BMC Immunology, 2006; 7: 6-6 (más artículos en esta revista)

Retraso en la maduración funcional de regulación natural de las células T en la médula del timo postnatal: papel de TSLP

BioMed Central
Qi Jiang (qi_jiang@med.unc.edu) [1], Su Hua (su@email.unc.edu) [1], Geoffry Knudsen (geoffry_knudsen@med.unc.edu) [1], Whitney Helms (whitney_helms @ Med.unc.edu) [1], Lishan Su (LSU@med.unc.edu) [1]
[1] Lineberger Comprehensive Cancer Center, School of Medicine, The University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC 27599, USA
[2] Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, The University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC 27599, USA
[3] Curriculum in Genetics and Molecular Biology, School of Medicine, The University of North Carolina at Chapel Hill, Chapel Hill, NC 27599, USA

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Resumen
Antecedentes

Generación de CD4 + CD8 funcional - CD25 + células T reguladoras (Treg) en el murino timo depende de FoxP3. La eliminación de la timo de ratones recién nacidos se ha demostrado que el resultado de una enfermedad autoinmune multiorgánico fenotipo que se puede prevenir mediante la introducción de la FoxP3 + Treg a la población animal. Tiene por lo tanto, se propone que funcional FoxP3 + células Treg no se hacen en el timo neonatal, sin embargo, aún no está claro cuándo y dónde FoxP3 funcional CD4 + CD8 + - CD25 + timocitos se generan en el timo postnatal.

Resultados

Se reporta que ni FoxP3 mRNA ni proteína se expresa en las células CD4 + CD8 - CD25 +, CD4 o CD8 + - CD25 - timocitos hasta 3-4 días después del nacimiento, a pesar de la presencia de maduros CD4 + CD8 - CD25 + / - timocitos en el Timo por 1-2 días después del nacimiento. FoxP3 - CD4 + CD8 - CD25 + timocitos día 2 de ratones recién nacidos no muestran actividad Treg. Curiosamente, somos capaces de detectar bajo número de FoxP3 + timocitos dispersos en la región medular de la timo ya en 3-4 días después del nacimiento. Expresión de FoxP3 es inducido en el día 17 embrionario fetal timo órgano cultura (FTOC) después de 4-6 días de cultivo in vitro. FTOCs con tratamiento de los derivados del estroma del timo lymphopoietin (TSLP) una mayor expresión de FoxP3, y el bloqueo del receptor de la TSLP reduce FoxP3 expresión en FTOC. Además, TSLP estimula FoxP3 expresión en purificada CD4 + CD8 - timocitos, pero no en las células CD4 + CD8 +, CD4 - CD8 + y CD4 - CD8 - timocitos.

Conclusión

Expresión de Treg o FoxP3 maduración es distinta ontogenically y kinetically retraso de la generación de CD4 + CD8 - CD25 + CD4 o CD8 + - CD25 - timocitos en el timo postnatal. TSLP medular producido a partir de células del timo epitelios (mTEC) contribuye a la expresión de FoxP3 y de la maduración de las células T reguladoras naturales. En conjunto, estos resultados sugieren que el desarrollo de las células Treg requiere paracrina de señalización durante las etapas finales de maduración de thymocyte que es distinta de señalización durante la selección positiva o negativa.

Antecedentes

Ha sido bien documentado que el timo desempeña un papel fundamental en la supresión de reacción espontánea a través de las células T de selección negativa. Además, las células T supresoras de la actividad se generan en el timo periféricos para regular la inmunidad [1, 2]. La eliminación de la timo de 3 días de edad ratones recién nacidos conduce a múltiples órganos enfermedad autoinmune en algunas cepas de ratones [3 - 6]; sin embargo, la eliminación de los ratones el timo de 7 días de edad o mayores causas poco o nada de la autoinmunidad. Estas observaciones han llevado a la propuesta de que las células T supresoras de la actividad en el timo o bien no están generados en emigrar o no en el timo de ratones recién nacidos. De hecho, la transferencia de una parte de los adultos CD4 + CD8 - timocitos CD25 + (T reguladoras naturales o células Treg) en el día 3 thymectomized ratones previene enfermedad autoinmune [7 - 9].

