Journal of Circadian Rhythms, 2006; 4: 3-3 (más artículos en esta revista)

Los efectos tóxicos de metoxicloro en el patrón secretorio de prolactina episódica: Posibles efectos mediada por la producción de óxido nítrico

BioMed Central
Anunciación Lafuente (lafuente@uvigo.es) [1], Teresa Cabaleiro (lafuente@uvigo.es) [1], Pilar Cano (pelayos@med.ucm.es) [2], Ana Esquifino I (pelayos@med.ucm . S) [2]
[1] Laboratorio de Toxicología, Facultad de Ciencias, Universidad de Vigo, Campus de Orense, Las Lagunas, 32004 Orense, Spain
[2] Departamento de Bioquímica y Biología Molecular III, Facultad de Medicina, Universidad Complutense, 28040 Madrid, Spain

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Resumen
Antecedentes

Este trabajo aborda la cuestión de si metoxicloro (MTX), la exposición puede modificar el ultradian la secreción de prolactina a través de cambios en la síntesis de óxido nítrico (NO) inducido por la N ω-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) en el hipotálamo Pituitaria-eje. Asociado cambios en la dopamina (DA) contenido en el anterior (AH), mediobasal (MBH) y el hipotálamo posterior (PH) y la eminencia media (ME) fueron evaluados.

Métodos

Dos grupos de animales (MTX y MTX + L-NAME tratadas) recibió subcutánea (sc), inyecciones de MTX a una dosis de 25 mg / kg / día durante un mes. Los otros dos grupos de animales (control y tratamiento de L-NAME) recibieron inyecciones sc vehículo (0,5 mL / día de aceite de sésamo), en el mismo período de tiempo para ser utilizados como controles. Cuarenta horas antes del día de la prueba, los animales fueron anaesthetized con intrapritoneal inyecciones de 2,5% en solución salina y tribromoethanol auricular cánulas que se implantó a través de la vena yugular externa. El plasma se extrae continuamente en Hamilton jeringas junto a una bomba peristáltica en tubos que contienen fosfato-gelatina de amortiguación (para aumentar la viscosidad). El plasma fue obtenido por decantación y mantenerse cada 7 minutos para la medición de los niveles plasmáticos de prolactina a través de una determinada concentración DA radioimmnunoassay y por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

Resultados

Liberación de prolactina en animales procedentes de todos los grupos experimentales se analizaron episódica. La media de los niveles plasmáticos de prolactina durante el período de sangrado, y la absoluta amplitud de pulso se incrementaron después de MTX o ω N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME) administración. Sin embargo MTX y L-NAME no modifica ningún otro parámetro estudiado con la excepción de relativa amplitud de pulso en las ratas tratadas con MTX. L-NAME administración a ratas tratadas con el plaguicida significa reducido los niveles plasmáticos de prolactina y de la absoluta amplitud de los picos de prolactina. Peak duración, la frecuencia y la amplitud relativa de los picos de prolactina no se modificaron en el grupo de ratas tratadas con MTX más L-NAME, en comparación con MTX o bien el control de las ratas tratadas. Considerando que disminuyó DA MTX contenido en el ME y el aumento en el AH, su contenido no se modificó en la MBH o PH, en comparación con los valores encontrados en los controles. Además, la administración de L-NAME redujo DA contenido en el ME, en comparación con los controles. Sin embargo, la administración de L-NAME MTX expuestos a las ratas, aumentó notablemente en el contenido DA ME, ya sea en comparación con MTX o control de las ratas tratadas. L-DA NOMBRE aumento de la administración de contenido en el AH en comparación con los valores encontrados en las ratas no tratadas. Sin embargo la administración de L-NAME a las ratas expuestas MTX no modificó DA contenido, en comparación con MTX, ya sea tratada o control de las ratas. L-NAME no modificó la administración de contenido en la DA MBH ni en el tratamiento ni en solución salina ratas tratadas con MTX. Sin embargo, los valores de la DA en el MBH en MTX más L-NAME los animales tratados fueron estadísticamente disminuido en comparación con L-NAME ratas tratadas. En el PH, L-DA NOMBRE aumento de la administración de contenido, en comparación con los valores encontrados en los animales no tratados. L-NAME administración MTX expuestos a las ratas también aumentó DA contenido, en comparación con MTX, ya sea tratada o control de las ratas.

