Plant Methods, 2006; 2: 2-2 (más artículos en esta revista)

Un pétalo breakstrength metros de Arabidopsis abscisión estudios

BioMed Central
A Kevin Lease (leasek@missouri.edu) [1], Cho Ki Sung (skcho011@missouri.edu) [1], de John Walker C (walkerj@missouri.edu) [1]
[1] Division of Biological Sciences, 303 Life Sciences Center, University of Missouri, Columbia, MO 65211, USA

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Resumen
Antecedentes

Abscisión está regulado lanzamiento de la planta de órganos, como las hojas o pétalos de flores. Este proceso incluye un desglose de la pared celular entre las capas de células de abscisión en la zona, causando el órgano a desprenderse. La planta modelo Arabidopsis thaliana sufre órgano abscisión floral. Diversos métodos experimentales se han utilizado para el estudio de Arabidopsis floral abscisión de órganos, incluida la medición de la pétalo breakstrength, o la cantidad de fuerza necesaria para tirar un pétalo del recipiente. Pétalo breakstrength cuantitativos proporciona una idea de la integridad física de la zona de abscisión de pétalos.

Resultados

Hemos desarrollado un pétalo breakstrength metros, que permite la rápida adquisición de datos en un ordenador personal. Se presenta el diseño del dispositivo y mostrar su utilidad en la medición de Arabidopsis pétalo breakstrength abscisión de estudios.

Conclusión

Este pétalo breakstrength metros debería permitir a los investigadores a realizar el pétalo breakstrength ensayo como una parte rutinaria de la caracterización de los factores genéticos y ambientales que afectan a abscisión.

Antecedentes

El fenómeno de los árboles caer sus hojas en otoño es un ejemplo de abscisión familiar a la mayoría de la gente. Abscisión, el derramamiento de planta regulada órganos, puede implicar la pérdida de otros órganos además de las hojas de plantas, como los pétalos de flores. En el nivel celular, abscisión implica una separación entre las capas de células de abscisión en la zona, lo que permite una planta órgano de separar [1, 2]. Para que se produzca la separación de manera controlada, no se debe regular la expresión de las enzimas que participan en desglosar los componentes de la pared celular en el medio laminillas.

Un potente método de identificación de los componentes de la abscisión de reglamentación ha sido el estudio de mutantes de Arabidopsis thaliana que afectan a este proceso. A diferencia de muchas plantas, Arabidopsis no arrojar sus hojas. Sin embargo, no se someten a Arabidopsis órgano abscisión floral, como la caída de pétalos. Al identificar mutantes con alteraciones de abscisión, productos de genes y vías importantes en abscisión se han descubierto. Por ejemplo, la percepción de etileno ha demostrado ser importante en esta respuesta [3]. Además, ACTIN RELACIONADOS CON PROTEIN7 (ARP7) knockdowns expuesto retrasado abscisión floral [4]. Además, un receptor de superficie celular que participan en la abscisión es HAESA, un rico repetir leucina-quinasa del receptor [5]. Inflorescencia deficiente en Abscission (IDA), codifica una pequeña proteína secretada que es necesario para abscisión [6]. BLADE-ON-PETIOLE1 y BLADE-ON-PETIOLE2 genes afectan órgano abscisión floral [7]. Sobreexpresión de AGL15 causas abscisión defectos (Fernández et al., 2000). Adicionalmente, AUXIN RESPUESTA FACTOR1 y AUXIN RESPUESTA FACTOR2 mutantes también afectan abscisión [8, 9].

Para comprender la base mecanicista de la abscisión defectos de estos mutantes de Arabidopsis, varios enfoques experimentales se han utilizado. Por ejemplo, la zona de abscisión ha sido visualizado por microscopía [6]. Además, la expresión de un reportero moleculares asociados a zonas de abscisión ha sido objeto de investigación [3]. Otro ensayo que se ha utilizado en un subconjunto de Arabidopsis abscisión estudios es el pétalo breakstrength ensayo [10, 6, 3]. En este ensayo, la fuerza necesaria para tirar un pétalo del recipiente se mide. Este ensayo cuantitativo da una idea de la integridad física de la zona de abscisión. Por ejemplo, si la zona de abscisión es defectuoso, más fuerza puede ser necesario tirar de la pétalo abscisión situación que si se ha activado.