Natural CD4 + CD25 + células T reguladoras están presentes en el timo y órganos linfoides periféricos [9, 10]. Aunque los estudios han demostrado claramente que son las células Treg generadas en el timo, estas células también pueden ser derivados de células T maduras en los órganos periféricos [11, 12]. Si bien los mecanismos moleculares de Treg linaje de desarrollo, son poco conocidos, recientes estudios genéticos en ratones y seres humanos han identificado Scurfin o FoxP3, un factor de transcripción forkhead familia, como un maestro de Treg determinante el desarrollo y la función [13 - 18]. Ratones desempeño mutaciones en el gen FoxP3 (scurfy ratones) presentan enfermedades linfoproliferativas y autoinmunes fenotipos. Estos ratones han sido encontrados a la falta funcional células Treg. Del mismo modo, los pacientes humanos con mutaciones en el gen FoxP3 desarrollar un trastorno autoinmune múltiple de órganos conocido como IPEX, que es coherente con la falta de las células Treg. Por último, la expresión ectópica de FoxP3 ingenuo en CD4 + CD25 - células T les induce a convertir a las células Treg [15, 17], y con objetivos de FoxP3 inactivación en ratones lleva a la pérdida de Treg desarrollo [16, 18]. La expresión preferencial de las células Treg en FoxP3 y determinista su actividad en el desarrollo Treg linaje lo convierten en la mejor marcador de las células Treg naturales, si bien la regulación de su expresión y de los mecanismos de su función en Treg aún no están aclaradas.

De acuerdo a la afinidad / avidez modelo, CD4 + CD8 + DP timocitos en la corteza cerebral o medular de la cortical de los cruces (CMJ) que interactúan con la libre MHC en niveles muy bajos, son rescatados de la muerte, por lo tanto, positiva seleccionados. Alternativamente, timocitos son inducidas a morir por la negativa de selección, si las interacciones entre timocitos y células epiteliales del timo (TEC) o células presentadoras de antígenos (APC) en el resultado de señalización por encima de un cierto umbral. Estos tipos de interacciones de alta afinidad con la libre antígeno son la manera más eficaz la mediación de la APC, y por lo general se producen en el CMJ. Se ha propuesto que la inducción de la maduración FoxP3 y de la Treg linaje representan un linaje en el timo debido a la selección de las señales que se encuentren entre las de los positivos y negativos de selección [19 - 22]. Esta hipótesis, sin embargo, no ha sido claramente verificada. Curiosamente, FoxP3 + CD4 + CD25 + células T se han inducido en órganos periféricos por una exposición prolongada a sus afines antígenos, lo que sugiere que Treg naturales-como las células también pueden ser generados en un timo-independiente de la moda [12, 23].

Hemos investigado la cinética de FoxP3 expresión y de la generación de CD4 + CD8 - CD25 + timocitos en el timo órganos de los ratones en las diversas edades después del nacimiento. Demostramos que ni FoxP3 mRNA ni proteína es significativamente expresada en las células CD4 + CD8 - CD25 +, CD4 + CD8 - CD25 - u otros timocitos hasta 3-4 días después del nacimiento, a pesar de la presencia de CD4 + CD8 - CD25 + timocitos en el timo De 1-2 días de edad ratones recién nacidos. FoxP3 expresión es inducida en 3-4 días después de su nacimiento y detectado en ambos CD4 + CD8 - CD25 + y CD4 + CD8 - CD25 - timocitos. Como era de esperar, FoxP3 - CD4 + CD8 - CD25 + timocitos de ratones recién nacidos día 2 proliferan in vitro y no muestran actividad represivas Treg. Mientras que un creciente porcentaje de CD4 + CD8 - CD25 + timocitos expresa FoxP3 desde el día 3 (21%) al día 8 (59%), una población pequeña (<1%), de CD4 + CD8 - CD25 - timocitos también expresa FoxP3. Casi todos FoxP3 + timocitos se detectan en la región medular de la timo, incluso en ratones de 3-4 días de edad. Expresión de FoxP3 es inducido en el día 17 embrionario fetal timo órgano cultura (FTOC) 4-6 días después de la cultura in vitro. FTOC con tratamiento de los derivados del estroma del timo lymphopoietin (TSLP) aumenta la expresión de FoxP3. Esta expresión se correlaciona con un aumento de la maduración de FoxP3 + CD4 + CD25 + timocitos. El bloqueo de los receptores de la TSLP reduce significativamente FoxP3 expresión en FTOC. TSLP estimula FoxP3 expresión en purificada CD4 + CD8 - timocitos, pero no en las células CD4 + CD8 +, CD4 - CD4 o CD8 + - CD8 - timocitos.

Resultados
Tardía FoxP3 de expresión en las células CD4 + CD25 + timocitos timo de los órganos de ratones recién nacidos

Hemos investigado el desarrollo ontogénico de las células Treg timo en los órganos de los ratones recién nacidos. En comparación, los porcentajes de CD4 + CD8 - timocitos con Treg fenotipos (CD4 + CD8 - CD25 +) se detectan en el día 1-8 neonatal timo órganos (Fig. 1A y Tabla 1]. Cuando se mide por PCR en tiempo real en timocitos de ratones recién nacidos, FoxP3 expresión mRNA no se detectó en timocitos de 1 y 2 días de edad ratones. Los importantes niveles de expresión se detectaron FoxP3 timocitos en el timo de los ratones de 3 días o más (Figura 1B y datos no presentados). Estos datos ponen de manifiesto que a pesar de CD4 + CD25 + timocitos están presentes en ratones de 1-2 días de edad, FoxP3 no se expresa hasta 3 días después de su nacimiento.

