Journal of Circadian Rhythms, 2006; 4: 4-4 (más artículos en esta revista)

Apareamiento ritmos de Drosophila: rescate de tim 01 mutantes por D. Ananassae atemporal

BioMed Central
Izumi Nishinokubi (i-nishinokubi@aist.go.jp) [1], Masami Shimoda (shimoda1@affrc.go.jp) [2], Norio Ishida (n.ishida @ aist.go.jp) [1]
[1] Clock Cell Biology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Institute of Molecular and Cell Biology, Tsukuba 305-8566, Japan
[2] National Institute of Agrobiological Sciences, Tsukuba 305-8634, Japan
[3] Institute of Applied Biochemistry, University of Tsukuba, Tsukuba 305-8576, Japan

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Resumen
Antecedentes

Se ha informado de que los ritmos circadianos de actividad femenina de apareamiento entre las diferentes especies de Drosophila y están controlados por un reloj circadiano endógeno. En este sentido, consideró que el ritmo de apareamiento D. Ananassae difiere de la de D. Melanogaster. Por otra parte, para evaluar el efecto de los productos de genes reloj en actividades de apareamiento, hemos examinado la actividad de apareamiento D. Melanogaster atemporal (tim 01) transgénicos que alberga la mosca de calor-shock promotor impulsado D. - Ananassae atemporal (tim) gen (hs-AT tim 01).

Métodos

Las moscas fueron mantenidos bajo luz / oscuridad (LD) ciclos durante varios días y luego fueron trasladados a la constante oscuridad (DD) en condiciones de 25 º C. Transformantes moscas se conmovió al calor durante 30 min (PZT 10.5-11.0 o PZT 22.5-23.0; PZT medios proyectados Zeitgeber el tiempo) a 37 ° C cada día. Daily expresiones del D. Ananassae TIMELESS (TIM) de proteínas transgénicas en las moscas se mide por el Western Blot. Para examinar si el calendario de D. Ananassae TIM inducción de proteínas de choque por calor pueden cambiar los patrones de comportamiento de las actividades de D. Melanogaster tim 01 moscas, que mide la actividad locomotriz y apareamiento ritmos bajo DD a 25 ° C ± 0,5 ° C, salvo cuando se aplica calor.

Resultados

Heat shock aplicada en PZT 10.5-11.0 y 22.5-23.0 inducida en PZT TIM niveles altos durante la noche y el día subjetivo, respectivamente, en hs-AT tim 01 moscas. El ritmo locomotor de estas moscas se cambió de diurna a nocturna por el calendario de D. Ananassae TIM inducción. Sin embargo, el ritmo de apareamiento de estas moscas no podía ser arrastrado por el calendario de D. Ananassae TIM inducción.

Conclusión

El patrón de los ritmos de actividad de apareamiento D. Y de D. ananassae Melanogaster diferentes. Los ritmos de actividad de apareamiento D. Melanogaster tim moscas albergar 01 hs-AT tim apareció después de calor-shock, pero el patrón y la fase difieren de las de tipo salvaje D. Y D. ananassae Melanogaster. Además, el ritmo de apareamiento de estas moscas no podía ser arrastrado por el calendario de D. Ananassae TIM inducción aunque el ritmo de locomotora hs-AT tim 01 se cambió de diurno a nocturno de acuerdo con el calendario de D. Ananassae TIM inducción. Estos datos sugieren que las especies específicas de las actividades de apareamiento requieren diferentes vías de salida de los responsables de los ritmos del aparato locomotor.

Introducción

Los comportamientos de la mayoría de los organismos están sujetos a los ritmos que son controlados por un reloj circadiano endógeno [1]. Reloj genes incluidos período (por), sin tiempo (tim), reloj (clk) y ciclo (cyc) y sus productos constituyen la base del mecanismo circadiano. La receptividad sexual y reproductiva, el comportamiento de los insectos, por ejemplo, la canción de cortejo, apareamiento y ovipositor actividades, están relacionados con los mecanismos circadianos [2 - 6]. La locomotora actividades de las hormigas reina virgen son rítmicos mientras que las de convertirse en reinas acoplado arrítmico cuando se debe de comer, pero ritmicidad es restaurado después de que los huevos son depositados [7]. Reloj genes de la mosca del melón puede causar aislamiento reproductivo a través de un cambio en la época de apareamiento [8].

