Particle and Fibre Toxicology, 2006; 3: 5-5 (más artículos en esta revista)

In vitro de citotoxicidad Manville Código 100 fibras de vidrio: Efecto de la longitud de fibra en los macrófagos alveolares humanos

BioMed Central
Patti Zeidler C-Erdely (paz9@cdc.gov) [1], William J Calhoun (wjcalhou@utmb.edu) [2], Bill T Ameredes (btamered@utmb.edu) [2], Melissa P Clark (clarkmp @ Upmc.edu) [2], Gregory J Deye (gjd2@cdc.gov) [3], Paul Baron (pab2@cdc.gov) [3], William Jones (vic1@cdc.gov) [4], Terri Blake (Trblake@earthlink.net) [1], Vicente Castranova (vic1@cdc.gov) [1]
[1] Laboratorio de la División de Efectos sobre la Salud, Instituto Nacional de Seguridad y Salud, Morgantown, WV, EE.UU.
[2] AAARC, de la División Pulmonar, alérgicos, y de la Medicina de la Universidad de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, EE.UU.
[3] de la División de Investigación Aplicada y Tecnología, Instituto Nacional de Seguridad y Salud, Cincinnati, OH, EE.UU.
[4] División de Estudios de Enfermedades Respiratorias, Instituto Nacional de Seguridad y Salud, Morgantown, WV, EE.UU.

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Resumen
Antecedentes

Fibras vítreas sintéticas (SVFs) noncrystalline materiales inorgánicos son ampliamente utilizadas en entornos industriales y residenciales de aislamiento, la filtración, refuerzo y propósitos. SVFs convencionalmente incluyen tres categorías principales: fibra de vidrio, de roca / escoria / piedra (mineral) de lana, cerámica y fibras. Anteriores estudios in vitro de nuestro laboratorio demostraron que dependen de la longitud de efectos citotóxicos de fibras de vidrio en los macrófagos alveolares de ratas que fueron posiblemente asociados con la fagocitosis incompleta de las fibras ≥ 17 μ m de longitud. El propósito de este estudio fue examinar la influencia de la longitud de fibra en primaria humanos macrófagos alveolares, que son más grandes en diámetro que los macrófagos de rata, utilizando longitud-clasificados Manville Código 100 fibras de vidrio (8, 10, 16, y 20 μ m). Se completa la hipótesis de que engulfment de fibras por los macrófagos alveolares humanos podría disminuir la citotoxicidad de fibra, es decir, las fibras más corto que puede ser completamente sumido podría no ser tan citotóxica como ya fibras. Macrófagos alveolares humanos, obtenidos por lavado broncoalveolar segmentaria de sanos, no fumadores voluntarios, fueron tratados con tres diferentes concentraciones (determinado por el número de fibras) de las fibras de tamaño in vitro. Citotoxicidad se evaluó mediante el control de lactato deshidrogenasa citosólica liberación y pérdida de función, como se indica por una disminución en zymosan estimulada quimioluminiscencia.

Resultados

El análisis microscópico indicó que los macrófagos alveolares humanos completamente sumido fibras de vidrio de los 20 μ m de longitud. Todas las fracciones de fibra de longitud igual a prueba exhibidos por citotoxicidad en una base de fibra, es decir, el aumento de lactato deshidrogenasa y la disminución de quimioluminiscencia en la misma concentración que dependen de la moda.

Conclusión

Los datos sugieren que debido al mayor diámetro de los macrófagos alveolares humanos, en comparación con ratas macrófagos alveolares, completa ya la fagocitosis de las fibras puede ocurrir con las células humanas. Ni fagocitosis incompleta ni que dependen de la longitud se observó toxicidad en fibra macrófagos humanos expuestos culturas. En contraste, los macrófagos de rata expuestos tanto incompleta fagocitosis de las fibras largas y la duración que dependen de la toxicidad. Los resultados de los humanos y de células de rata estudios sugieren que engulfment incompleta puede aumentar la citotoxicidad de fibra de vidrio. Sin embargo, la posibilidad no debe descartarse que las diferencias entre los humanos frente a los macrófagos que no sea rata diámetro de células podría ser responsable de las diferencias en los efectos de fibra.

