Proteome Science, 2006; 4: 5-5 (más artículos en esta revista)

Un enfoque de los sistemas de oncología clínica: Enfoque en el cáncer de mama

BioMed Central
Mark Abramovitz (mark.abramovitz @ mcgill.ca) [1], Brian Leyland-Jones (brian.leyland-jones @ mcgill.ca) [1]
[1] Centro de Investigación Clínica en Oncología y del Departamento de Oncología, Universidad de McGill, 546 Pine Avenue West, Montreal, Quebec, H2W 1S6, Canadá

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Resumen

Durante el último decenio, microarrays genómicos que se han aplicado con cierto éxito a los perfiles moleculares de los tumores de mama, lo que ha dado lugar a una mucho más detallado esquema de clasificación, así como en la identificación de los posibles conjuntos de genes firma. Estos conjuntos de genes que se han aplicado a la predicción y pronóstico de resultados para el tratamiento y han obtenido mejores resultados que los actuales criterios clínicos. Una de las principales limitaciones de los análisis de microarrays, sin embargo, es que las muestras congeladas de tumores son necesarios para el ensayo. Esto impone severas limitaciones en el acceso a las muestras y se opone a gran escala de validación de los estudios que se realizan. Cuantitativo transcriptasa inversa reacción en cadena de polimerasa (qRT-PCR), en cambio, se puede utilizar con degradados ARN derivados de parafina fijado en formol e-incrustados (FFPE) muestras de tumores, el más importante y abundante fuente de material clínico disponible. Más recientemente, la novela DASL (cDNA mediada Annealing, de selección, la extensión y la Ligadura) ensayo ha sido desarrollado como un alto rendimiento de perfiles de expresión génica sistema diseñado específicamente para su uso con FFPE muestras de tejido tumoral.

Sin embargo, no creemos que la genómica es adecuada como una única plataforma de predicción y pronóstico en el cáncer de mama. La clave de las proteínas de conducción oncogénesis, por ejemplo, puede sufrir modificaciones después de la traducción y, además, si hemos de avanzar individualización de la terapia en el mundo de la práctica basada en pruebas de sangre, suero de la proteómica se vuelve crítica. Proteómicos plataformas, incluyendo micro-arreglos de tejido (TMA) y arrays de chips de proteínas, en relación con el aumento de la superficie de ionización por láser de desorción tiempo de vuelo espectrometría de masa (SELDI-TOF/MS), han sido las tecnologías que más se aplica a la caracterización De los tumores y suero de pacientes con cáncer de mama, todavía limitado, pero con resultados alentadores.

Esta revisión se centrará en estas plataformas de genómica y proteómica, con hincapié en la utilización de FFPE muestras de tejido tumoral y suero, ya que se han aplicado al estudio del cáncer de mama para el descubrimiento de genes de las firmas y biomarcadores para el diagnóstico precoz, El pronóstico y la predicción de los resultados del tratamiento. El objetivo final es que se pueda aplicar un enfoque de la biología de sistemas a la información obtenida de la combinación de estas técnicas con el fin de seleccionar la mejor estrategia de tratamiento, vigilar su eficacia y hacer los cambios lo más rápidamente posible cuando sea necesario para lograr los óptimos resultados terapéuticos Para el paciente.

Antecedentes

En los Estados Unidos se estima que aproximadamente 213000 nuevos casos de cáncer de mama invasivo serán diagnosticados en 2006 y 41000 se espera que las mujeres mueren de esta enfermedad [1]. El cáncer de mama se cuenta para el ~ 31% de los nuevos casos de cáncer entre las mujeres de los Estados Unidos en 2006 [1]. Actuales estrategias de tratamiento se basan principalmente en anatómica en escena que sigue desempeñando un papel importante en el proceso de toma de decisiones. Clásica patológica índices que se utilizan para predecir la supervivencia, el desarrollo de la enfermedad metastásica o guía de selección de la terapia primaria en pacientes con cáncer de mama son el Índice pronóstico de Nottingham [2 1982, adyuvante! Online (AO) [3], y los criterios de San Gall [4]. El Índice de Nottingham pronóstico se basa en el tamaño del tumor, los ganglios linfáticos etapa y el grado histológico de predecir la supervivencia de los pacientes. AO es un programa que está disponible a través de la web que se utiliza para evaluar el riesgo para el desarrollo de la enfermedad metastásica usando factores pronósticos tradicionales, que incluyen la edad, los ganglios linfáticos (LN), el tamaño del tumor, grado tumoral, y estado de receptores hormonales. La actual deriva de San Gall algoritmo para la selección de la terapia sistémica adyuvante para pacientes con cáncer de mama precoz incluyen el tamaño y grado del tumor, estado ganglionar, la condición de la menopausia, peritumoural buque invasión, y el estado endocrino HER2 (receptor del factor de crecimiento epidérmico 2). El uso de estas patologías antes mencionadas, principalmente basado en herramientas de pronóstico en el tratamiento proceso de toma de decisiones son insuficientes y, como mínimo, a una comprensión más precisa en la estratificación de los pacientes respondedores frente a no respondedores a los agentes terapéuticos que se necesita.

Aunque las grandes ensayos clínicos han confirmado el valor de la terapia sistémica, no es posible determinar, en primer lugar, los pacientes que son susceptibles de responder a tratamiento adyuvante o tipos de tratamiento que se debe utilizar. Por ejemplo, la terapia adyuvante mejora significativamente la supervivencia en pacientes con cáncer de mama tanto LN-LN-negativos y positivos enfermedad. Se acepta en general que los pacientes con cáncer de mama de mal pronóstico podría ganar el máximo beneficio de la terapia adyuvante (por ejemplo, en aquellos con invasión axilar LNs). Sin embargo, los resultados de varios estudios muestran que 22 a 33% de los pacientes con cáncer de mama no detectables LN participación y clasificarse en un buen pronóstico subgrupo desarrollar recurrencia de la enfermedad después de 10 años de seguimiento. Por lo tanto, precisa la identificación y clasificación de los pacientes con cáncer de mama más allá de los pronósticos y predictivos actuales marcadores es de importancia crítica para el tratamiento racional de la toma de decisiones y un mejor resultado clínico en el paciente, un objetivo a largo plazo, aunque difícil de alcanzar, los investigadores de cáncer de mama .

Múltiples agentes quimioterápicos que incluyen antraciclinas, antimetabolitos, inhibidores de microtúbulos, y los agentes alquilantes se han utilizado con éxito en el tratamiento del cáncer de mama. Si bien, las tasas de respuesta de> 30% son de rutina realizados en pacientes no tratados previamente aún no es posible saber cuál de estas terapias citotóxicas será el tratamiento más efectivo para un paciente en particular del tumor. Una vez que comienza el tratamiento, el paciente es monitoreado por la respuesta y la toxicidad y cualquier cambio en la terapia es únicamente sobre la base de la progresión del tumor o toxicidad intolerable. Incluso en el caso de terapias específicas en cáncer de mama que afectó a los receptores de estrógeno (ER), HER2 o EGFR (factor de crecimiento epidérmico humano receptor 1), la capacidad de vigilar efectivamente la respuesta es crítica. Así, a pesar de la elaboración de numerosos generales y específicas de lucha contra el cáncer de los agentes en las últimas dos décadas, se necesitan más avances en cuanto al incremento de la esperanza de vida una vez que una mujer es diagnosticada con cáncer de mama [5]. Así, la capacidad para diagnosticar el cáncer de mama precoz, determinar el pronóstico de cada mujer, predecir la mejor modalidad de tratamiento y de manera eficaz y no invasiva supervisar el progreso del paciente al tratamiento es fundamental si hemos de avanzar en nuestra lucha contra el cáncer de mama.