Conclusión

Los resultados sugieren la existencia de una interacción entre MTX y L-NAME en la modulación de la ultradian la secreción de prolactina en la hipófisis. La posibilidad de un efecto indirecto mediado por cambios en el contenido de DA en la ME requiere un examen más detenido.

Introducción

Metoxicloro (MTX) es un plaguicida y de su denominación química es 1,1,1-tricloro-2 ,2-bis (p-metoxi fenil) etano. Al principio fue sintetizada en 1893, y su producción comercial en Estados Unidos comenzó en 1946. Este insecticidas organoclorados se encontró en 1,2% de muestras de alimentos en ese país, lo que representa un consumo de 0,1 a 0,8 μ g MTX / día durante 16 a 19 años de edad, las personas [1].

Se ha demostrado que el MTX afecta a la función reproductiva [2 - 10]. Estos efectos están relacionados con sus propiedades estrogénicos [11 - 14], si bien se informó de los datos controvertidos [15]. El papel de MTX sobre la secreción de prolactina también es controvertida: aunque prolactina pituitaria contenido y su liberación in vitro fueron elevados, las diferencias en los valores circulantes de la hormona (único determinaciones), en comparación con los animales control no fueron estadísticamente significativos [4].

El óxido nítrico (NO) ha sido implicado en la regulación de la liberación de varios hipotalámico moléculas que participan en la secreción de la hormona pituitaria (por ejemplo, aminas biógenas, aminoácidos, la liberación de la hormona luteinizante-hormona (LHRH), y el péptido vasoactivo intestinal) [16 -- 23]. NO efectos sobre la secreción de prolactina son, en cierta medida, polémica. De hecho, el NO inhibe la secreción de prolactina hemipituitary culturas [24]. Bloqueo de la síntesis de NO por parte de la administración de ω N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), inhibe el pico preovulatorio de prolactina [25] o atenúa el efecto inhibidor de la dopamina sobre la secreción de prolactina [23, 26]. Por otra parte, el NO estimula o inhibe la secreción de prolactina de acuerdo con los niveles de estrógeno en plasma [27]. Todos los estudios se realizaron en el llamado condiciones basales, a pesar de la prolactina, al igual que otras hormonas de la pituitaria, se secreta a raíz de un patrón ultradian episódica [28, 29].

Anterior trabajo de nuestro laboratorio ha demostrado que la secreción de prolactina basal [30], así como su patrón secretorio ultradian, se cambia por la exposición MTX [31, 32]. Sin embargo, no hemos de determinar si MTX ultradian efectos en el patrón secretorio de la secreción de prolactina están mediados por la producción de NO. El objetivo del presente estudio fue determinar si la exposición MTX ultradian modifica la secreción de prolactina a través de cambios en el NO. Asociado cambios en la dopamina (DA) contenido en el anterior (AH), mediobasal (MBH) y el hipotálamo posterior (HP) y la eminencia media (ME) fueron evaluados.

Materiales y métodos
Reactivos

Metoxicloro [MTX: 1,1,1-tricloro-2 ,2-bis (p-metoxi fenil) etano], ω N-nitro-L-arginina metil éster (L-NAME), cloruro de sodio, y se compraron de tribromoethanol Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, EE.UU.). La heparina se adquirió de la órbita terrestre baja (Barcelona, España).

Animales

Adulto de sexo masculino ratas Sprague-Dawley, 300-320 g de peso al comienzo del experimento se utilizaron. Ellos se mantuvieron con ratas chow y el agua disponible ad libitum en una habitación bajo control fotoperíodo (14 h light/10 h oscuridad; luces de 07,00 a 21,00 h) y temperatura (22 ± 2 ° C).

Cuatro grupos de 8 animales se utilizaron. Dos grupos de los animales (MTX y MTX + L-NAME grupos) recibió subcutánea (sc), inyecciones de MTX a una dosis de 25 mg / kg / día durante un mes. MTX fue disuelto en aceite de sésamo en una concentración de 17,5 mg / mL. Los otros dos grupos de animales (control y tratamiento de L-NAME) recibieron inyecciones sc vehículo (0,5 mL / día de aceite de sésamo), en el mismo período de tiempo, para ser utilizadas como controles.

