Saline Systems, 2006; 2: 3-3 (más artículos en esta revista)

Post-genómica del modelo haloarchaeon Halobacterium sp. NRC-1

BioMed Central
Shiladitya DasSarma (dassarma@umbi.umd.edu) [1], Brian R Berquist (berquist@umbi.umd.edu) [1], A James Coker (coker@umbi.umd.edu) [1], Priya DasSarma ( Dassarmp@umbi.umd.edu) [1], A Jochen Müller (jmueller@jewel.morgan.edu) [2]
[1] Universidad de Maryland, Instituto de Biotecnología, Centro de Biotecnología Marina, 701 E. Pratt Street, Suite 236, Baltimore, MD 21202, EE.UU.
[2] Departamento de Biología, Morgan State University, 1700 East Cold Spring Lane, Baltimore, MD 21251, EE.UU.

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Resumen

Halobacterium Halobacterium Halobacterium Sp. NRC-1 es extremadamente halófilas archaeon que es fácilmente cultivadas genéticamente y fáciles. Desde su secuencia del genoma se terminó en 2000, una combinación de genética, transcriptomic, proteómica, bioinformática y enfoques han proporcionado conocimientos sobre extremófilos tanto su estilo de vida, así como los procesos celulares fundamentales comunes a todas las formas de vida. Aquí, se revisa después de la investigación genómica en este archaeon, incluidas las investigaciones de la replicación del ADN y reparación de sistemas, fotótrofas, anaeróbica, y otras capacidades fisiológicas, la acidez del proteoma en función de los altos niveles de salinidad, y el papel de la transferencia lateral de genes en su evolución.

Antecedentes

Arqueas halófilas (haloarchaea) son extremófilos que crecen óptimamente en condiciones de muy alta salinidad, 5-10 veces mayor que la del agua de mar [1]. Contienen una alta concentración similar de sales internos y muestran una variedad de nuevas características moleculares, incluyendo el ácido de las proteínas que se oponen a la desnaturalización efectos de las sales, y los sistemas de reparación del ADN que se reduzcan al mínimo los efectos perjudiciales de la desecación y la intensa radiación solar. Además, haloarchaea son metabólicamente versátil, que exhiben fotótrofas y anaerobias facultativas capacidades. Significativamente, su facilidad de cultivo y de la genética han hecho ellos tractability modelo experimental de organismos y facilitado el uso de cepas isogénicas de rigurosos estudios de post-genómica.

Clásica estudios de haloarchaea contribuido significativamente a nuestra comprensión de los mecanismos de adaptación, así como las características universales de la vida [2]. Notables descubrimientos realizados originalmente utilizando haloarchaea incluir la capa S-glicoproteína pared celular [3], de cadena ramificada éter lípidos [4] y la luz impulsada por la bomba de protones, bacteriorhodopsin [5], en la membrana celular, y los procesos metabólicos y la biosíntesis de funcionamiento intracelularmente Saturar a la salinidad [6]. Manifestación de la luz de la síntesis de ATP impulsada por reconstituido vesículas de lípidos que contiene bacteriorhodopsin ATPasa mitocondrial y presentó pruebas de Mitchell chemiosmotic acoplamiento hipótesis [7]. Estos primeros descubrimientos se estableció el valor de estudiar diversos microbios del medio ambiente y sentar las bases para estudios filogenéticos que conduzcan a la vista de tres dominio de la vida [8].

En 2000, la secuencia completa del genoma de Halobacterium sp. NRC-1 [9 - 11], un típico haloarchaeon ampliamente distribuido en ambientes hipersalinos, como la solar salterns y el Gran Lago Salado, Utah, EE.UU. [12], se dispuso. Más recientemente, otros cuatro haloarchaeal genomas han sido o están siendo secuenciados: Haloarcula marismortui, un microorganismo metabólicamente versátil del Mar Muerto [13], Haloferax volcanii, un prototrophic y moderada de microorganismos halófilos de barro del Mar Muerto [14], Natronomonas pharaonis, Alkaliphile uno de los lagos de la sosa Sinaí [15], y Halorubrum lacusprofundi, adaptadas al frío extremo halophile de un lago antártico [16]. Estos cinco genomas ofrecen una excelente vista de la diversidad haloarchaeal. Aquí se hace un repaso por lo que se ha aprendido acerca de la primera secuencia haloarchaeon, Halobacterium sp. NRC-1, principalmente a través de estudios de post-genómica [11].