El camino hacia el futuro será necesario un enfoque sistemático que requiere tanto la genómica y la proteómica si queremos cumplir con el objetivo de la individualización terapéutica. Las razones de ello son varias: 1) Molecular de perfiles de los microarrays, qRT-PCR o FISH-(fluorescentes de hibridación in situ) que se basa el análisis de los tumores es necesaria para la clasificación de los tipos de tumores que se correlaciona con el pronóstico, 2) Análisis de genes en el nivel Sin embargo, no puede detectar las sutilezas biológico introducido a través de modificaciones postraduccionales, glycosylations, etc de las proteínas y, por tanto, requiere un enfoque proteómicos, 3) Análisis de muestras de suero de marcadores predictivos sólo puede lograrse a través de la proteómica, y 4) las tecnologías de más edad (por ejemplo, , Histopatología e inmunohistoquímica) todavía pueden resultar útiles para determinados tratamientos en pacientes individuales. Por ejemplo, una amplificación genómica sugiriendo llevar de un gen particular podría ser validado en el nivel proteómicos o mediante inmunohistoquímica. El camino hacia la individualización de la terapia es compleja y, a largo plazo, requerirá una combinación de análisis genómicos y proteómicos, en relación con los actuales análisis histopatológico e inmunohistoquímico con el fin de ofrecer una imagen completa de un paciente de cáncer de mama. Sólo a través del análisis de datos a través de plataformas tecnológicas y el uso de la mejora de la biología de sistemas computacionales enfoques seremos capaces de definir el tiempo de todas las piezas al rompecabezas.

Ha permitido que la tecnología de microarrays de expresión sin precedentes de perfiles de miles de genes simultáneamente, y para el desarrollo de las firmas de genes para subdividir y clasificar los tumores [6], así como predecir la respuesta al tratamiento [7]. Sin embargo, esta plataforma se basa en muestras de tejido tumoral congeladas que no son una fuente de fácil acceso, pero otras plataformas complementarias, como TMA, qRT-PCR y la recientemente descrita DASL ensayo [8], permitirá a los investigadores para aprovechar el gran recurso Así anotado FFPE de tejido tumoral muestra repositorios. Análisis de la expresión mRNA utilizando cualquiera de estas plataformas antes mencionadas, sin embargo, proporciona sólo una pequeña mirada a lo que está ocurriendo en un tumor, ya repetir las biopsias no son una opción realista y, por lo tanto, no constituyen un medio de la raíz de una respuesta del paciente A la terapia. Esto requerirá la capacidad para el análisis de proteínas de fácil acceso en muestras de suero de los pacientes en tratamiento con diversos fármacos recientemente desarrollados utilizando proteínas-chip arrays en conjunción con SELDI-TOF/MS. La capacidad de vigilar y predecir la respuesta de un paciente a la terapia permitirá a los cambios necesarios en la terapia sea lo más rápida posible. Un enfoque sistemático, por lo tanto, supondrá una precisa patológicos y moleculares de la clasificación del paciente tumoral que se utiliza para seleccionar la mejor estrategia de tratamiento, seguimiento de los efectos del tratamiento con el fin de modificar el tratamiento según sea necesario, y predecir la recurrencia de la enfermedad.

Esta revisión se centrará en este enfoque sistemático y la aplicación de las actuales y nuevas tecnologías de genómica y proteómica, la anterior, en lo que se refiera al estudio del cáncer de mama; enfoques que contribuyan a, y cambiar la forma en que diagnosticar, tratar, Y monitorear la efectividad del tratamiento en los pacientes.

Clasificación de los tumores de mama utilizando microarrays

Microarray basado en la expresión de genes de perfiles de los cánceres humanos ha emergido rápidamente como una nueva técnica de detección de gran alcance. Recientemente, la expresión de los genes del cáncer de mama se han detectado firmas que se asocian con ER y LN estado de los pacientes y pueden ayudar en la clasificación de pacientes con cáncer de mama en subgrupos con diferentes resultados clínicos. Además, la expresión de genes firmas han demostrado predecir la respuesta a determinados regímenes de quimioterapia (véase más adelante). La ventaja de la tecnología de microarrays es la capacidad de medir el ARN expresión de miles de genes de una sola vez, y se refieren a la forma en que el patrón de expresión de un gen correlaciona con la expresión de otros genes en el tumor o entre diferentes muestras.

Uno de los primeros intentos para caracterizar amplio de la variación en la expresión de genes de tumores mamarios esporádicos entre las muestras fue publicado por Perou y compañeros de trabajo [9]. Este estudio pionero fue el primero en demostrar que los tumores pueden ser fenotípicamente clasifican en subtipos distinguibles por diferencias en sus perfiles de expresión. Un "conjunto de genes intrínseco" de 476 ADNc se utilizó para segregar el grupo y los tumores en cuatro grandes grupos: 1) una "luminal de las células, como" grupo de expresar ER; 2) una "células basales-como" grupo de expresar Citoqueratinas 5 y 17, la integrina 4, y laminina, pero que carecen de ER expresión; 3) un subconjunto HER2-positivo, y 4) un "normal" epiteliales grupo. Por lo tanto, este documento seminal identificado subtipos específicos de los tumores de mama sobre la base de receptores hormonales y estado HER2.

Un estudio posterior por el mismo grupo ha ampliado el perfil molecular del cáncer de mama mediante la aplicación de su intrínseca de genes al grupo 78 tipos de cáncer (tumores, de su anterior estudio se incluyeron en estas), 3 fibroadenomas, y 4 muestras de tejido normal de mama [6] . En este estudio, se identificaron 456 genes (de un total de 8102 genes candidatos) que puedan clasificar los tumores de mama en seis subtipos (incluyendo ER-positivo, luminal subtipo A; ER-positivo, luminal subtipo B; ER-positivo, luminal subtipo C; HER2 - Positivo, ER-negativo subtipo; basal-como, ER-negativo, de los receptores de progesterona (PGR) negativo, HER2-negativos; normal como el de mama-) y posteriormente validados estos subtipos en la independencia de cohorte de 49 pacientes con cáncer de mama localmente avanzado . Los autores encontraron que estos subtipos fueron muy significativamente correlacionado con la supervivencia general (OS) (o el porcentaje de sujetos en un estudio que han sobrevivido durante un período de tiempo definido, por lo general desde el momento del diagnóstico). Un sistema de clasificación similar se obtuvo el 99 LN-LN-negativos y positivos pacientes con cáncer de mama [10]. ER es la condición más importante discriminador de los subtipos de tumores de grado con ser un distante segundo lugar. Además, los subtipos no se hacen eco de otras características clínicas, tales como LN, el tamaño del tumor o el estado de la menopausia, lo que subraya la importancia de la caracterización molecular de los tumores.