Cánula implantación

Cuarenta horas antes del inicio de la recogida de datos, los animales fueron anaesthetized con inyección intraperitoneal de 2,5% en tribromoethanol salina (1 mL/100 g de peso corporal) y auricular cánulas que se implantó a través de la vena yugular externa con arreglo a los procedimientos utilizados en los estudios anteriores [28, 29]. Esto permite a los animales a moverse libremente en sus jaulas durante el período de sangrado.

Diseño experimental y toma de muestras de sangre

En el día de la reunión de datos, consciente y libremente en movimiento ratas de cada grupo fueron continuamente infundido con 0,9% (0,5 ml / h) durante 4 h, a partir de las 09,30 h. Los animales y el control de ambos grupos fueron MTX por vía intraperitoneal (ip) inyectados con solución salina 1 h antes del comienzo del período de sangrado. Ratas de ambos L-NAME y MTX + L-NAME grupos fueron inyectados ip con L-NAME, un inhibidor de la sintetasa del NO, a una dosis de 10 mg / kg en solución salina, 60 minutos antes del comienzo del período de sangrado. La dosis y el momento de administración de L-NAME fueron seleccionados de acuerdo a los anteriores datos de la literatura [33, 23, 25]. Una hora después del inicio de la infusión intravenosa de solución salina, y 15 minutos después de la administración de 300 UI de heparina, las ratas fueron desangrado continuamente a través de una bomba peristáltica con un caudal de 50 μ l cada 7 min. Se tomaron muestras de sangre de Hamilton microlitro jeringas cada 7 min durante 3 h, de 10,30 h a 13,30 h. Las muestras se colectaron en tubos de ensayo y se mantuvieron en hielo que contenía buffer fosfato (0,01 mol / L), con el 0,1% de gelatina para aumentar la viscosidad sanguínea. El plasma fue obtenido por decantación (26 muestras por cada rata) después de la centrifugación (15 min a 3000 rpm). Hematócritos se mantuvo estable después de esta hemorragia de protocolo.

Los estudios fueron realizados de acuerdo con los principios y los procedimientos establecidos en la Guía del NIH para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio.

Prolactina mediciones

Los niveles de prolactina, en todas las series de cada rata, se determinó a través de un doble anticuerpo radioinmunoensayo. Los reactivos fueron amablemente proporcionados por la Dirección Nacional del Programa de Hormonas y hipofisarias (NHPP, Rockville, MD, EE.UU.). Prolactina valores se expresaron en términos de NIADD rata PRL-RP3 referencia preparación. La sensibilidad del ensayo fue de 5 pg / tubo. Para analizar la variabilidad del ensayo, la serie de plasma de 10 repeticiones a las 4 diferentes concentraciones de prolactina en la curva estándar se ejecute. Coeficientes de variación fueron del 8,6, 6,4, 5,7 o 4,7% del 1,5, 6,25, 12, 25 o 25 ng / ml en la curva estándar, respectivamente. Las muestras fueron analizadas en el mismo ensayo para evitar variaciones inter-ensayo. Este ensayo se utiliza rutinariamente en nuestro laboratorio [28, 29, 31, 32].

Análisis de Datos

Para identificar y caracterizar prolactina legumbres, un programa de ordenador (Ultra-análisis), descrita por Van Cauter [34] y revisado por Richard [35], se utilizó. En este programa, el pulso se definió como un incremento superior a un múltiplo de la dosis ajustadas por el coeficiente de variación (CV), seguido de un descenso significativo. El intraassay CV se calculó a partir de los valores de 4 diferentes concentraciones de prolactina (en el nivel de 1,2, 6,25, 12 y 25 ng / mL) en su curva estándar. Así, el CV y la media del nivel de la hormona fueron determinados para todos los valores de hormona de la que formaban parte las fases ascendente y descendente de cada pulso factible. El pulso se definió cuando este CV es triple que la de la CV intra-ensayo determinado comparable a los niveles de prolactina media. A la especificidad de la prueba de detección del pulso, una serie de 26 muestras procedentes de una reserva de suero se analizó utilizando un umbral del 3 CV de prolactina legumbres. Amplia utilización de los estudios de simulación por ordenador generado serie indicó que, para la serie que tienen grandes y frecuentes pulsos, umbral del 3 CV minimizado tanto falsos positivos y negativos errores [36].