Halobacterium sp. NRC-1

Halobacterium sp. NRC-1 es un extremo halophile (con un óptimo de 4,3 M NaCl), que crece mejor heterotrophically orgánicos en un rico caldo. Sin embargo, el organismo es metabólicamente versátil (Fig. 1], además de su capacidad metabólica aeróbica, que posee la capacidad de crecimiento a través de facultativos la respiración anaerobia, la utilización de dimetil sulfóxido (DMSO) y N-óxido de trimetilamina (OTMA), y de arginina a través de la fermentación. También tiene la capacidad de fotótrofas a través de la luz de bombeo de protones impulsado por la actividad de la proteína de la retina, bacteriorhodopsin, que se organiza en dos dimensiones cristalina variedad púrpura en su membrana. Halobacterium sp. NRC-1 células son muy móviles, la síntesis de vesículas de gas, que son estructuras huecas de proteínas, intracelularmente de flotabilidad y de flotación, y sensoriales rhodopsins para phototaxis. De interés para el estudio de la regulación genética, Halobacterium sp. NRC-1 responde a muchos efectores del medio ambiente, entre ellos las altas y bajas temperaturas y salinidades, y ultravioleta (UV) y la radiación ionizante.

Una de las principales ventajas de estudiar Halobacterium sp. NRC-1 es su facilidad de manipulación en el laboratorio. Cultivo es sencillo, con un tiempo de generación 6 horas a 42 ° C [17]. Además, es fácil genéticamente, que se transformables en alta eficacia [18], y una buena selección de la clonación y vectores de expresión están disponibles [19]. Varios marcadores genéticos se han desarrollado, incluyendo marcadores seleccionables para mevinolin resistencia, así como los seleccionables y counterselectable ura3 ura3 gen, que permitan la construcción sistemática de genes knockouts y reemplazos [20 - 22]. Plenario de microarrays de ADN del genoma se han utilizado con éxito para interrogar a los patrones de expresión de genes [23 - 26]. Halobacterium sp. NRC-1 células son fácilmente lisadas en medio hipotónico, tanto soluble como la liberación de proteínas de membrana para estudios bioquímicos y biofísicos [17]. Estas características, junto con la disponibilidad de la secuencia completa del genoma, han hecho Halobacterium sp. NRC-1 microorganismo un excelente modelo para la investigación, así como para la enseñanza.

Genoma, genes, y las proteínas

Halobacterium NRC-1 posee el genoma más pequeño hasta la fecha entre halophiles. Es 2571010 bp en tamaño, y se compone de un gran GC-ricos cromosoma (2014239 bp, 68% G + C), y dos más pequeñas extracromosómicos replicons, pNRC100 (191346 pb) y pNRC200 (365425 pb), con 58-59 % G + C composición [9 - 11]. Los dos más pequeños replicons contienen 145428 bp de ADN idénticos y 33-39 kb repeticiones invertidas catalizar la inversión de isómeros [27], y la mayoría de los 91 elementos IS, en representación de 12 familias, que se encuentra en el genoma [10, 11]. Como resultado de la gran cantidad de secuencias repetidas, la asamblea genoma requiere amplia cartografía genómica y un clon ordenó biblioteca de pNRC100 [9, 10] [27]. De los 2630 que la codificación de la proteína de los genes en el genoma, 2532 son únicos. Halobacterium predijo proteínas resultaron ser muy ácida [27] y un número de bacterias había homólogos como sus familiares más cercanos, lo que sugiere que podría haber sido adquirido a través de lateral de genes Transferencia [28]. Además, el 52 genes ARN También se han detectado, sin embargo, la secuencia 16S rRNA y otras características no permiten la colocación dentro de un válidamente Halobacterium especies descritas, y este punto ha sido objeto de cierta controversia [29 - 31]. Curiosamente, alrededor de 40 genes en pNRC100 y pNRC200 código de las funciones susceptibles de ser esencial o importante para la viabilidad celular (por ejemplo, thioredoxin y thioredoxin reductasa, la citocromo oxidasa, una ADN polimerasa, TATA múltiples proteínas que unen (PDD) y el factor de transcripción B (TFB ) Factores de transcripción, y la única arginyl-tRNA sintetasa en el genoma). Como resultado de ello, estas replicons se sugirió que es fundamental "minichromosomes", en lugar de megaplasmids [9]. En varios informes sobre la anotación de la Halobacterium sp. NRC-1 del genoma se han publicado [9 - 11].

Desarrollo de los instrumentos de experimentación

Un factor clave en el desarrollo de Halobacterium sp. NRC-1 como un modelo de sistema ha sido su tractability genética [19]. La transformación fue realizada mediante el empleo de EDTA a quelato de Mg 2 +, lo que debilita la capa S-, y resulta en la formación de spheroplasts, seguido por el tratamiento con polietileno glicol, que induce a la competencia [18]. Plásmido vectores se derivan de las grandes extracromosómicos replicons, pNRC100 por ejemplo [32], o miniplasmids naturales, como pHSB [33]. Por ejemplo, un popular servicio de vector, pNG168 [34], contiene la pNRC100 mínimo replicón de reproducción y Mev r marcador de selección en Halobacterium. El Mev r marcador contiene una alelo-promotor de la Haloferax volcanii 3-hidroxi-3-methylglutaryl-CoA reductasa (mva) de genes, necesarios para la biosíntesis de lípidos de cadena ramificada [35].