Para analizar si la FoxP3 proteína se expresa en recién nacidos timocitos, que generó un anticuerpo anti-FoxP3. Usando 293T transfectadas con células de ratón FoxP3, nos demostró que este anticuerpo se podría utilizar para detectar FoxP3 por Occidental, tinción de inmunofluorescencia y análisis FACS (Figura 2A]. Anti-FoxP3 anticuerpos específicamente manchadas FoxP3 intracelular en las células CD4 + CD25 + células Treg aisladas de tipo salvaje, pero no scurfy, ratones por FACS (Fig. 2A, a la derecha). Utilizando el anticuerpo anti-FoxP3, nos mostró que la proteína FoxP3 no se detectó en el CD4 + CD8 - timocitos CD25 + de 1 y 2 días de edad ratones recién nacidos según lo determinado por FACS (Figura 2B]. Los importantes niveles de FoxP3 se detectó por primera vez en las células CD4 + CD25 + y CD4 + CD25 - células del timo 3 días de edad (21% FoxP3 + en las células CD4 + CD8 - timocitos CD25 +), alcanzado altos niveles en los 6-8 días (41 % En el día 6 y el 59% en el día 8), y fueron más elevados y mantenerse en el timo de adultos (70% FoxP3 + en las células CD4 + CD8 - timocitos CD25 +) (Fig. 2B y el Cuadro 1]. De acuerdo con informes recientes en el timo de adultos [24, 25], una población pequeña (<1%), de CD4 + CD8 - CD25 - timocitos también expresó FoxP3 (Fig. 2B, 4C y datos no presentados). Por lo tanto, la expresión de FoxP3 parece a la zaga de la generación de CD4 + CD8 - timocitos CD25 +, lo que indica que la maduración de FoxP3 + Treg timocitos se retrasan en relación con maduras único positivo timocitos (CD4 + CD8 - CD25 + CD4 o CD8 + - CD25 -- ). Este retraso en la maduración y el FoxP3 expresión en el recién nacido timo puede ayudar a explicar la falta preferencial de las células Treg en día 3 thymectomized ratones.

CD4 + CD8 - CD25 + timocitos día 2 de ratones recién nacidos no son funcionales las células Treg

Para investigar si los CD4 + CD8 - CD25 + timocitos día 2 en los ratones recién nacidos son funcionales células Treg, ordenados esta población y se analiza su proliferación y represivas capacidad in vitro. Como se muestra en la Fig. 3, de adultos células Treg expresando FoxP3 no mostró proliferación y eficiencia de respuesta reprimida células T. En cambio, CD4 + CD8 - CD25 + timocitos de ratones recién nacidos día 2 proliferado en respuesta a la estimulación in vitro TCR y no reprimir la proliferación de las células CD4 + CD25 - Respuesta células T, lo que indica que no son funcionales las células Treg.

FoxP3 localización de las células Treg + en el timo de ratones adultos y neonatal

Para determinar la localización y FoxP3 + fenotipo de las células Treg neonatal en el timo, se realizó tinción inmunohistoquímica e inmunofluorescencia. Como se muestra en la figura 4A, FoxP3 + células no se detectaron en el timo de 1-2 días de edad ratones recién nacidos. Baja número de FoxP3 + células fueron detectables en el timo, de 3 días de edad ratones. El número de células FoxP3 + aumentado significativamente en los 4-5 días de edad timo y llegó a los niveles de adultos en los 6 días de edad timo (Fig. 4A y 4B]. Curiosamente, casi todos los FoxP3 + baja densidad de las células se localizan en la región medular del timo (Fig. 4A y 4C]. Esta observación es válida incluso en ratones de 3-4 días de edad, lo que sugiere la importancia de la médula del timo en la prestación de los factores paracrinos FoxP3 expresión para inducir la maduración y Treg.