Van't Veer y colegas [11] han utilizado ADN microanálisis de los tumores primarios de mama de 98 pacientes jóvenes y aplicado bajo la supervisión de clasificación para identificar un gen-70-expresión altamente predictiva de la firma de un corto intervalo de metástasis a distancia en pacientes LN-negativos < 55 años de edad. El mal pronóstico de la firma consistió en la regulación de los genes del ciclo celular, invasión, metástasis y la angiogénesis. Van de Vijver y compañeros de trabajo [12], posteriormente utilizado este 70-gen pronóstico perfil de clasificar una serie de 295 pacientes consecutivos con carcinomas de mama primario como expresión de un gen asociado con la firma, ya sea un mal o un buen pronóstico. Todos los pacientes habían etapa Io II y el cáncer de mama era menor de 53 años de edad, 151 tenían enfermedad LN-negativo, y 144 habían LN-positivas enfermedad. El poder predictivo del pronóstico perfil se validó en forma univariada y multivariada análisis estadísticos. Entre los 295 pacientes, 180 tenían un mal pronóstico de la firma y 115 tenía un buen pronóstico de la firma, y el general de 10 años las tasas de supervivencia fueron del 55% y 95%, respectivamente. En 10 años, la probabilidad de permanecer libre de metástasis a distancia fue de 51% en el grupo con un pobre pronóstico de la firma y el 85% en el grupo con un buen pronóstico de la firma. La estimación de razón de riesgo (riesgo relativo o de criterio de valoración en un momento dado) de metástasis a distancia en el grupo con un pobre pronóstico de la firma, en comparación con los que para el grupo con el buen pronóstico de la firma, fue de 5,1 (o 5,1 veces mayor ). Esta relación sigue siendo significativa incluso cuando los grupos fueron analizados de acuerdo a la condición de LN. Análisis multivariable de regresión de Cox mostró que el pronóstico era un perfil fuerte factor independiente en la predicción de la enfermedad resultados. El resultado de la expresión de genes era un perfil más potente predictor de los resultados de la enfermedad en pacientes jóvenes con cáncer de mama que el 2001 St Gallen criterios, o los criterios de consenso del NIH [13] sobre la base de las características clínicas e histológicas. De hecho, la utilización de estos criterios dio lugar a una clasificación errónea de un número importante de pacientes que serían tratados bajo o sobre-tratamiento con terapia adyuvante. Sorprendentemente, su pronóstico es independiente del perfil LN participación, sino más bien, se basó en su fuerte poder predictivo con respecto a la metástasis no a los tejidos linfáticos.

Poco después, Piccart y colegas [14] presentó la validación de Amsterdam el 70-gen pronóstico firma en LN-negativos sin tratar el cáncer de mama en el San Antonio Breast Cancer Symposium. Esta validación se realizó como parte de la preparación para el lanzamiento de la gran ensayo clínico prospectivo y aleatorio, MINDACT, LN-negativas para el cáncer de mama, con el soporte para ver la utilidad en la práctica clínica de Amsterdam el 70-gen pronóstico firma. Heterogeneidad significativa entre los de Amsterdam y la validación externa de muestras se encontró y en la actualidad está siendo investigado, sin embargo el 70-gen pronóstico firma un rendimiento superior tanto el Índice pronóstico de Nottingham y el de San Gall criterios en la predicción del tiempo a metástasis a distancia y sistema operativo. Además, las mujeres de la presente serie clasificados como de bajo riesgo por el gen firma había una proyección de 5 años de metástasis distante supervivencia libre de 95%. Si bien el rendimiento general del 70-gen pronóstico firma fue inferior en esta validación externa serie frente a la serie original de Amsterdam, los resultados proporcionan evidencias para el valor clínico de esta nueva herramienta genómica, y están animando a la movilización de las fuerzas para la realización de MINDACT.

Una serie de recientes estudios de microarrays se han publicado, que también se ocupan de la evaluación de riesgos en el paciente con los LN-negativos de cáncer de mama. En uno de esos estudios, Wang y Co-Trabajadores [15] analizaron muestras de tumor primario de 286 LN-negativos pacientes de todas las edades y tamaños de tumor que no habían recibido ningún tratamiento sistémico adyuvante. Destacaron la firma de 76 genes que mostró 93% de sensibilidad y especificidad del 48% cuando se analizaron en una serie independiente de 171 pacientes LN-negativos. Este conjunto de genes fue útil en la identificación de los pacientes que desarrollaron metástasis a distancia dentro de los 5 años. Mediante el uso de este gen firma sólo el 52% de los pacientes de bajo riesgo se recomienda a recibir quimioterapia sistémica adyuvante en comparación con el 90% de los criterios de San Gall. Sin embargo, la utilidad de este gen la firma tendrá que ser confirmado en una cohorte más amplia de los pacientes antes de ser utilizados para recomendar que los pacientes de bajo riesgo de no ser tratadas con terapia sistémica adyuvante innecesarios. En otro estudio reciente, un 64-gen conjunto de firmas se debió a que la agrupación jerárquica de los microarrays de datos de 159 muestras de tumor tanto adyuvante de los pacientes tratados y no tratados que identificaron genes relacionados con el pronóstico y el impacto de los tratamientos adyuvantes, que se define como metástasis a distancia o la muerte Dentro de los 5 años [16]. Este conjunto de genes fue validado en la independencia de cohorte de 289 pacientes y se podría utilizar para estratificar los pacientes en bajo, medio y alto riesgo de que los grupos actuales superaron a criterios clínicos. Los pacientes en el grupo de bajo riesgo podrían ser librado de la quimioterapia adyuvante, mientras que en el grupo de alto riesgo podrían beneficiarse de terapias agresivas como las antraciclinas o taxanos, sin embargo, esto tendría que ser validado en un estudio prospectivo más amplio.

El uso de microarrays de datos para predecir la respuesta al tratamiento

Otros recientes estudios de microarrays se han centrado en la determinación de genes de las firmas potenciales de respuesta de los pacientes a la quimioterapia específica y regímenes de terapia hormonal. En uno de esos estudios, Chang y compañeros de trabajo [7] han demostrado que los perfiles de genes pueden ser usados para predecir con precisión la respuesta al tratamiento neoadyuvante docetaxel. El estudio se reclutó a 24 sujetos de los cuales básico aguja tumor de mama se tomaron biopsias. ARN fue extraído de estas biopsias y sometidos a análisis de microarrays que se tradujeron en la construcción de un 92-gen predictor de respuesta establecidos. En un análisis de validación cruzada, el clasificador correctamente identificados 10 de 11 que respondieron, de 13 y 11 no respondedores para una precisión de 88%. Correlación entre la expresión del ARN medido por el Affymetrix arrays y semi-cuantitativos de RT-PCR también fue comprobado. Además, esta clasificación se validó en un conjunto independiente de 6 pacientes posterior.

Resultados similares se obtuvieron en un estudio más reciente en el que un 85-gen firma fue seleccionada de más de 2400 genes utilizando un alto rendimiento técnica de RT-PCR [17]. Las muestras de tejidos de 44 tumores de mama, tomadas antes del tratamiento, y se analizaron los genes fueron seleccionados sobre la base de la expresión diferencial entre respondedores y no respondedores. Luego se ideó un sistema de diagnóstico basado en un algoritmo ponderado y lo usó para predecir la respuesta clínica a la terapia de docetaxel en 26 pacientes con más de 80% de precisión.

Un segundo estudio neoadyuvante fue publicado recientemente utilizando cDNA arrays para elaborar un predictor de la respuesta a paclitaxel secuencial y fluorouracilo + doxorrubicina + ciclofosfamida, con la participación de 42 muestras, 24 de los cuales fueron utilizados para el descubrimiento marcador predictivo y 18 de los cuales se utilizaron como una validación independiente establecido . Un clasificador con 74 marcadores se desarrolló, con un 78% de precisión, lo que sugiere que el perfil transcripcional tiene el potencial de identificar un patrón de expresión génica en cáncer de mama que pueden llevar a clínicamente útil para predecir la respuesta de la quimioterapia [18]. Un ensayo clínico prospectivo está actualmente en curso para validar estos resultados iniciales. Y, por último, en un estudio publicado por Jansen y compañeros de trabajo [19], de 44 de la firma de genes se utiliza para predecir la respuesta a tamoxifeno y tamoxifeno resistentes a los tumores. Ellos fueron capaces de predecir el tamoxifeno-resistencia con una precisión de 77% en comparación con el 50-60% de precisión basado en ER estado solo.