Un gen dirigió el método de sustitución y knockout para Halobacterium sp. NRC-1, la describió por primera vez para un archaeon [20 - 22], y explota la seleccionables counterselectable propiedades de la ura3 ura3 gen (Fig. 2]. Este gen codifica para orotidine 5'-fosfato descarboxilasa necesario para la biosíntesis de pirimidina [36]. En este enfoque, el objetivo gen alelo (por ejemplo, una deleción o mutación puntual) es primero clonado en un plásmido suicidio (por ejemplo pBB400) capaz de replicarse en E. Coli (pero no en Halobacterium), el plásmido también contiene el gen ura3 ura3 bajo el control de su propio promotor. El plásmido resultante se introduce en un Halobacterium Δ ura3 Δ ura3 Δ ura3 de acogida a través de la transformación. Integrantes son seleccionados por uracil prototrophy (Ura +) utilizando comercialmente disponibles uracil-los componentes de los medios de abandono. Posteriormente, el plásmido excisants son seleccionados a través de ura3 ura3 counterselection, 5-fluoroorortic ácido-resistencia (Foa r), dando lugar a los derivados que contengan el original o alelo mutante, que puede distinguirse por PCR o análisis fenotípico.

Por transcriptome análisis en Halobacterium sp. NRC-1, PCR y microarrays Agilent oligonucleótidos sintetizados in situ [37] plataformas de microarrays se han empleado y utilizado con éxito para los estudios fisiológicos y genéticos [23 - 26]. Por oligonucleótido arrays, sondas de 60 nucleótidos de longitud fueron diseñadas para 2474 ORFs utilizando el programa OligoPicker [38]. Ni la GC promedio relativamente alto contenido de los cromosomas, ni las variaciones en el contenido de GC en diferentes regiones del Halobacterium sp. NRC-1 fueron problemática en el diseño de la sonda y excepcionalmente alta calidad de los datos se obtuvo, con baja incidencia de los datos atípicos debido a la falta de uniformidad en la morfología del terreno, el ruido de fondo, o punto-a-punto variación de las réplicas de los experimentos.

El Halobacterium sp. NRC-1 proteoma también ha sido ampliamente analizado por cromatografía líquida de la espectroscopía de masas en tándem (LC / MS / MS) [39, 40], y un total de 888 proteínas se identificaron en lisados de células enteras. El proteoma de la misma especie Halobacterium fue analizado por 2D-GE y MALDI-TOF análisis de espectrometría de masas de los fragmentos de tríptico y un mapa de referencia se estableció [41, 42].

Los estudios experimentales de los sistemas de genes

Dos tipos de genes de los sistemas han sido estudiados en Halobacterium sp. NRC-1: las que se refieren a su extrema éxito en el medio ambiente, tales como la membrana púrpura, vesículas de gas, la reparación del ADN y la fisiología anaerobia, y los que son similares a los procesos fundamentales de eucariotas, como la replicación del ADN, y los sistemas de transcripción. En algunos estudios se iniciaron antes de la secuenciación del genoma utilizando enfoques genéticos han avanzado a través de genómica, bioinformática, genómica funcional o de trabajo, durante el período post-genómica.

La replicación del ADN y reparación

Halobacterium sp. NRC-1 proporcionó la primera oportunidad para aislar autónoma reproducir secuencias de un archaeon y esto se logró por tanto el cromosoma y el gran extracromosómicos replicón, pNRC100 [32, 43]. La repetición de secuencias, putativo in vivo de los orígenes de replicación, han aislado y clonado utilizando su capacidad para dotar de capacidad de replicación autónoma E. Plásmidos coli que contiene un seleccionable mevinolin resistencia (Mev r) marcador. Por el cromosoma, un enfoque dirigido fue llevado a investigar si cromosómicas loci proximal a orc/cdc6 homólogos poseen capacidad de replicación autónoma. Una región de 2,3 kb que contiene el gen orc7 (uno de los diez eucarióticas origen reconocimiento de tipo complejo homólogos), más 750 pb aguas arriba del gen orc7 traslacional empezar, muestran la capacidad de replicación [43]. Una casi perfecta repetición invertida de 33 pb de acompañamiento extremadamente ricos AT-tramo de 189 pb (56% GC) se encontró en la región río arriba. Este ori región correspondió a uno de los dos puntos de inflexión en cromosómicas acumulativo GC-sesgar el análisis (que se ha utilizado para la predicción bioinformáticas orígenes de replicación) [28, 44]. El ori región también fue conservada en el genoma de otras secuencias de arqueas halófilas, incluyendo Haloarcula marismortui y Haloferax volcanii [43]. Sin embargo, la región en torno a otro orco gen cerca de un segundo punto de inflexión no fue capaz de conferir capacidad de replicación, lo que sugiere la existencia de un único origen cromosómicas en Halobacterium sp. NRC-1.