El patrón pulsátil de la secreción de prolactina se caracteriza por la determinación de la media de los niveles de la hormona, la absoluta y relativa amplitudes de los picos de prolactina, su frecuencia y la duración de pulso. El programa también calcula la media de vida media de la hormona. El pulso de amplitud absoluta se define como la diferencia entre el nivel de hormonas en el máximo del pico y el nivel de hormona en el anterior nadir. La relativa amplitud del pulso se calcula como el cociente entre la amplitud del pulso y absoluta nadir valor anterior. Pulso frecuencia se define como el número de pulsos observados durante el período de sangrado. Duración de pulso fue el tiempo transcurrido entre el comienzo de la fase ascendente de la cima y el final de la fase descendente del pico. La media del nivel de la hormona se calculó la media de todas las muestras recogidas de cada rata durante el período de 3 horas, y el promedio para el grupo experimental de los distintos medios. La vida media de la hormona es calculado por la tangente de la fase descendente del pico.

Dopamina medición

El hipotálamo y ME fueron disecados a cabo con rapidez, tal como se describe anteriormente [46]. El AH, MBH, PH y ME fueron disecados inmediatamente y homogeneizada en refrigeradas (0-1 º C) 2 M de ácido acético. Después de la centrifugación (a 15000 rpm durante 30 min, a 4 ° C), los sobrenadantes fueron analizados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), con detección electroquímica (Coulochem, 5100A, la ESA, EE.UU.). A C-18 columna de fase inversa, eluye con una fase móvil (pH = 4 y 0,1 M de acetato de sodio, ácido cítrico 0,1 M, 0,7 mM de sodio octylsulphate y 0,57 mM EDTA que contiene 10% de metanol, v / v), entre otros. Caudal fue de 1 mL / min, a una presión de 2200 psi. Fijo en contra de los potenciales de H 2 / H + electrodo de referencia fueron los siguientes: acondicionado electrodo -0,4 V; antes de la oxidación de electrodos +0,10 V; electrodo de trabajo +0,35 V. dopamina concentración se calcula a partir de las áreas de los picos cromatográficos utilizando normas externas. La linealidad de la respuesta de los detectores de dopamina se puso a prueba la concentración dentro de rangos encontrados en sobrenadante de hipotálamo mediobasal [37].

Estadísticas

Los resultados de los parámetros medidos en este estudio se les realizó pruebas de homogeneidad de varianza mediante la prueba de Snedecor (Snedecor, 1989). Cuando los resultados no tienen una homogeneidad de varianza, se compararon a través de una prueba de Mann-Whitney. Si la diferencia es homogénea, la prueba t de Student o el análisis de la varianza (ANOVA) fue aplicado. Los resultados se consideraron significativos en P ≤ 0,05. Todos los valores representan la media ± SEM Estudiar el MTX y L-NAME efectos sobre los parámetros que caracterizan a la episódica en la secreción de prolactina y la concentración de dopamina, la comparación de valores fue hecho por un solo sentido el análisis de la varianza (ANOVA). Por último, para probar la existencia de una interacción entre la TRH y MTX, dos formas de análisis de la varianza (ANOVA) fue aplicado.

Resultados

Liberación de prolactina en animales de los cuatro grupos experimentales analizadas fue episódica, y un representante perfil de un animal de cada grupo experimental se muestra en la Figura 1. Como es típico en las ratas macho, el ritmo circadiano de la prolactina muestra un gran pulso en las primeras horas de la mañana [31]. Por lo tanto, muestra los valores obtenidos durante los últimos 2 horas y 25 min retirada de la sangre se utilizan para los episodios de perfil patrón de la liberación de prolactina.