Parte de la razón de este ensayo sólo se ha empleado en un subconjunto de Arabidopsis abscisión estudios puede ser que el dispositivo necesario para realizar el ensayo no es una pieza de equipo de laboratorio. Además, no hay off-the-shelf de productos que se pueden comprar para realizar el ensayo, sino que debe ser construido por el investigador. Un pétalo breakstrength metros ha sido brevemente descrita por Patterson y Bleecker (2004), que consistía en una FORT10 estrés transductor (World Precision Instruments, Sarasota, FL), y un voltímetro. Otros datos de los dispositivos sólo se han publicado una tesis doctoral en el capítulo [11], y así no están ampliamente disponibles. Cuando se trata de construir un pétalo breakstrength metros, que inicialmente trató de la compra FORT10 transductor, pero nos encontramos con que el dispositivo ya no está en producción y no se encontraba disponible. Por lo tanto, hemos diseñado el pétalo breakstrength metros alrededor de otro sensor de fuerza que se encuentra en producción, la MLT050 (ADInstruments, Colorado Springs, CO). Nos dio el pétalo breakstrength metros una característica adicional: la adquisición de datos de alta velocidad y de la tala a un ordenador personal. El diseño y la utilización de nuestra pétalo breakstrength metros debería permitir a otros investigadores para construir el metro para sus estudios de abscisión.

Resultados
Funcionamiento básico del dispositivo en el pétalo breakstrength ensayo

El pétalo breakstrength metros consiste en una pinza de pétalos, un sensor de fuerza, un circuito electrónico y una computadora personal (Figura 1A]. El pétalo pinza cuelga desde el final de una tira de aluminio de 5 cm adjunto a la fuerza transductor (Fig. 1B]. El usuario primero empuja hacia abajo en el muelle de émbolo de la pétalo pinza para difundir la pinza consejos aparte (Fig. 1C] A continuación, la pinza consejos se coloca alrededor de la flor de pétalos y el émbolo es liberado, permitiendo que las puntas de moverse en y apretar El pétalo (Fig. 1D]. Los datos son adquiridos a través del puerto serie de un PC utilizando el sistema operativo Windows XP, funcionando la aplicación HyperTerminal incluido en Windows. El puerto COM asociado con el medidor y se selecciona la siguiente comunicación de seleccionar la configuración: es 9600 baudios, 8 bits de datos, 1 bit de parada, sin flujo de datos. El dispositivo adquiere la tensión de más de 100 mediciones por segundo, dando de alta resolución temporal de medición durante el ensayo. Los datos son capturados y guardar en un archivo en la computadora utilizando la función de captura de texto HyperTerminal. Se inicia la captura de texto, la inflorescencia es derribado suavemente hasta que se la sacó de pétalos de la flor (Fig. 1E], y luego se detiene la captura de texto.

Explicación del circuito

El ensamblado del circuito se muestra en la Figura 1F y un esquema del circuito en la figura 2. El transductor de fuerza MLT050 utiliza un puente de Wheatstone circuito para convertir la fuerza aplicada a un potencial de tensión. Un potencial de voltaje se aplica a una diagonal del puente para el dispositivo de excitación y de la diferencia de potencial a través de la otra diagonal es el sensor mide la salida. Cuando el sensor cantilever es deprimido, la resistencia de la cepa del puente sensible resistencias es alterado, el cambio de la producción potencial. Una sola oferta amplificador operacional configurado como un amplificador diferencial se utiliza para amplificar la señal del sensor. Un microcontrolador incrustado, el Microchip PIC18F452, se utilizó para realizar la señal analógica a digital (ADC) y la conversión de serie a la salida de la comunicación de datos a un ordenador. El 18F452 tiene un 10 bit ADC, por lo que con 5 V de voltaje de referencia, este producto tiene una resolución de aproximadamente 5 mV. El MAX232 convierte el transistor-transistor (TTL) de las señales del microcontrolador RS232 a niveles necesarios para la comunicación en serie con el ordenador personal. El 7805C ofrece un 5 V CC regulado de suministro de sensores de excitación, ADC de referencia de voltaje, y el poder de las otras fichas. Aunque hemos utilizado un transformador de 9 V pared por el poder, el poder alternativa sería proporcionada por una batería de 9 V.

