis se realizaron en un ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems). Secuencias fueron analizadas y comparadas con secuencias de GenBank descargado por DNAStar software (DNAStar).

Resultados y discusión

El patrón de malformaciones observadas en los pacientes MRKH fue, en nuestra hipótesis, en favor de un gen HOX disfunción. Sin embargo, no hay mutación, así como la longitud / polimorfismo y se encontró en la codificación de secuencias de HOXA7 a A13-genes de los pacientes se investigó. Probablemente esto refuta la hipótesis dominante o de la pérdida de la función de las mutaciones, como las que se encuentran en HOXD13 [31, 32], y parece mostrar que la calidad de las proteínas correspondientes, de ser correctamente expresado, no puede ser incriminado. Curiosamente, la reducción de la cantidad de proteínas HOXA (haploinsufficiency de todo el grupo de genes HOXA) no causa ninguna de las principales malformaciones observadas en el síndrome de MRKH pero conduce a otras anomalías congénitas [37]. Sin embargo, otros mecanismos pueden ser propuestas, tales como aguas arriba misregulation de algunos genes de la agrupación HOXA, post-transcripcional anomalías, HOX socios' deficiencia o por defecto en los genes HOX-objetivo, todos los que podría dar lugar a fenotipos similares a HOX.

HOX genes grupos muy complejo transcripcional someterse a los controles durante el desarrollo, incluidas las interruptor general como el ácido retinoico inducción [38], FGFs [39, 40] o Wnt de señalización [41], de autorregulación bucles de inducción específica o represión de los genes dentro de la HOX Mismo grupo [42 - 44], así como post-transcripcional reglamentos [45, 46]. Aunque en gran escala de desarrollo la deficiencia de las señales probablemente no cuenta restringida para malformaciones letales y no como los que se observan para el síndrome de MRKH, HOX misregulation debido a mutaciones / deleciones fuera de las regiones de codificación podría hacerlo como ya se ha descrito en la HOXD grupo de genes [47 ] Y en el promotor del gen HOXA13 [48]. Algunos pocos de reglamentación regiones se han caracterizado en el HOXA grupo de genes entre los cuales, los llamados HCR (Humanos, de Control de la Región) [49] situada junto a HOXA7, un gen que de alguna manera participan en la diferenciación Mülleriana [15]. Esta secuencia de ADN 1,1 kb, así como su equivalente conservadas ratón, se ha demostrado que fijar el límite anterior de HOXA7 expresión [49] y, por tanto, HOXA putativo otros genes de la misma categoría. Southern-blot experimentos encaminados a la detección del polimorfismo de la longitud como la supresión o la duplicación en la [HCR-HOXA7] ámbito no pusieron de manifiesto ningún caso genéticos importantes en ninguno de los pacientes investigados (resultados no presentados). Esto sin embargo no implica que otras regiones de reglamentación todavía no HOXA en el grupo, puede no ser involucrados en el síndrome de MRKH.

Post-transcripcional reglamento también tienen lugar en la general de los mecanismos de expresión de genes HOX y participar en la elaboración del código denominado "código HOX combinatoria". De esta manera, el normal y el splicing alternativo de pre-HOX mensajeros [45, 46] a menudo da lugar a dos isoformas que supuestamente puede antagonizar unos de otros [50, 51]. En nuestro enfoque experimental, hemos diseñado PCR y secuenciación de los cebos de manera que se pudo comprobar la correcta aceptor de empalme de las secuencias de los sitios donantes y de todos los exones de cada gen investigado (incluidas PBX1). No mutación se encontró en esos lugares.

PBX1 es uno de los genes HOX 'los socios más probabilidades de estar involucrados en el síndrome de MRKH. Heterocigotos (+/-) inactivación de este gen no provoca ninguna malformación congénita en el modelo de ratón que homocigotos (-/-) embriones mueren antes de nacer debido a los múltiples y graves malformaciones [27]. Por lo tanto haploinsufficiency probablemente no causa MRKH fenotipo aunque mono-alélica mutaciones en una región de codificación del gen puede llevar a la dominante y efectos perjudiciales, tales como fijar la dosis de proteínas HOX no agrupados en complejos funcionales. Estamos cuidadosa secuencia de los exones PBX1 general en todos los pacientes y no observó ninguna mutación.

Conclusión

La investigación de los genes candidatos en la investigación biomédica ha sido a menudo blanco sin éxito a menos que los genes son evidentes (por ejemplo, véase [52 - 54]]. HOX genes, que desempeñan múltiples funciones en el desarrollo, son buenos candidatos para MRKH síndrome, sobre la base de deducción de su patrón de expresión durante el desarrollo del ratón y del fenotipo de los ratones con una determinada interrupción o sobreexpresión de un gen específico HOX. Similar hipótesis fueron asumidas por otras malformaciones congénitas o síndromes y reveló la participación de estos genes [55, 56]. Estamos basados en el presente trabajo sobre la investigación de MRKH pacientes que muestran las distintas malformaciones asociadas con aplasia uterovaginal. Esta elección se basó en la probable multigenic orígenes del síndrome, en el supuesto de que al menos uno de los casos llevaría a pruebas de mutación o bien una secuencia de codificación de un gen HOX o parte de la agrupación HOXA (HOXA7 a-A13). Entre los diversos MRKH casos analizados, pero no una mutación en la codificación de secuencias o en el [HCR-HOXA7] región. Sin embargo, no toda la secuencia HOXA grupo en todos los pacientes, ya que habría sido un tremendo trabajo, sino más bien orientada regiones genómicas (codificación de las secuencias, los sitios de empalme, secuencias reguladoras). Nuestros resultados negativos, por lo que no quiere decir que no se HOX genes implicados en el síndrome. Es necesaria investigación adicional para resolver o no la hipótesis HOX. Esto exige la realización de análisis de ligamiento genético de los casos familiares y de todo el genoma de exploración para buscar candidatos para cromosómicas loci.

Contribuciones de los autores

-- AB estuvo a cargo de la mayoría de las reacciones de PCR y secuenciación

-- TM co-iniciado este programa y delineado MRKH síndromes en los pacientes 1 y 3

-- SO contribuido al diagnóstico y estaba a cargo de la genética médica

-- FT siempre muestras biológicas de pacientes 4-6

-- BK siempre muestras biológicas de la paciente 2

-- IP creado un nuevo grupo de investigación se centró en los eventos moleculares de activación normal y patológica Mülleriana diferenciación de los conductos. Por lo tanto, que ofrece la oportunidad a la DG de establecer un adecuado programa de investigación clínica destinada a la comprensión de la genética MRKH síndrome.

-- Dirección General de iniciado el estudio en el grupo de IP y está en condiciones de conducir este programa de investigación desde entonces.

Agradecimientos

Estamos en deuda con Céline Hamon para la purificación de ADN genómico y Stéphane Dréano técnica para ayudar en la gestión de la secuenciación automática de los aparatos. DG está muy agradecido al Dr Mehdi Alizadeh de consejos útiles en la genética. Esta labor fue apoyada por el CNRS y por subvenciones de Rennes Métropole, Conseil Régional de Bretagne y La Fundación Langlois.