Trabajo adicional en la determinación de los patrones de expresión de otros regímenes de quimioterapia comúnmente prescritas, como antraciclinas y anti-metabolitos, o la terapia dirigida, como trastuzumab, está en marcha con la esperanza de que estos patrones se pueden incorporar a pruebas predictivas para la selección de un tratamiento adecuado para reducir al mínimo Maximizar la eficacia y la toxicidad para las mujeres con cáncer de mama. Esta tecnología, por lo tanto, ofrece a los medios de identificación de posible utilidad clínica de predicción de genes y los genes que las firmas, cuando validado, puede reducir el tratamiento innecesario de quimioterapia para las mujeres con cáncer de mama. Además, estos resultados comparar muy favorablemente con los mejores existentes factores predictivos de respuesta a la terapia específica, y sugieren fuertemente que después de la validación adecuada extensa, estas identificado genes / genes firmas será útil para el tratamiento de selección. Uno de los principales salvedad, sin embargo, es que la imposibilidad de utilizar rutinariamente FFPE muestras de tejido tumoral en el análisis de microarrays restringe el uso de esta tecnología para juegos relativamente pequeño de la muestra y requiere la validación de los posibles genes y biomarcadores genómicos utilizando adicionales (qRT-PCR, DASL) y O proteómicos (TMA) plataformas (tratadas en las siguientes secciones más adelante).

El uso de FFPE tejido tumoral para los análisis de las plataformas

Aunque los mencionados estudios de microarrays han confiado en fresco-congelado muestras de tejidos, este material es difícil de reunir para estudios a gran escala, proceso engorroso y caro para almacenar a largo plazo. En los últimos años, se han logrado grandes progresos en el desarrollo de tecnologías para explotar FFPE muestras de tejido tumoral de la expresión génica y proteómica análisis. FFPE de tejidos es la metodología estándar de procesamiento de los laboratorios de patología practicada en el mundo-más. Estas muestras son muy estables a temperatura ambiente, se puede almacenar fácilmente y, lo que es más importante, conforman un extenso archivo de silicona, bien caracterizado y bien anotado muestras clínicas de los ensayos aleatorios que existen en todo el mundo. FFPE muestras de tejidos tumorales, por lo tanto, un inmenso recurso que se prestan a la realización de ambos retrospectivo y prospectivo biomarcador investigaciones que permitirán bien controlados de hipótesis.

Varios grupos han demostrado que es viable para extraer y purificar el RNA de tales FFPE de tejidos y para realizar los perfiles de expresión génica, a pesar de la modificación química y, a menudo, la fragmentación de ARN que se produce debido al proceso de fijación [[20 - 27]]. Con el desarrollo de qRT-PCR la tecnología, ahora es posible detectar los mensajes raros en FFPE de tejidos y para examinar la variación de expresión bastante más de un gran rango dinámico. Amplicones están diseñados específicamente en pequeños segmentos de ADN (menos de 100 bps) para alcanzar casi el 100% de eficiencia para todos los amplificados independientemente de su extensión y composición de ácidos nucleicos. Esto también es ideal para los tejidos fijos ya que la mayoría de las especies de ARN en el tejido FFPE son degradados a los fragmentos que son ≥ 100 pb; como tal, transcripciones pueden ser fácilmente detectados por oligonucleótidos que se extienden pequeños amplicones de menos de 100 pb. El potencial de esta tecnología, como se ha señalado anteriormente, se hace aún más atractiva en el sentido de que permite el análisis de miles de bien anotado archivados muestras de tejidos sin la necesidad de reunir el relativamente complicado tejido fresco congelado. Plataformas que puede utilizar esta riqueza de las muestras disponibles, en consecuencia, acortar el tiempo de desarrollo y la validación de biomarcadores y en la actualidad está siendo explotados en la Oncotype DX ensayo [28] (véase más adelante).

FFPE muestras de tejidos tumorales son habitualmente utilizados para el análisis inmunohistoquímico y con el desarrollo de la tecnología TMA, los grandes conjuntos de muestra de tejido puede usarse para evaluar el papel potencial de biomarcadores como herramientas de diagnóstico o pronóstico en el cáncer de mama (véase más adelante).

Micro-Las matrices de tejido para la evaluación de biomarcadores tumorales de mama

En la TMA formato, un conjunto compuesto por cientos de muestras de pacientes utilizando diferentes núcleos tan pequeños como 0,6 mm tomados de los bloques FFPE tumor [29]. Cada variedad se incubaron con una detección de proteínas (es decir, los anticuerpos): un solo punto final analito se mide y compara directamente a través de múltiples muestras (Fig. 1]. Probando los múltiples arreglos con diferentes anticuerpos específicos proporciona el efecto de la generación de un multiplex de lectura. TMAs, por lo tanto, se desarrolló como medio de la identificación de dianas proteicas en tantos como 1000 cilíndrico FFPE muestras de tejido tomadas de los distintos tumores. Esto ha abierto la puerta al análisis de la expresión de la proteína usando el archivo de tejidos, y TMAs proporcionar un método eficiente para el examen de múltiples biomarcadores en una gran serie retrospectivo y prospectivo de casos de cáncer de mama. El TMA plataforma se ha empleado para estudiar un número limitado de marcadores biológicos que son potencialmente implicados en la progresión maligna y la biología del tumor utilizando similares métodos analíticos utilizados para el análisis de datos de microarrays.

La primera aplicación de esta técnica de alto rendimiento fue a la identificación de seis genes amplificados en el cáncer de mama, así como p53 y ER, a fin de definir nuevos subgrupos [30]. Sin embargo, para que TMAs de obtener una amplia aceptación, y el campamento de los compañeros de trabajo [31] mostró que TMAs son básicamente immunohistochemically equivalente a todo el tejido secciones. Lo ha demostrado mediante el estudio de la expresión de los tres antígenos comunes en los carcinomas de mama invasivo; ER, la PGR y HER2. Se determinó que el análisis de dos núcleos de 0,6 mm de cada tumor muestra es comparable a la de un análisis de tejido de la sección en su conjunto más de 95% de los casos. Como importante es que se pueda llevar a cabo TMAs sobre tejido de archivo que datan de más de 60 años. Por lo tanto, aunque el tejido utilizado en los núcleos de estudios de TMA son pequeños en comparación con plena secciones, de su eficacia como instrumentos en los estudios de cáncer ha sido rigurosamente validadas en un corto período de tiempo por un número de investigadores [[32 - 35]]. Desde estas primeras publicaciones sobre el desarrollo y uso de TMAs en el análisis de tumores de pacientes con cáncer de mama, esta técnica se ha aplicado ampliamente al estudio de cáncer de mama tanto en lo referente a la clasificación y marcadores tumorales.

Callagy y colegas [35] trató de validar microarrays derivados de sistemas de clasificación utilizando el tejido de FFPE bien anotada de archivo de muestras. Un TMA estudio fue la sub-clasificación de 107 cánceres de mama utilizando trece diferentes putativo biomarcadores de proteínas. Análisis, la utilización de un algoritmo de agrupamiento no supervisado, los tumores subdividen en dos grandes grupos que se correlaciona con el grado del tumor y el estado ganglionar. No es sorprendente, ningún biomarcador prueba podría identificar estos grupos de clasificación, por lo tanto, requiere de la aportación de varias proteínas con el fin de subdividir en tumores clínicamente relevantes subgrupos. Basándose en sus 13 biomarcadores, los tumores pueden ser subdivididos en 2 grupos principales, ER-ER-positivos y negativos. Tumores ER-positivos se redujo en 2 subdivisiones; subconjuntos A y B, ambos luminal expresar citoqueratinas 8 / 18, sino que muestran la expresión diferencial de HER2, c-Myc y de la PGR. Un subconjunto más se recuerda de un subtipo luminal describen utilizando el análisis de microarray de expresión [6]. Tumores ER-negativos podría subdividirse en subconjuntos C y D, pero sólo subconjunto D expresado basal citoqueratinas, lo que sugiere que los tumores de tipo basal forman un subconjunto de ER-negativos de cáncer de mama. Estos datos, por lo tanto, apoya las conclusiones de anteriores estudios realizados microarrays en un número limitado de muestras [6, 9]. Sin embargo, este estudio no mostró ninguna relación entre la clasificación del tumor y la supervivencia, lo que subraya la necesidad de determinar el conjunto óptimo de biomarcadores necesarios para generar un sólido sistema de clasificación para el cáncer de mama.