El microcontrolador se programó con un programa escrito en Picbasic (Figura 3], compilado utilizando a la asamblea Picbasic Pro Compiler (microEngineering Labs, Inc, Colorado Springs, CO), y se usa para programar el PIC18F452 utilizando un programador PIC (K128 USB Flash Pic programador, KitsRUs, http://www.kitsrus.com]. La asamblea versión del programa está disponible como datos complementarios a esta publicación. Alternativamente, el microcontrolador programado que se puede solicitar a los autores por un precio nominal para cubrir el costo de la pieza y el envío.

MLT050 Mejora de la sensibilidad del sensor a las pequeñas fuerzas

El MLT050 transductor de fuerza tiene un rango de 0 - 50 gramos y los productos de una señal de tensión que varía linealmente con la fuerza aplicada. Sin embargo, desde la salida de voltaje del sensor es tan pequeño (a los 5 V dispositivo de excitación, 50 g de la fuerza aplicada provoca un rendimiento de menos de 100 mV), directamente medir el voltaje de salida del sensor no es ideal. Medición directa de la salida del sensor impediría detectar sutiles diferencias en el pétalo breakstrength que puedan existir entre abscisión defecto mutantes.

Arabidopsis pétalo breakstrength requiere varios gramos o menos equivalentes de la fuerza (Butenko et al., 2003). Para mejorar la sensibilidad de la medición para que esta gama de medición, que presentó dos características de diseño. En primer lugar, hemos utilizado mecánica de palanca para mejorar la sensibilidad. A 5 cm de largo tira de aluminio en la que los pequeños agujeros fueron perforados en ambos extremos se emplea como una palanca (Fig. 1B]. La tira fue fijada para el sensor con un tornillo y la tuerca. En segundo lugar, la amplificación lineal de señal de tensión de salida del sensor por un factor de 100 utilizando un amplificador operacional (Fig. 2]. Estos elementos permitieron a la metros a tener una mayor sensibilidad a las pequeñas fuerzas y mayor exactitud en la fuerza gama de intereses.

Sensor de archivo adjunto a través de los pétalos Arabidopsis pétalo pinza

Debido al minúsculo tamaño de las flores de Arabidopsis, adjuntando el sensor físicamente a una flor de pétalos era una cuestión difícil de diseño. Inicialmente se trató micro-clips cocodrilo, pero comprobó que eran demasiado grandes y engorrosos. En lugar de ello, utiliza un clip que está diseñado para conectar a las piernas de un dispositivo de montaje en superficie (SMD) integrado chip, llamado un "SMD grabber". Las puntas de los off-the-shelf SMD grabber resultaron ser demasiado brusco y multa. Como consecuencia de ello, durante el ensayo, la flor de pétalos en lugar de la lágrima que se retiraron de la flor. Estamos superglued ~ 1 mm de largo piezas de aislamiento del cable calibre 20 largo de las puntas de los SMD grabber (Fig. 1C-E]. Esta modificación se extiende la presión de los SMD grabber consejos para una mayor superficie de la flor de pétalos, y se solucionó el problema de pétalos lagrimeo. El pétalo de agarre va unido al sensor a través de una breve pieza, de 20 de cable de cobre trenzado calibre pasado por el SMD grabber émbolo y el agujero perforado en el extremo distal de la tira de aluminio de 5 cm (Figura 1B].

Dispositivo de validación: linealidad de la respuesta

A pesar de que la tensión debe variar linealmente con respecto al peso, es importante probar esto directamente. Por ejemplo, es formalmente posible que los circuitos utilizados para la amplificación de la señal que podría causar distorsiones en caso de exceso de ganancia se utilizó, lo que resulta en una desviación de la linealidad. Para probar la linealidad del dispositivo, que estableció un estándar de la curva (figura 4A]. La linealidad de la pétalo breakstrength metros fue excelente, con un coeficiente de correlación de 1, indicando que no establezcan ningún tipo de distorsión en la fuerza gama de intereses. Sobre la base de la ADC 10 bit de resolución con una tensión de la resolución de 4,8876 mV (5000 mV/1023), y mediante el mismo tipo de ecuación de la curva, el pétalo breakstrength metros tiene una fuerza de la resolución de aproximadamente 25 mg.