Aumento de expresión de FoxP3 por TSLP timo órgano fetal en la cultura

Lymphopoietin derivados del estroma del timo (TSLP) es un tipo de citoquinas que predominantemente medular del timo producida por las células epiteliales y se ha demostrado recientemente para modular DC humanos y las respuestas de células T [26 - 28], y para promover la proliferación de los linfocitos T CD4 + en ratones [ 29]. Debido a este hallazgo y su expresión en la médula, decidimos probar la hipótesis de que TSLP también participa en la inducción de Treg ratón timo en el desarrollo de órganos. Se investigaron la cinética de expresión en FoxP3 timo órganos a los 17 días de embriones cultivados in vitro (FTOC). Expresión de FoxP3 no era detectable en el día 0 o el día 2 FTOC, pero se ha detectado en niveles significativos después de 4-6 días en la cultura (Fig. 5A]. Por lo tanto, utilizan el modelo E17 FTOC paracrina para investigar las señales que contribuyen a la expresión de FoxP3 en el timo. Cuando ensayado en el modelo FTOC, TSLP aumento de la expresión de FoxP3 en el timo (Fig. 5B]. Si bien el número total de timocitos, no mostró cambios significativos, TSLP mejorar significativamente el tratamiento de maduración de las células CD4 + y CD8 + timocitos único positivo. Además, tanto el porcentaje relativo y el número total de CD4 + CD25 + se timocitos mayor (Fig. 5D]. Estas observaciones indican que los exógenos TSLP promueve la maduración de los timocitos, incluidos los CD4 + CD8 - FoxP3 + CD25 + células Treg natural en el timo.

Para demostrar que TSLP endógeno de señalización mediada se requiere en el timo de FoxP3 expresión, que utiliza un anticuerpo que bloquea los receptores de la TSLP (TSLPR) en el modelo FTOC. El bloqueo de la TSLPR con este anticuerpo inhibe FoxP3 expresión, mientras que un control no mostró ningún efecto de anticuerpos (Fig. 5C y datos no presentados). Este experimento sugiere que TSLP de señalización mediada por involucrada en la expresión de FoxP3 y maduración de Treg timocitos en el timo. Similar fracciones de FoxP3 + CD4 + CD25 + timocitos fueron, sin embargo, que se encuentra en TSLPR nulo emparejados por edad y tipo de ratones silvestres (datos no presentados). TSLP, por lo tanto, contribuye a, pero no es absolutamente necesario para la maduración de FoxP3 + CD4 + CD25 + en las células Treg murino timo.

TSLP aumenta FoxP3 expresión en purificada CD4 + CD8 - timocitos in vitro

Para investigar si TSLP interactúa directamente con timocitos para inducir FoxP3 expresión o indirectamente a través de interacciones con otros tipos de células como los países en desarrollo en el timo como se informó en los seres humanos [26 - 28], estamos aislados timocitos del 2 días de edad y los ratones tratados con ellos en TSLP Vitro de 2 días. Como se ha visto antes en FTOC, TSLP promueve la maduración de los timocitos incluyendo CD4 + CD8 - CD25 + + FoxP3 naturales Treg timocitos (Fig. 6A, 6B y 6C]. A falta de TSLP, recién aisladas timocitos de 2 días de edad timo no expresan niveles detectables de FoxP3 después de 2 días de la cultura. TSLP inducida FoxP3 expresión, tanto en los niveles de mRNA y de proteínas cultivadas en timocitos (Fig. 6B y 6D]. Usando TSLP receptor mutante timocitos, pero no hemos podido detectar cualquier aumento de la expresión FoxP3 por TSLP, demostrando que en realidad se TSLP de trabajo a través de la TSLP receptor en este sistema (Fig. 8]. Los datos sugieren que, en contraste con humanos TSLP mediador de la maduración y el DC indirectamente induce Treg actividad en el timo humano, de ratón TSLP pueden interactuar directamente con el ratón timocitos para promover la maduración de FoxP3 + CD4 + CD25 + timocitos y FoxP3 para aumentar la expresión de genes.

Para probar que thymocyte subpoblaciones de responder directamente a TSLP, purificado CD4 + CD8 + (DP), CD4 - CD8 - (DN), CD4 + CD8 - (SP4) o CD4 - CD8 + (SP8) timocitos y los trataron con TSLP en Vitro de dos días. TSLP mayor expresión de FoxP3 en timocitos SP4, pero no en DP, DN SP8 o timocitos (Fig. 7A]. Estamos subdividirse el SP4 y SP8 thymocyte poblaciones sobre la base de su expresión de CD25. TSLP mayor expresión FoxP3 por 10 veces en las células CD4 + CD25 - timocitos, y alrededor de 2 veces en las células CD4 + CD25 + timocitos (Fig. 7B]. En cambio, ni tampoco CD25 + CD25 - SP8 timocitos respondió a TSLP. También investigó si TSLP afecta a la proliferación o supervivencia de los timocitos durante los dos días de cultivo in vitro. Nuestros resultados muestran que el tratamiento TSLP afectados ni la proliferación ni la supervivencia de las células CD4 + CD25-o CD4 + CD25 + timocitos (Fig. 9A y 9B]. Junto nuestros datos sugieren que la interacción de TSLP con su receptor puede promover FoxP3 expresión y CD4 + CD25 + FoxP3 + Treg desarrollo en el timo, por lo menos en parte, a través de la interacción directa con los timocitos CD4 + SP.