En dos estudios más recientes TMA, que se describe a continuación, el análisis de agrupamiento jerárquico mostraron importancia pronóstica. Makretsov y compañeros de trabajo [36] evaluaron 31 biomarcadores en 438 casos de carcinoma de mama invasivo con 15,4 años de seguimiento. De estos 31 biomarcadores, 17 fueron significativas prognostically mientras que otros 4 mostraron una tendencia pero no alcanzó significación. Luego utilizan estos 21 immunomarkers sin supervisión para realizar el análisis de conglomerados jerárquico y fueron capaces de separar las muestras en tres grupos prognostically importante grupo. Esta agrupación también puede alcanzarse con sólo el 11 biomarcadores (ER, la PGR, HER2, p53, Ki67, CA IX, TIP1, estroma CD117, PTEN, p63 y CK5 / 6), que contribuyeron significativamente a su grupo grupo designación. Cluster grupo 1 fue ER-positivo y positivo de la PGR, mientras que el Grupo grupos 2 y 3 son, en su mayor parte, estas negativas para los receptores de hormonas esteroides. En cuanto a la supervivencia, sólo el grupo LN estado de los grupos y fueron significativas como variables con valor pronóstico independiente. De hecho, algunos tumores que expresaron los altos niveles de ER se clasificaron como pertenecientes al grupo de 2 o 3, ER-negativo. Así, la expresión de marcadores biológicos asociados con la agresividad del tumor puede anular los factores pronósticos positivos como ER. Es especialmente importante para poder determinar la naturaleza de LN-negativos de cáncer de mama a fin de que la quimioterapia es tóxico sólo se administra a los pacientes que lo necesitan mientras que otros ahorradores que no.

Un estudio más amplio de TMA recientemente se completó en 1076 que los casos de cáncer de mama invasivo se evaluaron utilizando 25 biomarcadores [37]. Biomarcadores utilizados en el estudio se seleccionaron sobre la base de: 1) su bien establecida papel que desempeñan en la carcinogénesis de mama, 2) su capacidad para actuar como discriminador genes que pueden estratificar en el cáncer de mama a grupos distintos, identificados en estudios de microarrays, y 3) Su capacidad para identificar formas específicas de la diferenciación. Marcadores procedían de los siguientes grupos: luminal, basal, los receptores de hormonas, EGFR miembros de la familia, los genes supresores de tumores, las moléculas de adhesión celular, mucins, apocrinas diferenciación y diferenciación neuroendocrina. Seis grupos principales fueron identificados por el análisis de conglomerados jerárquico: Grupos 1 y 2 se ER-positivo, luminal, mientras que los grupos 3 y 6 son HER2-positivas, luminal. Sin embargo, el grupo 3 se distinguen de Grupo 6, sobre la base de fuertes y débiles MUC1 E-cadherina expresión en el grupo 3 y la debilidad de MUC1 y E-cadherina fuerte expresión en el grupo 6. Grupo 4 sólo figura 4 tumores que son todos los EGFR-ER-positivos, pero también negativos. Finalmente, el grupo 5 es basal, HER2-negativos y ER-negativo. Este estudio muestra claramente que la aparente homogeneidad tumores podrían clasificarse en biológica y clínicamente grupos distintos y que confirma la anterior clasificación de cáncer de mama llevada a cabo por el análisis de microarrays [6].

BRCA1 y BRCA2 tumores recientemente también han sido objeto de análisis TMA 37 biomarcadores en la que se utiliza para definir los receptores de la hormona, ciclo celular, apoptosis de células basales y de la condición [38]. El TMA figura núcleos a partir del 20 de BRCA1, BRCA2 y 14 esporádicos 59 emparejados por edad carcinomas de mama. De acuerdo con anteriores trabajos, BRCA1 mostró características fenotípicas que fueron especialmente diferente de la BRCA2. El análisis de todos los casos hereditarios y esporádicos sin supervisión jerárquica de la agrupación puso de manifiesto dos ramas principales, una ER-positivo y un grupo ER-negativo. Dentro del segundo grupo, los carcinomas BRCA2 fueron entremezclados con tumores esporádicos, sin embargo, la mayoría de los carcinomas BRCA1, que se encuentra en el primer grupo, se agruparon en una de las principales sub-rama que incluían tumores que expresaron marcadores de células basales y / o p53. Hay una clara separación de este sub-grupo de HER2-positivo carcinomas esporádicos. De hecho, el análisis por FISH, no fue amplificado HER2 en cualquiera de los tumores BRCA, pero fue amplificado en el 22% de los esporádicos. En contraste con esto, c-Myc resultó ser amplificado en el 23% (3 / 13) de BRCA1 y el 67% (4 / 6) tumores BRCA2. Con respecto a los marcadores, la más notable diferencia entre BRCA1 y BRCA2 carcinomas de mama hereditario es en la expresión de proteínas del ciclo celular. BRCA2 tumores expresó ciclina D1 y D3, D quinasa ciclina (CDK) 4 y los inhibidores de la CDK, p16, p21 y p27, que son todos los downregulated en BRCA1. BRCA1 podría caracterizarse como tener un fenotipo basal, ER-negativos y HER2-negativo, con un máximo de regulación de la ciclina A y caspasa 3, pero downregulation de la ciclina D1 y D3, CDKIs (p16, p21, p27), y BCL2, la Fenotipo contrario de la mayoría de los carcinomas BRCA2.

TMAs también se han utilizado para evaluar los carcinomas de mama con un número limitado de marcadores biológicos con el fin de probar la hipótesis de que un particular ha marcador biológico y / o de importancia terapéutica en el cáncer de mama. Se ha sabido desde hace tiempo que el uso a largo plazo de los fármacos antiinflamatorios no esteroides (AINE) son vinculados a un 40-50% de reducción en el cáncer de colon [39]. El efecto de los AINE en el cáncer de colon es causada por la inhibición de la ciclooxigenasa-2 (Cox-2), con lo que el bloqueo de la síntesis de prostaglandinas (PG), por encima de todo PGE 2, que promueve la tumourigenesis, invasión y metástasis estimulando la inhibición de la angiogénesis y de la vigilancia inmune [40]. Sin embargo, la importancia de la Cox-2 en el cáncer de mama no se ha establecido. TMA análisis se realizó sobre 200 carcinomas de mama y de la Cox-2 se detectó en el 41% de los casos [41]. Expresión de Cox-2 se correlacionó positivamente con la HER2 y el Ki-67, un marcador de proliferación, pero está inversamente correlacionada con la expresión de ER y de la PGR. Un papel potencial de la Cox-2 en el cáncer de mama se basa en su función en la proliferación [42], [43] la apoptosis, así como la angiogénesis [44]. Aunque una asociación significativa de la Cox-2 con la supervivencia libre de enfermedad (DFS) (o la supervivencia período que abarca el tiempo desde la cirugía hasta la recurrencia del cáncer) no se logró, la Cox-2 sigue representando un interesante objetivo en el cáncer de mama [45].