Dispositivo de validación en el pétalo breakstrength ensayo

Para mostrar la alta resolución de adquisición de datos y visualizar los datos de un ensayo de la grabación, nos dibujan la tensión típica de las mediciones de un pétalo breakstrength ensayo (Figura 4B]. La tasa de adquisición de datos es mayor de 100 mediciones por segundo. Durante el pétalo breakstrength ensayo, la tensión se observa a la altura como el pétalo es arrastrada hasta el momento en que el pétalo separa del recipiente. Tras el pétalo tirando, el voltaje brevemente fluctúa como la palanca vibra con un movimiento armónico antes de establecerse a los niveles basales.

Hemos probado nuestra pétalo breakstrength metros en el pétalo breakstrength ensayo para ver si los valores que mide son comparables a los reportados en la literatura (Fig. 4C]. Por ejemplo, nuestro medirse valor medio de 2,24 gramos para la posición de dos pétalos de flores está cerca de la gama de la fuerza (~ 1,75 g, 2,5 g y ~ ~ 1,75 g, respectivamente) reportados por Fernández et al. (2000), Butenko et al. (2003), y Patterson y Bleecker (2004) en wildtype pétalo breakstrength ensayos. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que nuestro dispositivo de pétalo breakstrength ensayo realizado de manera similar a la de dispositivos preexistentes.

Para evitar visualmente la búsqueda de la grabación de archivos capturados por la fuerza que hace que el pétalo de separar, hemos desarrollado un sencillo script de Perl llamado findforces.pl informes que el máximo valor medido (Fig. 5]. Esto permite que se pétalo breakstrengths formato en un único archivo delimitado por tabulaciones de importación en Excel u otro software de análisis estadístico.

Discusión

Hemos demostrado el diseño y la utilización de un pétalo breakstrength metros de Arabidopsis abscisión estudios. La descripción detallada de este dispositivo debe permitir a otros investigadores para construir el medidor de modo que la medición de pétalo abscisión breakstrength se convertirá en una rutina de ensayo en el estudio de nuevos mutantes. Con exclusión de la computadora personal, el costo de las piezas utilizadas en la construcción (Tabla 1], es de aproximadamente $ 300 con el sensor es la parte más cara única. Montaje del dispositivo requiere un cautín y alrededor de dos horas de tiempo. Por lo tanto, el costo y el tiempo necesarios para el montaje de los pétalos breakstrength metros no son prohibitivos.

Hemos considerado varias futuras mejoras técnicas del dispositivo. Por ejemplo, usando un ADC de 16 bits externa en lugar de a bordo de los 10 bit ADC en el PIC18F452 permitiría mediciones de mayor resolución. En términos de velocidad de adquisición de datos, la transmisión de datos en serie es la tasa de limitación de paso. Dos métodos pueden ser empleados para mejorar esta velocidad. En primer lugar, una mayor velocidad de, por ejemplo, cristal de 20 MHz podría ser utilizado para fichar en el PIC, de manera que una tasa más elevada de comunicación en serie pueden ser usados en forma confiable. Alternativamente, el dispositivo puede ser modificado para enviar la tensión de medición como dos bytes de datos binarios, en lugar de una cadena multibyte de caracteres ASCII que representa el decimal versión de los datos. Este cambio sería bastante fácil de incluir en ella sólo pretenden modificar el firmware del chip, en lugar de modificar el circuito de hardware.

En principio, el pétalo breakstrength metros hemos diseñado podría ser fácilmente adaptado para la medición de la integridad física de muchos otros materiales (biológicos o no biológicos). La principal limitación es la capacidad de conectar el tema de interés para el sensor. Otra consideración en el contexto de la modificación del circuito para otras aplicaciones es el rango de sensibilidad del dispositivo. La cantidad de amplificación de voltaje se puede modificar fácilmente mediante la sustitución de los 10 K ohm resistencias acompañado con otras resistencias de los valores. Otra forma de modificar la sensibilidad es simplemente cambiar la longitud de la palanca adjunta al sensor incorporado de cantilever.