La media de los niveles plasmáticos de prolactina durante el período de sangrado y de la absoluta amplitud de pulso se incrementaron después de la administración MTX (Tabla 1; P ≤ 0,05 y P ≤ 0,001 vs grupo control, respectivamente). Además, la relativa amplitud de pulso disminuido en ratas tratadas con MTX, en comparación con los valores encontrados en el grupo control (Tabla 1; P ≤ 0,01). Sin embargo, la frecuencia y la duración de los picos de prolactina y la vida media de la hormona no fueron modificados por el tratamiento con los plaguicidas (Tabla 1]. L-NAME significa aumento de los niveles plasmáticos de prolactina durante el período de sangrado y de la absoluta amplitud de los picos de prolactina, en comparación con los controles (Tabla 1; P ≤ 0,01 y P ≤ 0,05, respectivamente). No obstante, la L-NAME no modifica ningún otro parámetro estudiado para evaluar pulsatility prolactina (Tabla 1]. L-NAME administración a ratas tratadas con el plaguicida significa reducido los niveles plasmáticos de prolactina y de la absoluta amplitud de los picos de prolactina (Tabla 1]. Peak duración, la amplitud y la frecuencia relativa de los picos de prolactina no se cambio en el grupo de ratas tratadas con MTX más L-NAME, en comparación con MTX o bien el control de las ratas tratadas. Sin embargo, hubo un aumento en el promedio de vida media de la hormona y una disminución absoluta en los picos de amplitud de prolactina en comparación con el grupo tratado con MTX (P ≤ 0,05). También hubo una reducción en la relativa amplitud de los picos de prolactina en comparación con los valores observados en el control de ratas (Tabla 1; P ≤ 0,01).

Considerando que disminuyó DA MTX contenido en el ME y en el aumento de la AH (Figura 2; P ≤ 0,01 vs grupo control), su contenido no se modificó en la MBH o PH, en comparación con los valores encontrados en el grupo control (Figura 2].

L-NAME administración disminuyó DA contenido en el ME (P ≤ 0,01) en comparación con los valores encontrados en los controles (Figura 2]. Sin embargo, la administración de L-NAME a las ratas expuestas MTX aumentado DA contenido, en comparación con MTX, ya sea tratada o control de las ratas (P ≤ 0,001 para cualquier comparación, la Figura 2].

En el AH, L-DA NOMBRE aumento de la administración de contenido (P ≤ 0,05) en comparación con los valores encontrados en las ratas no tratadas, pero en MTX-ratas expuestas este inhibidor enzimático no modificó DA contenido, en comparación con MTX o bien tratados o control Ratas (Figura 2].

L-NAME no modificó la administración de contenido en la DA MBH ni en el tratamiento ni en solución salina ratas tratadas con MTX. Sin embargo, los valores de la DA en MTX más L-NAME los animales tratados fueron estadísticamente disminuido en comparación con L-NAME ratas tratadas (P ≤ 0,01, Figura 2].

En el PH, L-DA NOMBRE aumento de la administración de contenido (P ≤ 0,05, Figura 2], en comparación con los valores encontrados en los animales no tratados. Además, en ratas expuestas MTX también el aumento de este producto químico DA contenido, en comparación con MTX, ya sea tratada o control de las ratas (P ≤ 0,05 y P ≤ 0,001, respectivamente, figura 2].

Hubo una interacción estadísticamente significativa entre MTX y L-NAME sobre la media de los niveles séricos de prolactina (F = 4,46, P ≤ 0,05), de amplitud de pulso absoluta (F = 14,58; P ≤ 0,01), la vida media de la hormona (F = 7,85; P ≤ 0,01), y la concentración de DA en el ME (F = 219,96; P ≤ 0.001).

Discusión

Los resultados de este estudio sugieren la existencia de una interacción entre el L-NAME y MTX ultradian para regular el patrón secretorio de la prolactina. Los cambios asociados en la eminencia media de DA contenido puede explicar los cambios en la secreción de prolactina mediada por MTX y L-NAME.

La disminución observada en los niveles séricos de prolactina entre 10,30 y 11,30 en el grupo control, puede ser debido a la existencia de variaciones circadiano de la hormona anteriormente descrito [38], y, de acuerdo con trabajos previos de nuestro grupo [31, 37, 39].