Desacetilación de histonas por histonas deacetylases (HDACs) contrarresta acetilación de histonas en el ADN como consecuencia de que es inaccesible causando represión de la transcripción de genes. En los últimos años, los inhibidores de HDACs han mostrado promesa como posibles agentes contra el cáncer [46], y se han encontrado para inhibir el crecimiento celular e inducir la apoptosis en células de cáncer de mama [[47 - 50]]. TMA Un estudio [51], utilizando muestras de tumores de 200 pacientes con cáncer de mama, que se llevó a cabo se centró en HDAC-1 y HDAC-3, de las HDAC clase I, ya que éstas desempeñan un papel en la proliferación y supervivencia celular de las células tumorales mamarias y puede Interactuar de manera directa o indirecta con los receptores de hormonas esteroides ER y la PGR, así como el supresor tumoral p53 [[52 - 54]]. Encontraron que HDAC-1 se asoció significativamente con la mejora de DFS, pero no con los factores pronósticos clásicos. En un subgrupo de ER / PGR-positivos, los tumores HER2-negativo, expresión de HDAC-1 se asocia con una mejor probabilidad entonces DFS HDAC-1 negativos tumores. En general, HDAC-1 de expresión está vinculada a los tumores menos agresivos, mientras que los tumores en los que HDAC-1 no se detectó fueron más agresivos. Así, HDAC-1 expresión podría añadirse a la lista de posibles marcadores de la prolongada DFS y la agresividad tumoral.

Expresión anormal de una serie de mucins, grandes glicoproteínas expresadas por muchas células epiteliales, ha sido implicado en muchos tipos de cánceres. Sobreexpresión de MUC1 junto con MUC2 y MUC3 ha sido detectado en el cáncer de mama [55]. El papel exacto que mucins desempeñar en el cáncer en general y en particular el cáncer de mama todavía no se ha determinado. En un estudio realizado por Rakha y colegas [56], expresión de una serie de mucins (MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC y MUC6) fueron perfiladas por TMA en 1447 los casos de cáncer de mama invasivo con el fin de evaluar su importancia pronóstica. MUC1 y MUC3 se detectaron en la mayoría de los casos de cáncer de mama. Más notable, es la localización subcelular de estos dos mucins y no su nivel de expresión que es de valor pronóstico; tinción membranosa, que se asocia a peor en comparación con el OS tinción apical y una más favorable OS. El otro mucins no parece tener ningún valor pronóstico para predecir el resultado.

Uno de los principales objetivos para el uso de la tecnología TMA prognostically es identificar a los grupos pertinentes de pacientes con cáncer de mama y, en conjunción con datos procedentes de otros estudios de perfiles moleculares, encontrar un óptimo grupo de biomarcadores que pueda ser validada en la muestra independiente conjuntos. Al final, el objetivo de muchos de estos estudios es que se pueda identificar a los marcadores biológicos que pueden ser utilizados en un entorno clínico rápidamente a caracterizar un tipo de tumor del paciente y utilizar esa información para aplicar la estrategia de tratamiento más apropiado. Por lo tanto, la clasificación molecular de los tumores de mama contribuirá información importante a la clasificación histopatológica tradicionales que se utilizan actualmente. Sin embargo, el uso de TMAs requiere un conocimiento previo de los posibles biomarcadores de ser evaluados y, por lo tanto, no puede fácilmente contribuir al descubrimiento de nuevos biomarcadores.

QRT-PCR: El ensayo Oncotype DX pronóstico para los pacientes tratados con tamoxifeno

QRT-PCR tecnología genómica representa una importante plataforma que tiene una gran sensibilidad y especificidad, cubre una amplia gama dinámica, y requiere de cantidades ínfimas de las células o de tejidos a partir de la cual para aislar ARN. Aunque qRT-PCR tiene importantes posibilidades de diagnóstico, que hasta la fecha ha sido limitado para el diagnóstico viral. Genomic Health Inc (GHI), en colaboración con el National Surgical Adjuvant Breast intestinal y Proyecto (NSABP), los investigadores han desarrollado recientemente y comercializados predictivo basado en la firma de genes de ensayo para ER-positivo, negativo-LN tamoxifeno tratados con tumores de cáncer de mama, de nombre Oncotype DX [28], la medición de la expresión de 21 genes en la patología de archivo FFPE bloques. GHI / NSABP investigadores estudiaron 447 pacientes de 3 estudios clínicos independientes para poner a prueba la relación entre la expresión de 250 candidatos relacionados con el cáncer, los genes (seleccionados de otras publicaciones y bases de datos públicas) y la recurrencia. Posteriormente derivados de su lista de genes (16 genes más 5 genes de referencia) y la repetición Resultado algoritmo (RS) que fue probado en forma prospectiva 668 pacientes que participaron en el ensayo NSABP B-14 y se encontró que proporcionan precisión y exactitud en la predicción de la probabilidad de distancia Recurrencia. Además, el rendimiento superó estándar RS medidas como la edad, tamaño tumoral y el grado del tumor, el pronóstico, tanto en el poder y en la reproducibilidad [28]; esta tecnología ha sido aprobada recientemente por los EE.UU. Administración de Alimentos y Medicamentos para la aplicación clínica.

Desde entonces, esta técnica ha sido objeto de extensas pruebas en relación con la validación y el pronóstico capacidades: 1) la anteriormente descrita RS ha demostrado predecir la respuesta a la quimioterapia [57]. Este trabajo demostró que un mayor RS se asocia a una mayor probabilidad de respuesta patológica completa en los pacientes tratados con doxorubicina / paclitaxel terapia neoadyuvante en el cáncer de mama localmente avanzado; 2) RS ha demostrado ser no sólo el pronóstico de los pacientes tratados con tamoxifeno, sino también Altamente predictiva de la respuesta y se benefician de tamoxifeno en el NSABP B-14 [28], 3) además, RS predijo la magnitud de los beneficios de la quimioterapia en el NSABP B-20: los pacientes con tumores que tenían poca RS, derivados mínimo si cualquier beneficio de la quimioterapia . Los pacientes con tumores que tenían un alto RS, obtuvo un gran beneficio absoluto de la quimioterapia, 4) la inicial B-14 pronóstico de datos ha sido posteriormente confirmado en un estudio de validación de los 220 casos evaluables y 570 controles pareados en el Norte de California de Kaiser Permanente [58 ]. RS fue fuertemente pronóstico de la mortalidad por cáncer de mama en esta población similar a la B-14 de población. Por último, 5) los resultados de la RS NSABP B-14 y se correlacionaron en comparación con el resultado de 10 años utilizando datos estimados AO [59]. RS AO y predijo resultados relativamente débilmente correlacionado (concordancia = 48%) con la equivalencia de RS que aparecen con más fuerza con resultado de AO. Por lo tanto, cada algoritmo / ensayo claramente contiene información pronóstica independiente, sino que, por lo tanto, razonable de combinar la información de estos conjuntos en el futuro los algoritmos de predicción y pronóstico.

Evidentemente, la capacidad para validar un conjunto de biomarcadores en los grandes conjuntos de FFPE muestra es lo que permite este ensayo para seguir adelante y pasar a la clínica. Tecnología más moderna, como el que se analizan a continuación, que permitirá el análisis de grandes conjuntos de potenciales biomarcadores de ARN usando FFPE preparado a partir de tejido tumoral.

El ensayo DASL

El ensayo DASL de Illumina Inc ha sido específicamente diseñado como un sistema de perfiles de expresión génica para generar datos reproducibles de ARN's degradadas, como los derivados de FFPE muestras tumorales. El ensayo es un cruce entre microarrays y qRT-PCR tecnologías y trata de combinar en una sola plataforma que puede ser formateado para analizar la expresión de un grupo de genes seleccionados en una única muestra clínica utilizando una cantidad mínima de RNA total (≤ 200 ng total ARN por ensayo).