Discusión

Presentamos aquí que, aunque maduros único positivo incluidos timocitos CD4 + CD25 + timocitos puede detectarse en 1-2 días ratones recién nacidos, el gen FoxP3 no se expresa en el timo hasta 3-4 días después de su nacimiento y no la expresión de dosis enfoque de adultos Niveles hasta después de 6-8 días. FoxP3 expresión se detectó en ambos CD4 + CD8 - CD25 + y CD4 + CD8 - CD25 - timocitos. Como era de esperar, FoxP3 - CD4 + CD8 - CD25 + timocitos día 2 de ratones recién nacidos no muestran actividad Treg. Casi todos FoxP3 + timocitos se detectan en la región medular de la timo. Además, hemos demostrado que TSLP aumenta la maduración de las células CD4 + CD8 - timocitos CD25 +, así como FoxP3 expresión, y que el bloqueo de TSLPR endógeno en el timo FoxP3 inhibe la expresión. Además, TSLP interactúa directamente con CD4 + SP timocitos FoxP3 afectan a la expresión y el desarrollo Treg.

Nuestros resultados de acuerdo con un informe reciente que muestra que los niveles más bajos de ARNm FoxP3 se detectaron en las células CD4 + CD25 + células T del 3 días de edad ratones recién nacidos [30]. Este informe, sin embargo, no aclaró si FoxP3 se expresa en ratones de 1-2 días de edad, y si todas las células Treg de 3 días de edad ratones expresan niveles más bajos de ARNm FoxP3 o si una menor fracción de estas células expresa el mismo nivel de FoxP3 MRNA como CD4 + CD25 + células Treg de ratones adultos. Hemos demostrado que aquí FoxP3 expresión no es detectable en Treg-al igual que las células de ratones de 1-2 días de edad, y que una menor fracción de día 3 neonatal CD4 + CD25 + timocitos FoxP3 expresa la proteína en niveles comparables a los adultos maduros células Treg.

Como detectados por tinción inmuno-timo de los tejidos, tanto CD4 + CD25 + FoxP3 + y CD4 + CD25 - FoxP3 + células se detectaron en el timo (Fig. 3]. FoxP3 + timocitos son inducidos en el timo 3-4 días de edad, con una medular de la distribución similar a la observada en los adultos timo. Esto es coherente con un informe reciente utilizando la FoxP3-GFP en el ratón knock-. En este modelo, la expresión de FoxP3 es detectado por las buenas prácticas agrarias [24, 31]. Similar a la búsqueda de nuestra lucha contra el uso de la tinción de FoxP3, la FoxP3-GFP + timocitos inicio que se detecta en la médula de los 3-4 días de edad timo. Estos resultados sugieren que las células CD4 + CD25 + timocitos necesidad paracrina señales proporcionadas por las células en la región medular para entrar plenamente maduro FoxP3 + Treg timocitos. Como positivos y negativos de selección de selección de timocitos ocurre predominantemente en la corteza y el CMJ, se esperaría que una localización preferente de las nuevas FoxP3 + timocitos en la corteza / CMJ si compromiso de Treg naturales y FoxP3 inducción está estrechamente relacionado con el TCR mediada positivo / Negativo selección. El dispersas medular de la distribución de FoxP3 + timocitos en 3-4 días de edad timo órganos apoya la idea de que la inducción de la expresión FoxP3 puede ser un evento posterior a la selección, con la participación única tipos de células y / o citocinas en la médula.

Señalización mediada por CD28 es necesaria para la inducción de FoxP3 y natural Treg generación [32]. El CMJ se enriquece con la APC, que expresan el ligandos B7 señal de que CD28. Otros factores que, por consiguiente, debe ser proporcionada en la médula a llevar a la maduración funcional de FoxP3 + Treg timocitos. Recientemente se informó que el Hassall corpúsculos humanos en la médula del timo preferentemente expresar la TSLP de citoquinas, que promueve la maduración de la DC y la generación de Treg induce naturales [33]. El timo murino no tiene Hassall del corpúsculo estructuras de tipo ratón TSLP aunque también es predominantemente medular expresadas por TEC en el timo [33]. Presentamos aquí ratón TSLP exógenos que pueden aumentar la expresión de FoxP3 naturales y la maduración de las células Treg en FTOC ratón, y que el bloqueo de TSLPR conduce a la reducción de la expresión de FoxP3. Hemos detectado TSLP la expresión génica mediante RT-PCR en 1-6 días de edad neonatal y de adultos timo órganos, pero su expresión cinética no es funcional correlacionado con FoxP3 + Treg desarrollo (datos no presentados). Adicional paracrinos son probablemente los factores involucrados.