Antecedentes

Fibras vítreas sintéticas (SVFs) noncrystalline materiales inorgánicos son ampliamente utilizadas en entornos industriales y residenciales de aislamiento, la filtración, refuerzo y propósitos. SVFs convencionalmente incluyen tres categorías principales: fibra de vidrio, de roca / escoria / piedra (mineral) de lana, cerámica y fibras [1]. La composición química de los materiales fibrosos que se conoce a desempeñar un papel en la toxicidad inducida por fibra fibra como biodurability se correlaciona directamente con el potencial patógeno de roedores [2], pero también se ha sugerido que la longitud de fibra es un factor importante. En el pasado, el estudio de la longitud de fibra como causa de la toxicidad se ha complicado por la imposibilidad de obtener puro tamaño de las muestras seleccionadas de fibra. Sin embargo, el desarrollo de la dielectrophoretic clasificador por Baron y sus colegas han ayudado en el estudio de monodisperse tamaño de las muestras seleccionadas de fibra de pulmón de células y la activación de toxicidad [3]. Este clasificador separa por fibras de longitud con dielectrophoresis que implica el movimiento de partículas neutras en un gradiente de campo eléctrico [3, 4]. Roedores y activación de los macrófagos de toxicidad han sido previamente demostrado in vitro en nuestro laboratorio el uso de estas longitud de las fibras y, de hecho, clasificados, la longitud de fibra es un factor determinante [5 - 7].

Frustrado o incompleta fagocitosis ha sido implicado como mecanismo de citotoxicidad inducida por la fibra. Este proceso incluye los reiterados intentos por un fagocito con hundir una fibra más largo que su diámetro, con lo que, posiblemente, el mejoramiento de su actividad respiratoria ráfaga [8]. En comparación con fibras cortas que son totalmente sumergidos, ya fibras puede causar sostenida activación celular fagocítico y aumentar el reclutamiento en el espacio aéreo, a los que posteriormente el aumento de la carga oxidante pulmón [9 - 11]. De hecho, varios in vivo e in vitro de roedores estudios sugieren ya las fibras son más patógenas que las cortas fibras [12 - 14]. Sin embargo, el tamaño de los macrófagos es pertinente cuando la investigación de la toxicidad de fibra macrófagos alveolares humanos porque son más grandes en tamaño que los macrófagos alveolares de rata, aproximadamente el 18 y 13 μ m de diámetro promedio, respectivamente [15]. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue examinar la influencia de la longitud de fibra en primaria humanos aislados macrófagos alveolares, que son más grandes en diámetro que los macrófagos de rata, con longitud de 100 Código clasificados Manville (JM-100), fibras de vidrio (8, 10, 16, y 20 μ m). Respiratorios ráfaga de la actividad y las fugas citosólica de lactato deshidrogenasa (LDH) se utilizaron como parámetros de activación y de toxicidad, respectivamente. El análisis microscópico se realizó para determinar si se había producido la fagocitosis frustrada. Una comparación a los resultados obtenidos utilizando los macrófagos alveolares de rata se haga. Desde esta investigación empleados una vez de un sistema de flujo, la solubilidad de la fibra cuestiones no se abordan.