Anteriormente, una región autónoma de reproducir pNRC100, que contiene un AT-550 bp rica región aguas arriba de la repH repH gen, se aisló utilizando metodología similar [32]. Sin embargo, en este caso, la naturaleza de los genes y de la región río arriba se encuentra en que a diferencia de cualquier otro replicón, excepto pHH, un plásmido estrechamente relacionadas en otro Halobacterium cepa [45]. Para la región pNRC100 replicación, la replicación autónoma fue interrumpido por mutagénesis en el enlazador de escaneo repH repH, que es necesaria para la replicación del plásmido, sin embargo, aguas arriba de la región podría ser interrumpido y parcialmente suprimido a cabo sin dañar la capacidad de replicación. La secuenciación del genoma mostró que la región repH repH gen está presente en ambos pNRC100 y pNRC200, y, por tanto, pueda participar en la replicación de ambas replicons. Curiosamente, este último replicón también contiene varios genes homólogos orco, las funciones de las cuales son desconocidas [9 - 11]. Además de proporcionar un enfoque genético para la replicación del ADN en estudios de arqueas, la disponibilidad de reproducir secuencias de Halobacterium ha facilitado el desarrollo de los vectores, incluyendo tanto lanzadera plásmidos y vectores de expresión [19].

El número de orígenes de replicación y su coordinación en Halobacterium sp. NRC-1 ha sido de gran interés. El euryarchaeon, Pyrococcus abyssi, demostró contener un único origen de replicación cromosómica similar compuesto por grandes repeticiones invertidas 5 'a la única orc/cdc6 gen de este archaeon [46, 47]. Sin embargo, la crenarchaea, Sulfolobus solfataricus y S. Acidocaldarius, se informó de que contienen dos o tres orígenes de replicación cromosómica proximal a orc/cdc6 múltiples genes en sus genomas [48, 49]. En Halobacterium sp. NRC-1, un euryarchaeon, las funciones y relaciones de múltiples (10) orc/cdc6 y repH repH genes en la replicación requieren nuevos experimentos para completar la comprensión.

Reparación de daño en el DNA ha sido investigado en Halobacterium sp. NRC-1 debido al observado altos niveles de resistencia a la radiación y la presencia de homólogos de las dos bacterias y eucariotas los genes de reparación de tipo [50]. Para la resistencia a los rayos UV, bioquímicos y genéticos demostró la presencia de cyclobutane pyrimidine dímero photolyase actividad, que corresponde a uno de los dos pcr de genes homólogos en el genoma [51]. Photolyase cataliza la photoreversal de photoadducts primaria de la radiación ultravioleta, un proceso llamado photoreactivation, que se distribuye ampliamente en la naturaleza. En dos estudios de microarrays de ADN, la transcripción de respuesta de las células a la radiación UV se estudió [24, 26], sin embargo, se obtuvieron diferentes resultados. En un estudio utilizando 30-70 J / m 2, específicos radA1 radA1 inducción de la replicación y un factor de genes (rfa3 rfa3, rfa8 rfa8, y rales) se observó [26]. En el otro estudio, utilizando dosis sustancialmente mayor, un gran número de inexplicables cambios se debieron, probablemente causado por una abrumadora de los sistemas de reparación celular y otras perturbaciones fisiológicas que se introdujeron [24]. En un estudio bioquímico de la crenarchaeon, Sulfolobus solfataricus, la replicación se encontró un factor de obligar a los rayos UV del ADN dañado [52]. En un estudio de las respuestas a la radiación de alta energía (γ) y la desecación, que dar lugar a doble filamento de ADN se rompe, la resistencia a estas condiciones se correlacionan, y efectos protectores de sales y pigmentos se observaron membrana [53].

La membrana púrpura regulon

La membrana púrpura de Halobacterium sp. NRC-1 contiene la luz impulsada por la bomba de protones, bacteriorhodopsin, un complejo de una proteína, bacterio-opsin (bop producto génico), y un desprendimiento de retina cromóforo (Fig. 1]. La púrpura de membrana permite a las células crecer phototrophically a alta iluminación, que puede ser importante para la supervivencia microaerofílica bajo condiciones de estrés y otros [5, 54]. Una combinación de genética, la bioinformática, y transcripcional análisis demostró la participación de la balanza de pagos el grupo de genes [23, 54]. El grupo incluye, además de la balanza de pagos, crtB1 crtB1 y brp, codificación de la primera y la última cometidos pasos de la síntesis de la retina, blp, un gen de función desconocida, y el murciélago, el sensor activador de genes. La secuencia Bat predijo un complejo de proteínas que consiste en una GAF (GMPc vinculante) de dominio, PAS / PAC (redox-sensing) de dominio, y C-terminal de ADN vinculante hélice-giro-hélice (HTH) motivo [54, 55]. Adicional Bat-como putativo genes reguladores se han encontrado en el genoma, y juntos es probable que se encarga de los complejos de este archaeon respuesta a la luz y el oxígeno. El papel de brp oxidativo en la división de β-caroteno para formar la retina se muestra usando el ura3 ura3 génica basada en el sistema, que también se llevó a la identificación de un gen disociados, blh, capaz de realizar la misma función [21]. Otro disociados de genes implicados en la biosíntesis de retina, la codificación de licopeno ciclasa (crtY crtY), también fue identificado por un knockout genética [56].