Los ritmos de Drosophila apareamiento comportamientos están controlados por el reloj circadiano y los genes son especialmente atribuidos a la hembra de reloj [2]. Mujeres ritmo circadiano en la actividad de apareamiento es también específico de la especie, y esto podría constituir una fuente de la aislamiento reproductivo que permite Drosophila simpátricas para evitar la hibridación. La conducta de apareamiento de los ritmos D. Y D. melanogaster Simulans son diferentes y en antiphase [2].

También informó de que el tim producto génico es altamente conservadas entre D. Y D. melanogaster Ananassae. CDNA de Tim D. Ananassae arrítmico podría rescatar a la actividad locomotora de la D. Melanogaster eterno mutante nulo (tim 0) [9].

El presente estudio examina si el apareamiento ritmo de la actividad D. Melanogaster tim 01 mutantes también puede ser rescatada por la introducción de D. Ananassae Tim gen. También determina si el ritmo de actividad de apareamiento de las moscas transgénicas portadoras del gen de tim otra especie se ve afectada por locomotor ritmos intrínsecos de las especies originales.

Materiales y métodos
Animales

Las moscas crecido en glucosa-melaza-levadura de la harina de maíz se mantuvieron a 25 ± 0,5 ° C en virtud de un ciclo de LD con luces a las 09:00 y de luces apagadas a las 21:00. Transformantes moscas desempeño D. Ananassae tim cDNA se generaron utilizando P-elemento mediada por los métodos descritos por Nishinokubi et al. [9].

Ensayos de actividad de apareamiento

Vírgenes de mujeres y hombres mantienen las moscas como se ha descrito anteriormente durante 7 días después de la eclosión fueron trasladados a DD condiciones durante 2 días a 25 ° C. Transformantes moscas se conmovió al calor durante 30 min (PZT 10.5-11.0 o PZT 22.5-23.0; PZT medios proyectados Zeitgeber el tiempo) a 37 ° C cada día. A continuación, se analizó la frecuencia de apareamiento, de 9 días de edad, las moscas adultas que se permite a los mate durante 20 min, tal como se describe por Sakai et al. [2, 10]. En cada experimento, las moscas machos se cruzaron con las moscas hembra de la misma genotipo.

Locomotor ensayos

Tenemos un seguimiento de los movimientos de las moscas que fueron alojados individualmente con el medio, utilizando sensores infrarrojos y un seguimiento de la actividad Drosophila (Trikinetics Inc, Waltham, MA) en incubadora bajo DD a 25 ° C ± 0,5 ° C, excepto cuando se aplicó choque térmico ( 30 min; PZT 10.5-11.0 o PZT 22.5-23.0 a 37 ° C al día). Las señales de los sensores se resume cada 30 minutos usando una computadora.

Western Blot

Las moscas fueron arrastrado a 25 ° C ± 0,5 º C en LD luego fue trasladado a DD de 2 días. Fly se recogieron los jefes de hielo seco cada 2 h (moscas a la que se aplicó choque térmico en PZT 10,5-11,0) o 3 h (moscas a la que se aplicó choque térmico en PZT 22,5-23,0) y occidental borró descrita por Nishinokubi et al . [9].

Resultados

En nuestro informe anterior [9], D. Ananassae TIM funcional de la proteína fue un reloj en el componente D. Melanogaster tim 01 moscas cuando el calendario de TIM inducción se imitaron a su forma natural de D. Melanogaster. En este estudio, hemos examinado si el calendario de D. Ananassae TIM inducción de proteínas de choque por calor podría cambiar de diurnally activa a nocturnally activo ritmo de la locomotora de D. Melanogaster Tim 01 moscas. Heat shock inicialmente TIM aumento de los niveles de proteína que disminuyó después. Heat shock aplicada en PZT 10.5-11.0 y 22.5-23.0 inducida en PZT TIM niveles altos durante la noche y el día subjetivo, respectivamente (Fig. 1A y 1B]. Se compararon los ritmos de actividad locomotora transgénicos tim 01 moscas desempeño D. Ananassae tim cDNA aplicación de choque térmico en diferentes momentos del día. Las moscas de calor arrítmico conmocionado por 30 min a PZT 10.5-11.0 bajo DD convirtió rítmica y se trasladó durante subjetiva día ([9], Fig. 1C]. Por otra parte, las moscas que fueron conmovidos por el calor PZT 22.5-23.0 convirtió en activo durante la noche subjetiva (Fig. 1D]. Estos hallazgos demuestran que el comportamiento locomotor de D. Melanogaster tim moscas albergar 01 hs-D. Ananassae tim convirtió nocturnally activa de la época de D. Ananassae TIM inducción.