¿Cómo TSLP modular la maduración de las células CD4 + CD25 + + FoxP3 células Treg en el timo? Aunque TSLP se expresa principalmente por las células del estroma medular del timo, su efecto sobre las células T en ratones no ha sido claramente establecida [34 - 36]. En ratones transgénicos que expresan más de TSLP-, el desarrollo de las células B y las células T parece ser afectada, pero el número de células mieloides son el aumento [37]. En estudios en humanos, se ha demostrado TSLP de modular la maduración DC indirectamente a regular las respuestas de células T [26 - 28]. En contraste, el ratón TSLP ha sido implicado directamente en la promoción de TCR mediada por la proliferación de ratones que los linfocitos T CD4 + tanto desde el timo y el bazo [29]. Nuestro estudio purificado con timocitos CD4 + después de dos días en la cultura, en la ausencia de estimulación TCR, sugiere que TSLP induce FoxP3 en CD4 + CD8 - (CD25 y CD25 + -) timocitos, pero no en las células CD4 + o CD8 + DP CD4 -- SP8 timocitos CD8 +. Además, TSLP no inducir FoxP3 expresión en las células CD4 + CD25 - células T del bazo bajo similares condiciones de cultivo (Fig. 10]. También puso de manifiesto que el tratamiento TSLP afectados ni la proliferación ni la supervivencia de las células CD4 + CD25 - o CD4 + CD25 + timocitos durante los dos días de cultivo in vitro (Fig. 9]. Por lo tanto, TSLP puede tener un único efecto en las células CD4 + timocitos FoxP3 para inducir la expresión de genes que es distinta de su actividad en la promoción de CD4 + T proliferación de las células.

El receptor de TSLP consiste en un heterodimer de la alfa del receptor de interleucina 7 (IL-7R α) y la cadena de TSLP receptor (TSLPR) que se asemeja a la de receptores de citoquinas cadena gamma común [35, 38, 39]. Según lo propuesto en los informes anteriores con ratones mutantes TSLPR [29, 36], TSLPR y otros receptores / ligandos interactúan funcionalmente para modular el desarrollo de las células B, y la proliferación de las células T. TSLP señalización mediada es el único entre los miembros de la familia de receptores de citoquinas en que la activación del factor de transcripción Stat5 se produce sin detectables Janus quinasa activación [40, 41]. Curiosamente, murino TSLPR media señales que son distintas de las señales mediadas Jak3 visto con la cadena gamma común [36]. Esto potencialmente único de la actividad de señalización de citoquinas TSLPR puedan participar en la modulación de FoxP3 expresión y CD4 + CD25 + Treg timocitos en maduración. TSLP también parece tener diferentes efectos sobre la pro-células B fetales y adultos de origen [42], lo que sugiere distintas redes de señalización en desarrollo frente a tipos de células maduras pueden determinar su capacidad de respuesta a TSLP. Una distinción similar puede existir en el frente timocitos maduros células T periféricas, ya que, a diferencia de lo que hemos visto en el timo, el tratamiento de los CD4 + CD25 - células T del bazo con TSLP no mostró ningún efecto sobre la expresión génica FoxP3 (Fig. 10].

Bloqueo TSLPR en FTOC sólo parcialmente reduce el número de FoxP3 + CD4 + CD25 + timocitos. Además, la frecuencia y la función de FoxP3 + CD4 + CD25 + Tregs en el bazo y los ganglios linfáticos de TSLPR nulo ratones adultos no son significativamente alterados (Q. Jiang, G. y L. Knudsen Su, resultados no publicados). Así, participa en TSLP, pero no absolutamente necesario, para que el proceso que regula FoxP3 expresión y de maduración Treg. Otros factores que pueden compensar la pérdida de TSLP de señalización durante la embriogénesis Treg o durante la maduración. Paracrina factores que se sabe están involucrados en la generación de Treg y de la función, incluida la interleucina 10 y TGF-β, también se expresan en el timo y pueden contribuir a este proceso. Por ejemplo, la TGF β ha informado de inducir Treg y FoxP3 expresión madura en CD4 + CD25 - las células T [11, 43]. Nuestros resultados preliminares, sin embargo, indican que el TGF β e IL-10, bajo o ningún efecto sobre FoxP3 expresión en el modelo FTOC (P. y L. Jiang Su, resultados no publicados). Recientemente se informó de que la cadena de citoquinas comunes gamma γ c es necesaria para la expresión de FoxP3 y Treg maduración [44]. En este contexto, la TSLPR y γ del receptor de Mayo c mediar similar altos de las señales, como STAT5 para activar la expresión de genes y FoxP3 maduración Treg. Será de interés para el uso STAT5a / b ratones doble KO [45, 46] a prueba de clima STAT5 es necesario para la expresión de FoxP3 y Treg generación.