La balanza de pagos promotor del gen región fue estudiada por una combinación de la mutagénesis de saturación y el análisis bioinformático [57 - 60]. El TATA-box secuencia en el promotor se desvía significativamente de los archaeal consenso, lo que sugiere la participación de nuevos factores de transcripción en su reconocimiento [58]. En este contexto, el hallazgo de 6 Tbp (TATA-proteína de unión) y 7 Tfb genes (factor de transcripción B) genes en el Halobacterium sp. NRC-1 genoma sugiere el uso de otras Tbp-Tfb promotor pares en la selección y regulación transcripcional, similar a la prevista para organismos superiores [60, 61]. Mutagénesis también reveló una reglamentación sitio, UAS, 5 'de la balanza de pagos [59]. Además, UAS sitios se encontraron cerca de dos genes de la síntesis de la retina, brp y crtB1 crtB1, que son regulados coordinadamente con la balanza de pagos [54]. Similitudes de la UAS y Bat regulador a diversos organismos, incluyendo una planta y un γ-proteobacterium, sugirió un antiguo origen de esta regulon [11, 54].

Metabolismo anaerobio

La capacidad metabólica de Halobacterium sp. NRC-1 incluye la respiración anaerobia utilizando DMSO y OTMA como aceptores de electrones y la fermentación con arginina a través de la vía deiminase arginina (Fig. 1] [62, 63]. La capacidad anaeróbica para el crecimiento es probable ventajosa para el organismo en su hábitat natural como de alta concentración de sal y temperaturas elevadas, junto con una alta densidad de las células, reducir la disponibilidad de oxígeno molecular. En un reciente estudio de la respiración anaerobia en Halobacterium sp. NRC-1 [25], bioinformáticas y análisis transcripcional, y el gen knockouts mostró a hospedan una bifuncional DMSO / OTMA reductasa que está codificado por el operón dmsREABCD dmsREABCD. Esta reductasa está más estrechamente relacionada con NarG nitrato de tipo bacteriano que a reductases DMSO / OTMA reductases, aunque el análisis filogenético no es concluyente acerca de su origen evolutivo. - Todo el genoma oligonucleótido microarrays estudios mostraron que el nivel de la transcripción dms operón está fuertemente inducidos bajo condiciones anaeróbicas [25]. Gene knockouts mostró que la expresión de los dms operón está bajo control transcripcional positiva de la autoridad reguladora, DmsR. La región C-terminal de DmsR contiene un ADN HTH vinculante motivo similar a la de la balanza de pagos gen activador, Bat [19, 25]. DNA microarray análisis también indicó que Halobacterium mantiene lista para la respiración aeróbica, incluso bajo condiciones anaeróbicas. Este sistema de regulación podría resultar en una rápida respuesta metabólica al oxígeno como aceptor de electrones, si están disponibles. Se completa con la mayor abundancia de gas vesículas (ver más abajo), bajo condiciones anaeróbicas, lo que permite a las celdas de flotación a las zonas más aeróbica en la columna de agua. En otro estudio donde Halobacterium cepas overproducing púrpura o carente de membrana (generado por amplia mutagénesis química) se compararon, se deduce que durante phototrophy, los genes necesarios para la fermentación de arginina son reprimidos [23].

Gas vesícula biogénesis

Gas vesículas son huecas, boyante estructuras de las proteínas que permiten Halobacterium sp. NRC-1 a flotar, el aumento de su acceso a la luz y el oxígeno. Un gran grupo de genes en pNRC100 (gvpMLKJIHGFEDACNO gvpMLKJIHGFEDACNO) es necesaria y suficiente para producir gas vesículas [64 - 69]. Transcripción de cartografía establecido la presencia de los promotores divergentes en el gvpD gvpD-A intergénicas región [66, 67] y de microarrays de ADN confirmaron que en esencia todos los genes inducibles gvp bajo microaerofílica, anaeróbica, y otras condiciones estresantes [25]. Transcripción de la derecha gvpA gvpA y gvpC gvpC, codificación de los dos gases más abundantes proteínas de la vesícula, fue inducida en la primera fase de crecimiento exponencial [69]. Transcripción fue inhibida por la aireación y por la adición de un inhibidor de la ADN-girasa, lo que sugiere que el aumento de superenrollamiento del ADN es importante para la activación de la transcripción gvpA gvpA. Una combinación de genética y el análisis bioinformático GvpE sugirió que funciona como un activador, con una cremallera de leucina motivo de mediación dímero formación, y que GvpD, que contiene un sitio de unión NTP, que funciona como un represor, mediante el bloqueo de GvpE mediada por la activación [67 , 70].