El apareamiento de las actividades D. Melanogaster reloj circadiano mutantes son arrítmico, lo que indica que los genes del reloj circadiano controlar el ritmo de la actividad de apareamiento [2]. Para entender el ritmo de apareamiento D. Ananassae, primero determina la frecuencia de apareamiento en diferentes momentos del día. Curiosamente, el ritmo de apareamiento D. Ananassae bajo DD difieren de los ritmos de apareamiento D. Y D. melanogaster Simulans (Fig. 2A y [2]]. La mayor parte de D. Ananassae moscas subjetiva acoplada durante días y no durante la noche subjetiva (Figura 2A].

Luego mide la actividad de apareamiento en el tim 01 moscas transgénicas desempeño D. Ananassae tim cDNA para determinar si la actividad de apareamiento también pueden ser rescatados y si está relacionado con los niveles del gen circadiano producto TIM. El TIM silvestre en los niveles de proteína de tipo D. Ananassae moscas fueron inicialmente más alta durante la noche que durante subjetivo subjetivo día, al igual que las de D. Melanogaster (datos no presentados). Por lo tanto, estamos expuestos D. Melanogaster tim moscas albergar 01 hs-D. Ananassae tim de choque térmico en PZT 10.5-11.0 y mide su actividad de apareamiento. La actividad de apareamiento de calor conmocionado transgénicos tim 01 moscas y rítmica fue superior durante la noche que durante subjetivo subjetivo día (Fig. 2B]. Cuando las moscas transgénicas fueron conmovidos por el calor PZT 22.5-23.0, un bi-phasic patrón de apareamiento en torno a la actividad parecía PZT 12 (Fig. 2C]. Estos perfiles de apareamiento ritmo de actividad de calor conmocionado transgénicos tim 01 moscas diferentes de ambos D. Ananassae y el fondo D. Melanogaster (Figura 2A]. Estos datos indicaron que TIM no es suficiente para la generación de especies específicas de apareamiento ritmo y sugirió que el apareamiento específico de la especie requieren ritmos distintos factores o más vías que las necesarias para la actividad locomotora ritmo (Fig. 3].

Para investigar el efecto de choque de calor en el ritmo de actividad de apareamiento, que mide el ritmo de actividad de apareamiento D. Melanogaster moscas silvestres de tipo bajo condiciones de choque térmico. Incluso si las moscas fueron conmovidos por el calor PZT 10.5-11.0, el perfil de apareamiento ritmo de actividad de estas moscas no fue significativamente diferente de la de tipo salvaje, aunque las tasas de apareamiento de tipo silvestre bajo condiciones de choque térmico aumentó ligeramente (Figs. 2A y 2D]. Este resultado indica que el choque de calor en sí no afectan de manera significativa a los perfiles de la actividad de apareamiento ritmo.

Discusión

Hemos informado anteriormente de que la actividad de apareamiento y de la actividad locomotora D. Melanogaster tim 01 moscas mutantes son arrítmico [2]. El presente estudio mostró que D. Melanogaster tim 01 moscas albergar D. Ananassae tim cDNA había apareamiento actividad ritmos, pero el perfil difiere de las dos D. Y D. melanogaster Ananassae. Estos ritmos no son bimodales como se observa en D. Melanogaster y sus picos fueron en gran retraso en relación con D. Ananassae (Fig. 2A-C]. El reloj circadiano de genes, período, desempeña un papel en el apareamiento ritmos de las moscas [6]. El apareamiento pico de la D. Pseudoobscura transformantes que expresa la línea D. Pseudoobscura por fusionados a la D. Melanogaster por promotor fue más tarde que la de D. Pseudoobscura [6]. Estos resultados apoyaron la idea de que el período de genes desempeña un papel temporal en aislamiento reproductivo entre las poblaciones de especies estrechamente relacionadas [6] o dentro de una especie [8], de modificación del calendario de conducta de apareamiento. Los datos actuales tim sugirió que también podría ser un gen putativo especiación como período. Nuestro informe anterior mostró que la homología de proteínas TIM longitud completa con D. Y D. ananassae Melanogaster fue 85,9%. En particular, la interacción PER dominios y NLS eran muy conservadas (PER interacción de dominio-1; 96,0%, la interacción de dominio PER-2; 95,0%, NLS; 100%) [9]. Otras regiones con menor homología con D. TIM melanogaster (por ejemplo, la EPC; 70,8%) puede ser importante para la creación de cada especie, los ritmos de comportamiento de apareamiento, como el ritmo de actividad.