Regulador CD4 + CD25 + células T han estado implicados en una serie de procesos patológicos, incluyendo elevación de los niveles de células Treg en ciertos tipos de cáncer [47 - 49] y las enfermedades infecciosas [17, 50 - 52], y la reducción de los niveles de Treg en enfermedades autoinmunes [9, 53 - 56]. Las terapias innovadoras basadas en la modulación de la actividad Treg tienen un gran potencial en el tratamiento de estas enfermedades y en la promoción de engraftment alogénico de trasplante de órganos. Elucidar cómo FoxP3 expresión es modulada durante el desarrollo de las células Treg natural en el timo será de gran importancia tanto para la comprensión del mecanismo de ontogénico de su desarrollo, y para arrojar luz sobre la manera de modular su generación y ampliación para su uso en aplicaciones terapéuticas.

Métodos
Ratones, FoxP3 antisuero de producción y análisis FACS

B6/Ly5.1 y B6/Ly5.2 ratones fueron comprados en el Laboratorio Jackson y TSLP-R-ratones deficientes fueron proporcionados por el doctor J. Ihle en St Jude Children's Research Hospital en Tennessee. Scurfy ratones (mutación de FoxP3 (FoxP3 sf) genes) fueron amablemente proporcionados por el doctor VL. Godfrey en la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill. Todos los animales fueron alojados en la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, tal como se describe [57]. El péptido de la N-terminal de FoxP3 murino (C-LLGTRGSGGPFQGRDLRSGAH) se eligió para inmunizar a los conejos para la producción de anticuerpos. Purificación de afinidad de los anticuerpos se realizó con un SulfoLink Kit (Biotechology Pierce, Rockford, IL). Los anticuerpos monoclonales para CD3, CD4, CD8 y CD25 α (Caltag Laboratories, Burlingame, CA), Annexin V-APC (BD Biosciences, Mountain View, CA) fueron usados para la tinción y la afinidad de los anticuerpos purificados FoxP3 tinción intracelular. Para el análisis de la proliferación, el total de timocitos de ratones adultos fueron etiquetados con CFSE (1,25 μ M) en HBSS / 5% de SFB, las células fueron lavadas dos veces, entonces cultivadas con o sin TSLP (100 ng / ml) durante 2 días antes de FACS análisis. Las células se analizaron en un flujo FACSCalibur ™ cytometer (BD Biosciences) como descried [58].

Transfección

El PG-mFoxp3 plásmido fue construido por PCR de mFoxp3 en la pHSPG vector [57]. 293T células fueron transfectadas con el vector vacío o ya sea PG-mFoxp3 utilizando el reactivo Effectene transfección (Qiagen, Valencia, CA).

Western blot

293T transfectadas con cualquiera de las dos celdas vacías o vector pHSPG-mFoxp3 fueron lisadas y resueltas en un 10% SDS-PAGE. Geles se transfirieron a membranas PVDF (Amersham Pharmacia, NJ), y determinada con tanto control, seguido con el anti-conejo-IgG-HRP y visualizados usando un kit de ECL (Amersham Pharmacia).

PCR en tiempo real

RNA y cDNA se había preparado con las células de cDNA kit (Ambion, Inc, Austin, Texas). Los niveles de mRNA FoxP3 y 18S se mide por TaqMan PCR en tiempo real utilizando los primers y ABI 7000 Sequence sistema de detección (Applied Biosystems Inc). FoxP3 se normalizaron los niveles de mRNA en relación con 18S. Todas las muestras se ejecute en los duplicados y repetidas en al menos tres experimentos independientes.

Inmunomarcación

Para tinción inmunohistoquímica, parafina de las secciones del timo incrustados órganos de los recién nacidos o adultos ratones fueron teñidas con el anticuerpo anti-FoxP3, de cabra anti-conejo biotina y el sistema Avidina-Biotina (ABC) Complejo (Vector, CA) y el sustrato DAB (Pierce , IL). Por immunoflurescence tinción de las células 293T, después de transfección con un vector de expresión de ambas FoxP3 y las buenas prácticas agrarias en coverslips, las células se tiñeron con la validez de suero inmune o suero anti-Foxp3, seguido de Rhodamine (TRITC)-conjugado de cabra anti-conejo IgG (H + L) (Jackson ImmunoReasearch Laboratories, INC PA). Por immunoflurescence tinción timo de los órganos, secciones congeladas fueron incubadas con el anticuerpo anti-FoxP3 seguido de cabra anti-IgG de conejo-Alexa Fluor 546 (Molecular Probes, CA), ratón-CD25 Alexa Fluor 488 y ratón CD4-Alexa Fluor 647 (Caltag , CA). Los núcleos se counterstained con DAPI. Las secciones se examinaron con un microscopio confocal LeicaSP2 (Leica, Bannockburn, IL).