La composición de la proteína Halobacterium sp. NRC-1 vesículas de gas se estudió con immunoblotting [71]. Además de GvpA y GvpC, dos pequeños polipéptidos ácidos, GvpJ y GvpM, similar a GvpA también fueron identificados como presentes en la estructura, y su función en la determinación de membrana de la vesícula se propuso conformación [71]. El GvpC proteínas, que contiene un motivo que se repite 7-8 veces, y se prevé que participen en unión a GvpA, era la que se presente en la superficie de las vesículas. GvpC recombinante de proteínas de fusión se encontró que se unen a la superficie de las vesículas de gas y se están utilizando en una aplicación de la biotecnología como un antígeno sistema de prestación de servicios [72, 73]. Tres nuevas proteínas, GvpF, G, y la L, se observó también en Halobacterium NRC-1 vesículas de gas, y en espiral-bobina dominios se identificaron en GvpF y GvpL, sugestiva de la libre asociación [71]. Así quedó confirmado por la observación de laddering de GvpL proteínas en geles. Genéticos y bioquímicos Estos resultados son consistentes con los hallazgos de estudios de genómica comparativa, que muestra que la correspondiente gvp genes están presentes en todos los gases de vesículas que contienen organismos examinados [71, 74 - 77].

Arsénico resistencia

Halobacterium sp. NRC-1 es resistente al arsénico, un metal pesado que se encuentra con frecuencia en ambientes hipersalinos [22]. Un grupo de genes en pNRC100, arsMR2ADR1C arsMR2ADR1C arsMR2ADR1C arsMR2ADR1C arsMR2ADR1C arsMR2ADR1C, organizada en tres operones, era la que se participa a través de la construcción y el análisis de los genes knockouts. Supresión de la región arsADRC arsADRC gen aumento de la sensibilidad a arsenito. Sin embargo, de un knockout putativo arsB arsB gen homólogo en el cromosoma no mostró efectos fenotípicos, lo que sugiere la existencia de una bomba en la novela arsenito Halobacterium sp. NRC-1. Curiosamente, knockout de la arsM arsM genes también produce aumento de la sensibilidad a arsenito, lo que indica una segunda novela arsénico mecanismo de resistencia que implican la arsenito metiltransferasa. El arsenito de la resistencia se han mostrado los elementos que deben ser reguladas, con resistencia al arsénico siendo inducibles por la exposición a una concentración subletal de los metales [22]. Estos resultados son consistentes con Halobacterium sp. NRC-1 que contiene dos sistemas de arsenito de desintoxicación.

Coenzima metabolismo B 12

Coenzima B 12 el metabolismo se ha explorado en Halobacterium sp. NRC-1 utilizando una combinación de enfoques fisiológicos y genéticos [78 - 81]. Salvamento de la coenzima B 12 precursores del medio ambiente mostraron la necesidad de un amidohydrolase no identificados previamente, la cbiZ cbiZ producto génico, que convierte adenosylcobinamide a adenosylcobyric ácido, un intermedio de novo de la coenzima B 12 biosíntesis de ruta [80]. El salvamento de la coenzima B 12 precursores de la CbiZ enzima que parece ser una única estrategia de archaeal, porque todos los genomas de B 12 productores de arqueas tener un cbiZ cbiZ ortholog. El estudio genético demostró que la absorción de cobalaminas para Halobacterium se produce a través de un transportador ABC similar a la bacteriana Btu sistema [81].

Otros estudios

Varios otros estudios experimentales se han llevado a cabo sobre Halobacterium sp. NRC-1 genes, por ejemplo, utilizando Escherichia coli como anfitrión de complementación para el análisis y la expresión heteróloga. Un RNasa H similar a la enzima bacteriana Tipo 1, necesario para la primer mudanza en la replicación del ADN, se encontró a reprimir la temperatura sensible crecimiento defecto en E. Coli, aunque de base presentes en la región E. Coli la proteína está ausente en la haloarchaeal proteína [82]. El haloarchaeal enzima también fue mostrado a cleave un fragmento de Okazaki como sustrato, en consonancia con su función en la replicación del ADN. En otro estudio, el reconocimiento molecular de un tRNA Cys por la bacteria de tipo cysteinyl-tRNA sintetasa de Halobacterium sp. NRC-1 fue estudiada después de expresión en E. Coli y mostró similitudes con su homólogo bacteriana [83].