Nuestros datos muestran que conmocionó calor de tipo salvaje y las moscas mate (Fig. 2D]. El aumento de la temperatura puede aumentar la volatilidad de los factores de apareamiento gaseosos (feromonas) y, por tanto, aumentar la actividad de apareamiento.

Hombre cortejo canciones difieren entre Drosophila y especies simpátricas contribuir a la especiación [11]. Mujeres discriminar D. Ananassae especies y de su hermano, D. Pallidosa, de acuerdo con el cortejo masculino canciones, y el loci de aislamiento sexual parecen cerca de la ruta de Delta locus cromosómico de la segunda [12]. D. Y D. melanogaster Simulans son especies simpátricas hermano y que no han sido aislados, por ubicación geográfica. Sin embargo, su conducta de apareamiento en los ritmos son antiphase. Durante frecuente D. Melanogaster apareamiento, la actividad de D. Simulans apareamiento es menor, pero la actividad es mayor cuando D. Melanogaster compañeros con poca frecuencia [2]. El ritmo de la conducta de apareamiento D. Ananassae es único entre los de la D. Melanogaster y otras especies (Fig. 2A, [2, 6]]. Nuestros datos apoyan la noción de que la especie, el calendario de conducta de apareamiento (incluidas las diferencias en el cortejo masculino canciones) juega un papel en el aislamiento reproductivo de especies simpátricas.

El presente estudio demostró que el ritmo de actividad locomotora tim transformantes moscas desempeño D. Ananassae tim cDNA puede ser arrastrado por el calendario de aplicación de choque térmico (Figs. 1A-1D]. El nivel de actividad locomotora D. Melanogaster es mayor durante el día subjetivo, y el TIM nivel subjetivo es mayor durante la noche [13]. Nuestro transformantes moscas se activa de manera similar durante subjetiva día en que se aplicó por calor durante la noche subjetiva (Figs. 1A y 1C]. Por el contrario, cuando las moscas se conmovió al calor para aumentar los niveles de TIM durante subjetiva día, sus niveles de actividad fueron mayores durante la noche subjetiva (Figs. 1B y 1D]. Estos resultados demuestran una estrecha correlación entre las fases de la actividad locomotriz ritmo y el momento de la inducción de TIM. Por otra parte, la fase de la actividad de apareamiento ritmo parece no estar correlacionado con el de la fecha de TIM inducción porque el patrón de apareamiento de nuestras moscas transgénicas en diferentes momentos de inducción TIM (Figs. 2B y 2C] y de tipo salvaje Moscas (Figura 2A] diferentes. Nuestros datos sugieren fuertemente que los ritmos de actividad locomotora y la conducta de apareamiento tienen diferentes vías de salida de la central del sistema circadiano (Fig. 3]. Tauber et al. También sugirió que los períodos de actividad locomotora no están causalmente relacionados con la conducta de apareamiento, aunque los dos ritmos pueden ser manifestaciones de la misma central oscilador [6]. Por lo tanto, proponemos que las vías del ritmo de actividad de apareamiento molecularmente son más complejos que los de la actividad locomotriz ritmo.

Actividad locomotora está relacionada con el apareamiento o la receptividad sexual en muchos insectos [14]. Por ejemplo, la virgen de hormigas reinas tienen un ritmo circadiano actividad locomotora mientras que las reinas acoplado a poner huevos no muestran circadiano y sus niveles de actividad son mucho más bajos que los de las hembras vírgenes. Acoplada reinas que han dejado de poner huevos reanudar locomotor ritmo circadiano [7]. Mujeres alemán cucarachas que exhiben mayor actividad locomotriz son sexualmente receptiva y dicha actividad se reduce después de apareamiento, lo que sugiere que la actividad locomotora femenino se asocia principalmente a la búsqueda de una mate. [15]. La mayoría de las investigaciones abordar la relación entre la actividad locomotora y el apareamiento o la actividad sexual se han llevado a cabo después de las moscas ha acoplado (post-apareamiento). Sin embargo, teniendo en cuenta estos datos, se requiere un estudio más a fondo para aclarar la validez de apareamiento mecanismo, en particular la conducta de apareamiento ritmo, a fin de determinar el mecanismo molecular de la especiación.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

EN participado en la recolección de datos y el análisis de datos y redactó el manuscrito. MS ayudó a producir los transgénicos moscas y supervisó el estudio. NI dirigido el estudio. Todos los autores leído y aprobado la versión final del artículo.