Ambos MTX y L-NAME ultradian administración modificó el patrón secretorio de la prolactina que muestra el aumento de los niveles promedio de la hormona de sangrado durante el período. Estos resultados se explican por el aumento de prolactina absoluta amplitud de los picos encontrados en este estudio con MTX y L-NAME tratamientos. Sin embargo, después de MTX tratamiento, nuestros datos no está de acuerdo con los resultados obtenidos por Goldman [4], que no encontraron cambios significativos en los niveles circulantes de la hormona, aunque el contenido de prolactina en la pituitaria aumentado. Las diferencias pueden deberse a la duración del tratamiento MTX (2 meses en el trabajo de Goldman vs 1 mes en nuestro estudio), método de dosificación (oral en el trabajo de Goldman vs subcutánea en nuestro estudio), la edad de los animales al inicio de la exposición a plaguicidas (21 días en el trabajo de Goldman frente a la edad adulta en nuestro estudio), o la temporada en la que se realizó el experimento [40]. Además, nuestros resultados actuales difieran de trabajos anteriores en la literatura, en caso contrario [41], o si no se observaron efectos después de la administración de L-NAME [19, 20, 33, 42] cuando se analizaron en un único punto de ensayo. La discrepancia puede atribuirse a las diferencias en los enfoques experimentales utilizados en cada estudio: la vía de administración de L-NAME, en la dosis de L-NAME utilizados, o la hora del día en el que el experimento se llevó a cabo. Sin embargo, nuestros datos obtenidos en la L-NAME de los animales tratados confirma y amplía anteriores estudios que describen el efecto inhibidor de NO sobre la secreción de prolactina, tanto in vivo e in vitro [43, 19, 24, 16, 44, 43]. Un efecto directo del NO en la pituitaria nivel debe considerarse a la luz de estudios anteriores [24], a pesar de un efecto indirecto en el hipotálamo o en el cambio de nivel ME DA síntesis no puede ser descartado.

Los datos obtenidos después de MTX y L-NAME administración indicar la existencia de una interacción entre los plaguicidas y NO para modular la secreción de prolactina. El aumento de AH DA contenido junto con la disminución de este neurotransmisor en el ME DA menos sugiere que se ha liberado del AH a la ME. Estos cambios pueden explicar los cambios observados en la secreción de prolactina en este estudio, como es la DA principal neuromodulador inhibidor de la secreción de prolactina [45, 46]. Las variaciones en el AH también puede ser debido a un efecto directo de la hormona en el hipotálamo para regular su propia secreción, como se ha sugerido anteriormente [47]. Por otra parte, la administración de L-NAME indujo efectos diferentes sobre hipotálamo y ME dopamina contenido. La interacción entre el NO y la dopamina ha sido previamente demostrada por Yen y Pan [23]. Los cambios en el contenido de DA en la eminencia media, inducida por la L-NAME, puede dar cuenta de las modificaciones observadas en los niveles promedio de prolactina, teniendo en cuenta que la cantidad de DA en libertad a la hipófisis está directamente relacionada con su concentración en el ME [48] Y que esta amina es el principal inhibidor de entrada de la secreción de prolactina [49]. Sin embargo, otros neuroimmunomodulators no monitoredin nuestro estudio también podría ser cambiado por modificaciones en la producción de NO [19, 20, 24, 33, 44].

Cuando MTX y L-NAME se administraron conjuntamente, los valores medios de la hormona no varían en comparación con el grupo control. Esto puede explicarse por un efecto directo sobre la hipófisis induciendo la reducción de la absoluta amplitud de los picos de prolactina. Además, un efecto indirecto mediado por las variaciones observadas en ME DA contenido puede ser considerada.

Los cambios en el contenido DA observado en el PH indican que MTX y L-NAME no interactúan para cambiar esta amina en esta área hipotalámica. Curiosamente sólo L-NAME parece ser eficaz para modificar DA hipotálamo en esta región, como MTX por sí sola no era capaz de cambiar el contenido de este neurotransmisor. Estas modificaciones pueden estar asociados con cambios en la actividad del sistema nervioso autónomo, un efecto descrito anteriormente en otras regiones del sistema nervioso autónomo [50].

En resumen los resultados obtenidos en este trabajo indican la existencia de interacciones entre MTX y L-NAME en la pituitaria para regular el nivel ultradian patrón secretorio de la prolactina. La posibilidad de un efecto indirecto mediado por cambios en el contenido de DA en la ME requiere un examen más detenido.

Conflicto de intereses

El autor (s) declaran que no tienen interés en competencia.

Contribuciones de los autores

AL AIE y los experimentos diseñados. AL PC y llevó a cabo el radioinmunoensayo para la prolactina y el análisis de la dopamina por HPLC. AL TC y realizó el análisis estadístico. CT se hicieron cargo de los animales de experimentación. AL AIE y supervisó el estudio y redactó el manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por becas de la Universidad de Vigo (Uvigo, TL1/1999).