Resultados
Fibra de vidrio inducido LDH

La figura 1 muestra de fibra de vidrio sobre la citotoxicidad inducida por los macrófagos alveolares humanos, medido por el ensayo de LDH 18 horas después de tratamiento in vitro. La longitud de la fibra a prueba (8, 10, 16, y 20 μ m) exhibió la igualdad de todos los efectos citotóxicos. Estos efectos no fueron significativamente diferentes entre los grupos de la longitud de fibra de la misma concentración, es decir, la longitud de fibra no afectó a la citotoxicidad en el rango de longitudes de evaluación. Una tendencia hacia una concentración-respuesta se observó aunque esto no alcanzó significación estadística. El cuadro 1 muestra los efectos de la longitud de fibra de vidrio en los macrófagos alveolares de rata que se informó anteriormente [7]. Significativos de toxicidad, medida como% del total de LDH, se produjo con el largo (17 μ m) de fibra de vidrio, pero una menor de fibra (7 μ m) mostraron poco o ningún efecto tóxico.

De fibra de vidrio de la inhibición inducida por zymosan estimulada quimioluminiscencia

Zymosan estimulada quimioluminiscencia, como% del grupo control, se muestra en la Figura 2. Zymosan, partículas β-glucano de paredes celulares de levadura, se utiliza para estimular la producción de especies reactivas de los macrófagos alveolares humanos expuestos a fibras de vidrio durante 18 horas in vitro. Los datos muestran una disminución dependiente de la concentración en la activación de macrófagos (es decir, la producción de especies reactivas) con el aumento de la concentración de fibra. Longitud de la fibra no afectan significativamente humanos función de los macrófagos alveolares. Es interesante señalar la menor concentración de fibras causó un cebado (71% de aumento en la activación) de las células humanas para liberar especies reactivas, en respuesta a zymosan mientras que la mayor concentración provocó un 84% de pérdida de la activación. Cuadro 2, la adaptación de las Blake et al., Representa la disminución de la activación por ciento versus control observado en ratas después de los macrófagos de fibra de vidrio de exposición de 18 horas [7]. En contraste con las células humanas, la rata macrófagos muestran claramente la función oxidativa disminuido con el aumento de la longitud de fibra, con el 17 μ m de fibra tiene un efecto más fuerte (100% de pérdida de la activación) que el 7 μ m de fibra (15% de reducción de la activación). Además, no se observó celular cebado en la rata macrófagos, en comparación con los humanos.

Examen microscópico de primaria humanos macrófagos alveolares

Figura 3, grupo A, demuestra la capacidad de los macrófagos humanos con hundir 8 μ m fibras de vidrio in vitro. Figura 3, grupo B, macrófagos humanos demuestra que el éxito puede hundir 20 μ m fibras de vidrio. Los datos de Blake et al. Reveló incompleta fagocitosis por los macrófagos alveolares de rata producido con fibras de vidrio ≥ 17 μ m de longitud [7]. Estos resultados sugieren humanos macrófagos alveolares puede completamente phagocytize longitud de la fibra de ratas que no pueden los macrófagos alveolares. Por lo tanto, frustrado fagocitosis y sus posibles efectos no parecen ser un factor con macrófagos alveolares humanos expuestos a fibras ≤ 20 μ m de longitud.

Discusión

El presente estudio firmado un contrato con un sistema in vitro para exponer primaria humanos macrófagos alveolares a monodisperse JM-100 fibras de vidrio de diferentes longitudes de meta. Mediante este sistema, los macrófagos alveolares humanos Se evaluó la longitud celular dependiente de los efectos y los resultados fueron comparados con datos previos obtenidos con ratas macrófagos alveolares. Los datos presentados aquí, muestran diferencias en las respuestas de los macrófagos humanos frente a la rata a fibras de vidrio de distinta duración.

Estudios anteriores han demostrado que la rata y el ratón alveolar macrófagos peritoneales intento de hundir fibras de vidrio y que el éxito de la fagocitosis está influenciado por la longitud de fibra [5, 7]. Corto (7 μ m), fibras de vidrio fueron completamente sumergidos, mientras que a largo (17 μ m), fibras de vidrio fueron sólo parcialmente sumergidos. Macrófagos alveolares humanos tienen un diámetro más grande de la rata de contraparte, por lo que se aventura la hipótesis de que estos fagocitos hundir por completo las fibras más largo y la ausencia de fagocitosis frustrada que atenuar la citotoxicidad. En general, los datos que apoya esta hipótesis.