Las ventajas potenciales de DASL expresión frente a otras que compiten tecnologías incluyen: 1) la utilización de muestras de tejidos FFPE tan viejo como de 24 años (datos no publicados, Illumina), 2) de alto rendimiento, hasta 96 muestras clínicas en una serie de placas, y 3) el uso Costumbre de un grupo de genes, por lo menos 512 genes por la matriz.

Cada serie contiene 50000 perlas de 1534 con diferentes direcciones y 3 direcciones únicas por gen. Cada talón tiene cientos de miles de sondas de captura (23-tarios) en fibras con una dirección única. Por lo tanto, el análisis de los genes ~ 500 por grupo matriz puede realizarse en ~ 30 veces la redundancia (Fig. 2]. Oligonucleótidos están diseñados de tal manera que hay tres no superpuestas sonda por pares de genes. Ello se traduce en un 1506-plex de medición para cada muestra. Se ha demostrado que la utilización de este número de sondas de genes se presta por el ensayo de la necesaria sensibilidad y reproducibilidad para la detección cuantitativa de la expresión diferencial utilizando ARN de tejidos FFPE [8, 60]. En el procedimiento, al azar cebado se utiliza para la síntesis de ADNc y, por lo tanto, las sondas están diseñadas de manera que puedan orientar cualquier única región del gen sin limitar la selección óptima de la sonda a los 3 'extremos de las transcripciones. Además, debido al pequeño tamaño de la secuencia genética orientados (50 nucleótidos), junto con el uso de los cebos al azar en la síntesis de ADNc, esto permite la detección de ARN's que son de todas formas degradadas para el análisis de microarrays convencionales.

El 5 'oligonucleótidos constará de dos partes: la secuencia de genes específicos y universal PCR primer orden. El 3'-oligos constará de tres partes: la secuencia de genes específicos, una dirección única secuencia que es complementaria a una de 1506 sobre la captura de las secuencias de la serie y universal PCR primer secuencia en el extremo 3 '. Una sola secuencia es única dirección asociada a un único sitio de destino. Esta secuencia permite a la dirección de la PCR-amplificación de los productos en la hibridación de microarrays universal a la que lleva la dirección de secuencias complementarias.

En el informe de Bibikova et al (2004), demostraron que la DASL ensayo podría aplicarse a la mama y el cáncer de colon FFPE muestras tumorales. El uso de un panel de 231 genes del cáncer y análisis de agrupamiento, fueron capaces de separar del seno de colon tipos de tejidos y, posteriormente, dividir cada muestra de tejido fijado en el cáncer versus normal. El objetivo es, por tanto, a utilizar FFPE muestras de tejido tumoral en relación con la plataforma DASL potencialmente identificar a la firma diferencial de genes establece que se pueden utilizar para el diagnóstico, el pronóstico y / o el seguimiento de la enfermedad. Esta tecnología está empezando a ser aplicado a la investigación del cáncer y su uso se hace más generalizada que tiene el potencial de tener un impacto importante en la investigación traslacional del cáncer de mama.

Proteómicos análisis de suero en el cáncer de mama

La capacidad de detectar el cáncer temprano antes de que haya metástasis en todo el cuerpo es una de las claves para garantizar que el tratamiento tiene la mayor probabilidad de efectuar una cura completa. De igual importancia es la posibilidad de controlar la respuesta de un paciente a la terapia o de las posibilidades de recurrencia en tiempo real. Lo que se requiere, por lo tanto, es un fiable de diagnóstico no invasivo de prueba. Suero tiene la ventaja de ser de fácil acceso fluido corporal que es rica en proteínas y que está adaptado a los análisis proteómicos y, por lo tanto, biomarcador descubrimiento o la vigilancia de la condición de un paciente con el tiempo. Como un enfoque de suero biomarcador descubrimiento, proteómicos patrón de análisis se ha desarrollado como un medio para identificar nuevos marcadores de la hora de comparar muestras de pacientes con la enfermedad con los de los sujetos sanos sin ningún tipo de conocimiento previo o parcialidad de lo que son las proteínas [61]. Interesante picos pueden ser identificados y posteriormente confirmado como potenciales biomarcadores. Las diferencias en los patrones proteómicos en el suero de enfermos en comparación con el normal puede ser debido a: 1) la sobreexpresión; 2) anormalmente arrojar proteínas o fragmentos de proteínas, 3) proteínas modificadas, 4) proteolytically cleaved proteínas, o 5) debido a la degradación de la vía proteosome. Sólo una pequeña cantidad de suero, 1-20 μ l, se requiere para el análisis. Las muestras se añaden a los arrays de proteínas-chip, disponible en un número de diferentes superficies cromatográfico, que se utilizan para capturar las proteínas sobre la base de cargos ni hidrofobicidad. Las proteínas son retenidos luego sometidos a una mayor superficie de ionización por láser de desorción tiempo de vuelo espectrometría de masa (SELDI-TOF/MS), una plataforma de proteómica susceptibles de alto rendimiento de análisis de muestras de suero (Fig. 3] (para una revisión de La tecnología ver [62]].

Uno de los primeros estudios para encontrar biomarcadores en el suero de pacientes con cáncer de mama utilizando SELDI-TOF/MS y Ciphergen ProteinChip R arrays fue llevado a cabo por Li y sus colegas [63]. Ellos estudiaron muestras de suero de 103 pacientes con cáncer de mama en diferentes estadios clínicos (fase 0 y III), 41 mujeres sanas y 25 mujeres con enfermedades benignas de mama. Ellos identificaron tres biomarcadores que podrían discriminar pacientes con cáncer de mama de la noncancer pacientes con alta sensibilidad (93%) y alta especificidad (91%). Estos tres fueron seleccionados utilizando biomarcadores etapa 0-I noncancer cáncer versus controles establecidos como la capacitación y más tarde-como el cáncer de la etapa de prueba con el fin de identificar y tratar las fases iniciales de cáncer de mama biomarcadores. Los biomarcadores, sin embargo, no fueron sensibles a las fases de los pacientes con cáncer. Por lo tanto, estos marcadores parece reflejar la naturaleza maligna del tumor más que a su progresión. Se obtuvieron resultados similares en un estudio de las proteínas séricas de 49 pacientes con cáncer de mama, 51 pacientes con enfermedades benignas de mama y 33 mujeres sanas [64]. Mediante una combinación de la proteómica y la bioinformática, cuatro candidatos biomarcadores de cáncer de mama se encontraron y fueron utilizados en la elaboración de modelos de diagnóstico. Los cuatro putativo marcadores podrían utilizarse para distinguir entre los pacientes con cáncer de mama y las mujeres que estaban sanos o tenían enfermedades benignas de mama.

SELDI-TOF/MS análisis de las proteínas séricas también pueden potencialmente ser aplicados para identificar a los pacientes que se beneficiarían de distintas terapias de cáncer de mama, así como los que la experiencia los efectos adversos causados por la quimioterapia no utilizados en el cáncer de mama. En uno de esos estudios, las proteínas con pesos moleculares de 7790 y 9285 Da fueron detectados en 5 pacientes tratados con docetaxel, pero no se detectaron en un paciente que sufrió graves, graves efectos adversos [65]. Pusztai y sus colegas [66] aplica SELDI-TOF/MS proteómicos para investigar los cambios en el plasma de 69 Stage I-III carcinoma de mama los pacientes tratados con paclitaxel o 5-fluorouracilo, doxorubicina y ciclofosfamida (FAC), la quimioterapia y 15 sujetos sanos. Se detectó un solo pico inducida por la quimioterapia que, sin embargo, no se correlacionan con la respuesta tumoral, así como otros cinco picos que se pudieran distinguir los pacientes con carcinoma de mama de mujeres sanas normales.