Conclusión

Hemos elaborado y puesto a prueba un nuevo pétalo breakstrength metros que ofrece un avance significativo en el pétalo breakstrength de ensayo utilizados en estudios de Arabidopsis abscisión. Esto debería permitir a los investigadores a hacer de este ensayo una parte rutinaria de su caracterización de mutantes abscisión. Además, el dispositivo puede encontrar aplicaciones imprevistas en los ensayos de la participación de las mediciones científicas de la integridad física de otros materiales.

Métodos
Dispositivo de montaje

Los componentes electrónicos se obtuvieron de los proveedores que figuran en el cuadro 1. Esta lista se da por conveniencia, y no debe interpretarse de leer que las piezas sólo pueden ser obtenidos de las fuentes dijo (con la excepción de la fuerza transductor). Múltiples suplente vendedores de las piezas que se pueden encontrar mediante la búsqueda en Internet.

En el caso de que el PIC18F452 no está disponible, el PIC18F4520 puede ser utilizado como una alternativa sin modificar el circuito o Picbasic código fuente. El programadas dispositivo se puede obtener a partir de la solicitud correspondiente autor. Otra posibilidad es que el PIC programados se pueden adquirir de un servicio de programación de CFP proveedor de servicios (por ejemplo, http://www.glitchbuster.com].

El circuito fue montado sobre una soldadura breadboard. Después de confirmar que todo estaba funcionando correctamente, el circuito fue montado sobre una placa perforada de prototipos, utilizando un cautín y un cable calibre 20 para las conexiones puente. La palanca está a 5 cm de largo x 0,5 cm de ancho x 0,1 cm de espesor de la pieza de aluminio que fue cortado de un trozo de aluminio con estaño snips, martilladas plana, y de 1 mm de diámetro de los agujeros fueron perforados alrededor de 3 mm de cada extremo.

Pétalo breakstrength ensayo

Una curva estándar (voltaje en función del peso) se generó por la medición de la tensión de forma secuencial generado con varios objetos (clips) de los que se sabe el peso suspendido de la pinza de pétalos. El voltaje medido sin pesos adicionales adjunto se restará de los voltajes de todos los pesos, para corregir el peso de la contribución de la pinza y la palanca de pétalos. Los datos se ajustaron a una curva lineal con Microsoft Excel para obtener los y = mx + b ecuación. Cuando un desconocido (es decir, un pétalo de atracción) se mide, la tensión observada (después de realizar la mencionada tensión de la resta del peso de la garra y la palanca de pétalos solo) se utilizó para calcular los gramos equivalentes de la fuerza utilizando la curva estándar. El pétalo tirando se realizó manualmente. El valor máximo de tensión a partir de la adquisición durante tirando pétalos se utilizó para calcular el pétalo breakstrength. Se utilizó 3,5 semanas de edad Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia plantas que se cultiva a una temperatura de 22 ° C Temp 16 h con 100 μ molm -2 s -1 luz / 8 h oscuridad. El pétalo podía observarse en la mordaza de la pinza tras pétalo tirando, como una confirmación visual de que el pétalo no escapa o desgarro durante el ensayo (Fig. 1E].

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

KL diseñado y construido el breakstrength metros, SKC realice la breakstrength ensayos, y JCW contribuido a la idea de un medio de transporte barato, accesible breakstrength metros. Todos los autores ayudó a redactar el manuscrito, se han leído y aprobado el manuscrito final.

Agradecimientos

Damos las gracias a Jason Doke para inventar la palanca y para ordenar los suministros. Damos las gracias a los miembros de la Walker laboratorio para comentarios sobre el manuscrito. Apoyo a la SKC fue proporcionada por el post-doctoral del Programa de Becas de Investigación Básica del Fondo de Promoción de la Fundación de Investigaciones de Corea (M01-2004-000-10035-0). JCW fue a la financiación proporcionada por NSF 2010.