Humanos función de los macrófagos alveolares, medida como zymosan estimulada quimioluminiscencia, se vio considerablemente afectada por la concentración de fibra, pero no la longitud de fibra en el rango de 8-20 μ m (Figura 2]. El menor de las tres concentraciones de fibra (4 × 10 5 fibras / ml o 1:1 fibra: proporción de células) cebados la respuesta celular a zymosan mientras que la concentración más alta (4 × 10 7 fibras / ml o 80:1 fibra: proporción de células) Disminución de la respuesta de este control. El nivel de activación de las células expuestas a la concentración de fibra intermedia (4 × 10 6 fibras / ml o 8:1 fibra: proporción de células) fue similar a la de los controles). En cambio, nuestros resultados anteriores no mostraron efecto de aumento de cebado JM-100 fibras de vidrio en los macrófagos alveolares de rata en cualquier concentración. Esta respuesta diferencial entre humanos y ratas, las células pueden ser el resultado de varios factores. En primer lugar, la fibra hasta la celda ratio se ha demostrado en nuestro laboratorio a ser importante en la activación de los macrófagos de roedores. Estudios anteriores revelaron una proporción de fibra a la célula de al menos 5:1 es necesaria para la importante factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) en la producción de ratón macrófagos [5]. La fibra efectiva a la proporción de células encontradas para obtener los macrófagos humanos celulares cebado en este estudio fue 1:1. Aproximadamente un 1:2.5 fibra a la proporción de células (10 6 fibras / ml) fue utilizado como una baja concentración en la rata macrófagos estudios reportados por Blake et al., Que no han sido lo suficientemente alta, que prime la respuesta celular a zymosan encima de control Después de la fagocitosis de fibra corta [7]. En segundo lugar, luminol fue utilizado como potenciador de la luz en el presente estudio, pero lucigenin se utilizó en el estudio de células de ratas. Luminol detecta múltiples especies reactivas frente a lucigenin, que es un potenciador luz superóxido específicos [16 - 18]. Lo más probable es que, superóxido no es el único oxidante producida en fibra de vidrio de las células expuestas. Por lo tanto, este sistema experimental puede tener un mayor nivel de detección en comparación con el pasado. Por último, el resultado puede reflejar diferencias inherentes en la producción de oxidantes de rata y humanos macrófagos alveolares. Macrófagos alveolares humanos están más activos que la rata en la producción de especies reactivas después de la exposición de partículas [19]. Si este es el caso de fibras de vidrio se necesita más investigación.

Se encontró que la longitud de fibra no se asociaron con una concentración o membrana celular según la evaluación de los daños citosólicas LDH liberación en el sobrenadante celular aunque una tendencia dependiente de la concentración era evidente (Figura 1]. Castranova et al. Informó de los efectos de los iones metálicos en partículas estimulado el consumo de oxígeno y en los macrófagos alveolares quimioluminiscencia, es decir, ensayos funcionales, se produce a concentraciones que no afectan a la integridad de la membrana celular [20]. Por lo tanto, una razón para la falta de una importante concentración de LDH-respuesta puede ser que la función celular es típicamente afectados antes de que el daño de membrana quimioluminiscencia respuesta más sensibles medida de efectos citotóxicos.