Al igual que con muchos de estos estudios iniciales, la normalización y validación independiente utilizando un mayor número de especímenes se requiere para garantizar el cumplimiento de estos biomarcadores seleccionados [67]. Aunque mucho más que se tiene que hacer para validar posibles biomarcadores descubiertos en el suero de pacientes con cáncer de mama, el potencial está ahí para combinar estos biomarcadores análisis con otros procedimientos de diagnóstico para la detección temprana y el seguimiento de la respuesta al tratamiento de pacientes con cáncer de mama.

Un enfoque de la biología de sistemas para la integración de datos

El cáncer en general, y en particular el cáncer de mama, es una compleja y heterogénea enfermedad que consiste en una sucesión de cambios genéticos que a la larga los resultados en la conversión de las células normales en cancerosas. Hanahan y Weinberg han propuesto que los tumores humanos se rigen por un conjunto común de seis adquirido capacidades: 1) la autosuficiencia en las señales de crecimiento, 2) falta de sensibilidad a las señales anti-crecimiento, 3) la evasión de la apoptosis 4) ilimitado potencial replicativo 5; ) Sostenido angiogénesis, y 6) la invasión y la metástasis de tejidos [68]. Un completo conocimiento de estos procesos requerirá de la integración y el análisis de grandes cantidades de datos, como se está recogiendo de las actuales plataformas de genómica y proteómica, así como de las tecnologías más recientes [69].

Aunque la biología de sistemas es un campo emergente, se están haciendo progresos y una serie de métodos de cálculo se han aplicado a la complejidad biológica del cáncer. Christopher y colegas [70] han desarrollado una simulación por ordenador de una célula de cáncer humano. Estas células enteras modelos matemáticos integrar grandes cantidades de datos que incluyen a muchos que interactúan los genes, las proteínas y las proteínas modificaciones. Crearon un modelo de las redes, tanto de transducción de señales y la expresión de genes, que están involucrados en el control de la proliferación celular y la apoptosis y mostraron que éste podría ser utilizado para poner a prueba la eficacia de los fármacos, así como explorar diversos objetivos terapéuticos. Métodos computacionales también se aplica a la expresión de datos, tanto de genómica y proteómica, con el fin de desarrollar modelos de gráficas gen-proteína redes reguladoras [71]. Una serie de nuevos enfoques computacionales están siendo utilizados con el fin de incorporar y conectar los datos experimentales a fin de que los sistemas biológicos pueden ser simulados y utilizados para los ensayos hipótesis [72].

Como la biología de sistemas madura, datos que se han recopilado de diversas "micos" plataformas estará disponible para su aportación a la biología de sistemas computacionales nuevos modelos que ayuden a desentrañar la complejidad del cáncer. La aplicación de este enfoque de la biología de sistemas para el cáncer de mama tiene el potencial de dar lugar a más rápidamente el diagnóstico precoz y la individualización del tratamiento.

Conclusión

Microarray análisis de muestras de tejidos de tumores de mama ha anunciado en una nueva era de la clasificación molecular de los tumores, que se ha traducido en la identificación de subtipos específicos produciendo nuevos conocimientos sobre la predicción de los resultados enfermedad y la respuesta al tratamiento. Sin embargo, esta plataforma genómica es actualmente limitado, en su mayor parte, para el análisis de muestras de tejido tumoral congeladas, que no están fácilmente disponibles, de este modo, la prevención de los estudios de validación a gran escala que se llevarán a cabo con esta tecnología. FFPE muestras de tejidos tumorales, por lo tanto, el más importante y abundante fuente de material disponible a partir de ensayos clínicos aleatorios, que permitirá a bien controlados hipótesis de las pruebas que se llevarán a cabo.

Así, las tecnologías diseñadas para su uso con FFPE muestras son fundamentales para poner a prueba y validar las firmas de predicción de genes y biomarcadores derivados de estudios de microarrays. La posibilidad de aprovechar este recurso está empezando a tener un impacto como se ha visto en la aplicación de la qRT-PCR basada Oncotype DX ensayo a pacientes con cáncer de mama. TMAs también están siendo utilizados en el análisis y la validación de biomarcadores descubiertos mediante microarrays. Tecnología más moderna, como el DASL ensayo, que últimamente, mantiene la promesa de ampliar aún más la utilización de estos tejidos preciosos recursos para ambas pruebas y la validación de biomarcadores potenciales. Además, la proteína de la tecnología chip, en relación con SELDI-TOF/MS ha abierto todo el campo de la proteína patrón de análisis de fluidos biológicos, en general, y en particular el suero. Esta plataforma de proteómica ha mostrado promesa en el descubrimiento de biomarcadores para el diagnóstico precoz y el seguimiento de la progresión de la enfermedad.

El camino hacia la individualización del tratamiento para pacientes con cáncer de mama no es fácil, con muchas vueltas y revueltas que será necesario un entendimiento de copiosas cantidades de datos generados a partir de las dos plataformas de genómica y proteómica. La integración de todos estos datos usando un enfoque de la biología de sistemas también será crucial en la extracción de la información necesaria que finalmente conducirá a una comprensión detallada de cáncer de mama.

Estamos dejando a un pasado donde el paciente recibió la mejor terapia basada únicamente en la eficacia clínica histórico de los datos obtenidos de grandes poblaciones de pacientes, pero sin ningún pronóstico de la respuesta individual. Estamos entrando en una era en la que todos y cada paciente recibirá el tratamiento individualizado basado en la señalización de las vías principales de conducción de su tumor, creemos que un enfoque combinado plataforma que integra tanto la genómica y la proteómica de manera sistemática es fundamental para avanzar hacia este objetivo.

Abreviaturas

AO, adyuvante en línea

BCL2, LLC de células B / linfoma 2

BRCA1 / 2, el cáncer de mama 1 / 2, de aparición temprana

CA IX, la anhidrasa carbónica IX

CD117, v-kit Hardy-Zuckerman 4 oncogén viral felina sarcoma homólogo

CDK, ciclina quinasa D

CK5 / 6, citoqueratina 5 / 6;

C-Myc, v-myc myelocytomatosis oncogén viral homólogo

Cox-2, la ciclooxigenasa-2

DASL, cDNA mediada Annealing, de selección, la extensión y la Ligadura

DFS, la supervivencia libre de enfermedad

EGFR, receptor del factor de crecimiento epidérmico 1

ER, receptor estrogénico

FFPE, fijado en formol e incrustados parafina -

FISH, hibridación in situ por fluorescencia

GHI, Genomic Health Incorporated

HDAC, histona deacetilasa

HER2, el receptor del factor de crecimiento epidérmico 2

Ki67, antígeno identificado por el anticuerpo monoclonal Ki-67

LN, los ganglios linfáticos

MINDACT, microarrays de nodo negativo enfermedad puede evitar la quimioterapia

MUC, mucina

NSABP, nacional quirúrgico adyuvante de mama y de intestino proyecto

AINE, no esteroides anti-inflamatorio

OS, la supervivencia global

P16, ciclina-quinasa dependiente inhibidor 2A

P21, ciclina-quinasa dependiente inhibidor 1A

P27, ciclina-quinasa dependiente inhibidor 1B

P53, la proteína p53 supresor tumoral

P63, la proteína p63 tumor

PGR, los receptores de progesterona

PTEN, y tensin fosfatasa homólogo

QRT-PCR, transcriptasa reversa cuantitativa reacción de polimerasa en cadena

RS, la recurrencia Resultado

SELDI-TOF/MS, de superficie mayor de ionización por láser de desorción tiempo de vuelo espectrometría de masas

TMA, microarrays de tejidos

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MA BLJ y co-escribió el examen y aprobó el manuscrito final.

Agradecimientos

Queremos dar las gracias a Joe Garsetti de Illumina Inc para que nos permita utilizar las cifras de la DASL ensayo.