Bioinformáticas estudios

Un gran número de investigaciones de la bioinformática se han llevado a cabo sobre Halobacterium sp. NRC-1 desde la secuenciación del genoma. Estos incluyen estudios de proteínas acidez, la estructura proteoma predicción, y el análisis filogenético de los genes que se hayan adquirido a través de la transferencia lateral de genes (LGT), así como una serie de amplia o estrechamente en los estudios comparativos.

Ácidos proteoma

Punto isoeléctrico análisis de la predicción del proteoma Halobacterium sp. NRC-1 siempre y profundo conocimiento de la capacidad de este organismo para sobrevivir bajo condiciones hipersalinos [9 - 11, 28]. Una media baja de manera espectacular pI (~ 4,9) se encontró Halobacterium proteínas y de la generalidad de esta observación fue confirmada mediante el análisis de secuencias del genoma haloarchaeal posterior. En contraste, la mediana de pI de casi todos los no halófilas proteomes ha resultado ser cercana a neutral, por lo general con una distribución bimodal de base (pI ~ 10) y ácidos (pI ~ 5) proteínas. Excepciones notables fueron para algunos metanogénico arqueas halófilas y una bacteria, Salinibacter ruber, que a veces coexisten con Halobacterium en ambientes hipersalinos y también contienen relativamente altas concentraciones de sal interna [84 - 86]. La acidez de las proteínas halófilas probablemente ayuda a mantener su función mediante un aumento de solvatación en un ambiente intracelular reducido con actividad de agua [87].

El ácido Halobacterium pI de las proteínas se correlacionó con una alta concentración de la superficie de carga negativa en el modelo de estructuras [28]. Un factor de transcripción (TbpE) y una subunidad de la topoisomerasa (GyrA) ambos mostraron significativamente mayor superficie cargos negativos en comparación con sus homólogos en los organismos halófilos no Coulomb utilizando una carga de cálculo. Si bien existe una reducción general en deprotonation de residuos ácidos en la proteína de superficie a los 5 M NaCl como resultado de una disminución de la constante dieléctrica [88], la superficie de la mayoría de los cargos de proteínas todavía muy negativos. Por ejemplo, cuando el Tbp-Tfb complejo ADN-fue modelada utilizando una constante dieléctrica que refleja las condiciones intracelulares, la gran diferencia en la superficie cargos, en comparación con la complejidad humana, se siguen observando (Fig. 3]. Este patrón de aumento de carga negativa y se reduzca el pI se observó para la gran mayoría de haloarchaeal proteínas en comparación con sus homólogos.

En otro estudio, la predicción de novo estructura se realizó en 1185 y proteínas de dominios de la proteína Halobacterium sp. NRC-1 [89]. Putativo funciones fueron predichas por la búsqueda de proteínas DataBank. Tres ejemplos, quimiotaxis proteínas, polipéptidos y prophage posible archaeal reguladores transcripcionales, se pusieron de relieve en el informe publicado.

Evolución y lateral de la transferencia de genes

Inicial de todo el genoma análisis filogenético de Halobacterium sp. NRC-1 confirmó la archaeal situación de la Halobacterium sp. NRC-1 [10], pero también señaló las similitudes interesantes a los Gram-positivas que forman esporas de la bacteria, Bacillus subtilis, y la bacteria resistente a la radiación, Deinococcus radiodurans. Posterior análisis del genoma en su conjunto-mediante un mayor número de genomas terminó producido árboles filogenéticos con Halobacterium ramificación cerca de la base archaeal rama, o incluso dentro de las bacterias [90, 91]. Esto fue en contraste con el análisis filogenético basado en secuencias concatenadas de la transcripción y la maquinaria transcripcional, que producen resultados similares a 16S rRNA análisis Halobacterium puesta en el archaeal clado [92]. Una interpretación de contabilidad para estos resultados es incongruente que muchos LGTs se han producido entre algunas bacterias y haloarchaea, aunque esta conclusión parece estar abierta a debate algunos (Fig. 4] [93].

A pesar de las incertidumbres iniciales, varios casos de LGT ahora parecen ser convincentes. Algunos componentes de la cadena de transporte de electrones y la biosíntesis de proteínas tenían genes idénticos a la organización homóloga E. Operones coli (nuo genes, la codificación de subunidades de NADH deshidrogenasa; cox genes, la codificación de subunidades del citocromo c oxidasa, y el hombre los genes, que codifican la biosíntesis menaquinone) [28]. GC análisis de la composición de estos genes mostró que se apartan significativamente de cerca Halobacterium genes y un estudio filogenético indicaron su agrupación con genes bacterianos. Un estudio más detallado de los genes mostró nuoI nuoI clara afinidad filogenética con proteobacteria [94]. Estos estudios sugirieron que haloarchaea pueden haber adaptado a un ambiente oxidante mediante la adquisición de componentes de la cadena de transporte de electrones a través de LGT eventos de bacterias [11].