En resumen, este estudio no informó de efectos de la longitud de fibra en el rango de 8-20 μ m sobre la respuesta de los macrófagos alveolares humanos. Esto no coincide con los datos anteriores, donde el aumento de la concentración de fibra de vidrio disminuyó quimioluminiscencia y el aumento de la LDH en los macrófagos alveolares de rata, pero que dependen de la duración principales efectos son evidentes. La razón de esta discrepancia es más probable debido a la mayor diámetro de los macrófagos alveolares, lo que resulta en la falta de fagocitosis frustrada en el actual sistema experimental. El análisis microscópico verificado estas células fueron capaces de hundir aún más largo de la fibra muestra de la prueba (20 μ m) (Figura 3B]. Blake et al. Celular demostrado efectos en ratas macrófagos alveolares (diámetro ~ 13 μ m), utilizando 17 y 33 μ m de fibras de vidrio, de aproximadamente 4-20 μ m más largo que las células (macrófagos múltiples rata se observan a menudo se adhirieron a un largo de fibra con la fibra que aparecen a sobresalir a través de la Membrana celular) [7]. En el presente estudio, el más largo de la fibra muestra utilizada fue de 20 μ m, sólo el 2 μ m más largo que los macrófagos alveolares humanos diámetro celular, por lo que no constituye una longitud suficiente para causar frustrado fagocitosis. En consecuencia, se necesita de más estudios utilizando fibra de las muestras en un radio de 20-40 μ m de longitud. Suponiendo mecanismos similares están involucrados en humanos y ratas fibra fagocitosis, los resultados más probables de acuerdo con los reportados por Blake y colegas.

Conclusión

Este estudio pone de manifiesto: 1.) De una ausencia de duración asociada a la citotoxicidad de los macrófagos alveolares humanos primaria, que previamente se observó en los macrófagos alveolares de ratas tratadas in vitro con longitud de las fibras de vidrio clasificado 2.) Un posible mecanismo para esta ausencia de citotoxicidad dependiente de la longitud Puede ser la falta de frustrados fagocitosis en macrófagos humanos frente a la de la rata 3.) Macrófagos alveolares humanos parecen ser activadas por fibras de vidrio de monodisperse longitud de fibra en una proporción de las células de alrededor de 1:1, mientras que la citotoxicidad significativa sólo se observó a un Excesivamente alto de fibra: de células ratio de 80:1. En conclusión, el uso de monodisperse longitud de las muestras se clasificaron fibra ayuda en la determinación de la longitud de fibra específicos que pueden englobar macrófagos. Además, estos datos preliminares puede ayudar en el diseño de futuros experimentos in vivo utilizando partículas fibrosas.

Métodos
Fibra muestras

Lotes de las muestras de vidrio JM-100 (Manville código 100 suministrados por John Mansville Corporation) fueron molidos, en aerosol, la duración y dividido en categorías utilizando dielectrophoresis como ha sido descrito previamente [3, 4]. El dielectrophoretic clasificador fue operada en un modo diferencial a fin de que las fibras con estrechas distribuciones de longitud se extrajeron en una suspensión de aire al final del clasificador. Estos longitud de la fibra clasificada, se recogieron muestras de policarbonato (Nuclepore) filtros en las tasas de hasta 1 mg / día. Las fibras se desprendieron los filtros para análisis microscópicos y de los experimentos biológicos.

Las muestras de la longitud de las fibras clasificados fueron preparados para el tamaño y contar con el análisis añadiendo pesaron porciones de polvo para recién agua filtrada. Estas muestras fueron diluidas y filtrada a través de filtros de policarbonato. Las mediciones de longitud, el ancho y contar con fibra / masa se hicieron utilizando un JEOL JSM-6400 microscopio electrónico de barrido (Tabla 3]. Las mediciones en cada ampliación se hace referencia a un Instituto Nacional de Estándares y Tecnología de microscopía electrónica de norma.

Todas las muestras de fibra fueron esterilizadas con calor y almacenadas a 4-6 º C. Antes de cada experimento, las fibras se suspendieron en estériles Ca +2 + Mg +2 libre de búfer fosfato salino (PBS).