E17 FTOC ensayos

Lóbulos del timo desde el día 17 embriones se cultivaron en las membranas en una interfaz entre el 5% CO 2 y aire humidificado mFTOC medios de comunicación (RPMI 1640 (BRL), el 10% de suero fetal bovino, 50 μ M 2-mercaptoetanol, 2 mM L-glutamina, No del 1% de aminoácidos (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 10 mM HEPES, 1 mM piruvato sódico solución (GIBCO BRL), 100 U / ml penicilina y 100 mg / ml estreptomicina). E17 timo órgano en el sistema de cultivo, los lóbulos se cultivaron con o sin ratón TSLP recombinante (R & D Systems, Minneapolis, MN) o monoclonales de ratón anti-rata TSLPR de anticuerpos (R & D Systems). Las células de los lóbulos del timo fueron cosechadas en distintos días y analizada por el flujo cytometer o PCR en tiempo real.

Recién nacidos, de adultos o de adultos timocitos cultura esplenocitos in vitro

Timocitos día 2 de ratones recién nacidos o de 2-3 meses de edad, los ratones adultos fueron cosechadas. Diferentes subpoblaciones de timocitos y adultos esplenocitos fueron ordenados en un Cytomation MoFlo FACS. Las células fueron cultivadas en medios de comunicación FTOC con o sin ratón TSLP recombinante (R & D Systems). Dos días después, las células fueron aisladas y analizadas por PCR o en un flujo FACSCalibur ™ cytometer.

Treg proliferación y la represión de ensayo

Thymus órganos de los recién nacidos o día 2 de adultos y el bazo de los ratones ratones adultos fueron cosechadas. Para aislar células Treg de timocitos, las células fueron teñidas con anti-CD4, anti-CD8 y los anticuerpos anti-CD25, CD4 + CD8 - CD25 + y CD4 + CD8 - CD25 - las células se ordenan en una Cytomation MoFlo máquina. CD90 - vehículos blindados fueron purificados en el autoMACS sistema usando CD90 microbeads (Miltenyi Biotec, Auburn). La proliferación y la represión de ensayo de las células Treg se realizó tal como se describe [59]. Purificado día 2 del recién nacido CD4 + CD8 - CD25 +, CD4 + CD8 - CD25 - células (7,5 × 10 3), o de adultos CD4 + CD25 + (7,5 × 10 3) Treg son cocultured con CD4 + 25 - células (1,5 × 10 4) y irradiados (2100 rad)-CD90 agotado esplenocitos (1,5 × 10 4) como vehículos blindados en presencia de ConA (5 μ g / ml). Las células se cocultured por 3 días, y con pulsos de 1 μ Ci 3 H-timidina 6 h antes de la cosecha.

Abreviaturas

Treg: las células T reguladoras;

FTOC: timo fetal órgano cultura;

TSLP: timo del estroma derivados lymphopoietin;

MTEC: medular de las células epiteliales del timo.

CMJ: cortical-medular de los cruces.

APC: células presentadoras de antígenos.

Contribuciones de los autores

Qi Jiang llevó a cabo el conjunto de estudios y redactado el manuscrito. Su Hua llevó a cabo la inmuno-tinción. Geoffrey Knudsen participó en el ensayo de la función Treg. Whitney Helms participó en la PCR en tiempo real estudio y realizó el análisis estadístico. Lishan Su concebido del estudio, y participaron en su diseño y la coordinación y la ayudó a redactar el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Agradecemos a los Dres. YJ. Liu, J. Serody, J. y J. Ting Frelinger para los debates; Mando de las Naciones Unidas y DLAM FACS instalaciones básicas para su ayuda de los animales los cuidados y análisis FACS; N. Siefers y VM Coffield para la purificación de los anticuerpos anti-FoxP3, y R. Hales de apoyo técnico. Los autores no tienen ningún conflicto de intereses financieros. Este estudio fue parcialmente apoyado por el Instituto Nacional de Salud subvenciones (AI48407, AI41356 y AI53804 a LS). WH fue parcialmente apoyado por una beca de formación NIH (T32AI007273).