Un caso relativamente reciente de la LGT es arginyl sintetasa (argS argS) de genes de Halobacterium sp. NRC-1, que se encuentra en pNRC200 [9]. Aunque su composición GC no difirió significativamente de la media de los genomas, de máxima probabilidad análisis filogenético demostró que ArgS de Halobacterium no archaeal grupo con otros (como los de otros haloarchaeal) ArgS proteínas, pero está más ligado a una clase de proteínas de las bacterias ArgS (Fig. 4]. Dada la naturaleza esencial de arginyl sintetasas para la síntesis de proteínas, es probable que un gen bacteriano argS argS fue capturado y la archaeal argS argS posteriormente se perdió en Halobacterium sp. NRC-1. Otro ejemplo de desplazamiento de genes ortólogos se ha encontrado en los estudios de genes de la biosíntesis de lípidos [95].

Una de las más interesantes preguntas sobre la evolución Halobacterium centra en el origen de la luz impulsado por la bomba de protones, bacteriorhodopsin [11]. Tal retina chromoproteins (bacteriorhodopsin, halorhodopsin y sensoriales rhodopsins) originalmente descubierta en haloarchaea ahora se han encontrado en diversas bacterias y eucariotas y, por lo tanto, pueden haber evolucionado antes de la divergencia de los tres ámbitos de la vida [96]. Por otra parte, se producen en un número relativamente reducido de clados y diversa, por ejemplo plancton oceánico bacterias, algunos hongos, y haloarchaea, sugiere la dispersión por LGT. Aunque el análisis filogenético, de momento han sido concluyentes, características espectroscópicas han sugerido la posibilidad de co-evolución de la retina con pigmentos de clorofila de base [11, 97].

Otros estudios de la bioinformática

Un interesante estudio demostró la importancia de la proteína Tat vía de la exportación en Halobacterium sp. NRC-1 [98, 99]. Esta vía permite el transporte transmembrana de las proteínas en una conformación totalmente doblado y se utiliza para la exportación de un número moderado de las proteínas en las bacterias, por ejemplo, las vinculante cofactores como el hierro-azufre y agrupaciones molybdopterin. Sin embargo, en Halobacterium sp. NRC-1, la mayoría de las proteínas son exportados previsto utilizar la vía Tat. Esto ha sido explicado como una adaptación a las condiciones altamente salina, que puede requerir de proteínas intracelulares plegables para la estabilidad [98, 99]. En otro estudio, mal conservadas varios marcos de lectura abierta (ORFans), de Halobacterium sp. NRC-1, con aparente paralogs en el genoma, pero sin una clara homólogos en otros organismos, se mostraron como las transcritas. Los resultados indicaron que la totalidad de los estudiados paralogous ORFans correspondían a los genes reales, incluidos los que comprenden relativamente corto proteínas [100]. Dos estudios de la genómica comparativa han aparecido, una comparación de la información de transferencia de genes específicamente entre haloarchaeal especies [101], y otra comparación de los genes en la respuesta de estrés Halobacterium sp. NRC-1, E. Coli, y Drosophila melanogaster [102].

Perspectivas futuras

Haloarchaea representan excelentes modelos experimentales de la biología y de extremófilos aspectos fundamentales de la biología archaeal y eucariotas. También sirven como recursos para cuestiones teóricas de la biología evolutiva y la astrobiología [103]. Por Halobacterium sp. NRC-1, la determinación de la secuencia completa del genoma y el desarrollo de muchos post-genómica técnicas experimentales, incluida la capacidad génica, DNA microarrays, y la proteómica, así como en bioinformática silico enfoques, este organismo han elevado a la categoría de Modelo de sistema líder entre extremófilos y arqueas. Una de las ventajas de la post-genómica estudios sobre Halobacterium sp. NRC-1 es que puede llevarse a cabo utilizando bien caracterizado cepas isogénicas. Como resultado de ello, la investigación en el futuro sobre este modelo de sistema pueden contribuir significativamente a ampliar nuestra comprensión de los conceptos biológicos fundamentales y, en definitiva, la prueba nuestras facultades predictivas.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Todos los autores participaron en la redacción de este manuscrito.

Agradecimientos

El trabajo examinó en la de los autores de laboratorio ha recibido el apoyo de subvenciones MCB-0450695, MCB-0296017, y MCB-0135595 de la National Science Foundation. Queremos agradecer a los numerosos miembros del grupo de laboratorio y colaboradores que han contribuido al desarrollo de la Halobacterium sp. NRC-1 modelo de sistema.