Humanos, el lavado broncoalveolar

Macrófagos alveolares humanos fueron recogidos por un procedimiento estándar en la Universidad de Pittsburgh. En resumen, un total de seis sujetos sanos de sexo masculino entre las edades de 20 y 40 años fueron reclutados para el estudio. Todos firmaron una declaración de consentimiento informado aprobado por la Universidad de Pittsburgh la Junta de Revisión Institucional de la Investigación Biomédica. Los sujetos fueron seleccionados por la historia, examen físico y espirometría. Todos los sujetos tenían que exhibir la espirometría normal, y no tienen antecedentes de asma o de las enfermedades alérgicas. Prueba cutánea de las respuestas a un grupo de 15 alérgenos comunes, además de fosfato de histamina como control positivo (Greer Laboratories, Lenoir, Carolina del Norte), fueron determinados utilizando el método prick-punción. Cualquier objeto de una demostración de un test cutáneo positivo a un alergeno, se considerará que la enfermedad atópica y fue excluido. La broncoscopia y el lavado broncoalveolar (BAL) se realizaron de acuerdo a los métodos publicados [21 - 23]. En pocas palabras, los sujetos fueron ligeramente sedados con midazolam 1,0 mg y 0,5 mg de atropina IM, meticuloso y anestesia local de la nasofaringe se obtuvo utilizando el 4% cocaína solución, lidocaína al 1% por gárgaras, y un 1% de benzocaína aerosol. Adicional tópica de lidocaína al 1%, a través del canal de broncoscopio de trabajo, se aplicó a las cuerdas vocales y las vías respiratorias mucosa. Dosis total de lidocaína emitido por debajo de las cuerdas vocales fue en todos los casos, menos de 200 mg. El broncoscopio se adelantó para el lóbulo superior derecho, y wedged en un subsegmento del segmento anterior. BAL se realizó utilizando dos alícuotas de solución salina estéril (0,9% NaCl, 37 ° C, 60 ml cada una), recuperado por parte de aspiración. El broncoscopio fue entonces trasladado a un subsegmento del lóbulo medio derecho, segmento medial, y BAL se volvió a realizar. Las células fueron recuperados de BAL líquido por centrifugación a 400 × g durante 15 minutos y la bolita de células resultante se lavó una vez con Hanks Balanced Salt Solution (Sigma, St Louis). Las células se contaron usando un hemocitómetro y ajustado a 2 × 10 6 células / ml en Hanks Balanced Salt Solution. Diferencial de células se realizaron en Diff-Quick manchadas cytocentrifuge diapositivas, y ≥ 300 células fueron identificados como los macrófagos alveolares, linfocitos, eosinófilos, neutrófilos o. Viabilidad por exclusión con azul de tripan siempre superó el 95%, y las poblaciones de células en exceso de 95% macrófagos alveolares, con el saldo de la población compuesto por linfocitos. Neutrófilos rara vez se observa como son los eosinófilos. En voluntarios sanos, la depuración de más de gradientes de Percoll discontinuo es innecesario [23].

Primaria de los macrófagos alveolares humanos zymosan estimulada quimioluminiscencia

Humanos macrófagos alveolares se chapada en un blanco opaco 96-así placa en el 1 × 10 5 células / así en 200 μ l de estériles de Eagle modificado esenciales medio (Biowhittaker, Walkersville, MD) sin rojo fenol complementado con un 2% de calor de suero bovino fetal inactivado , 1 mM glutamina, 100 unidades / ml penicilina / estreptomicina, y 10 mM HEPES a pH 7,2. Después de 2 horas de incubación a 37 ° C, las células adherentes se lavaron tres veces con los medios de comunicación cálido. Fibras de vidrio (8,10,16, o 20 μ m) se añade a las células en tres diferentes concentraciones de fibra determinado por el número: 4 × 10 5, 4 × 10 6, y 4 × 10 7 fibras / ml. Culturas fueron llevados a un volumen final de 200 μ l, y cada tratamiento se realizó por duplicado. Después de 18 horas a 37 ° C, la placa fue centrifugada y el sobrenadante cosechada y mantener en hielo para su posterior análisis. Warm-HEPES solución tamponada (pH = 7,4) fue añadido a la macrófagos alveolares en el plato y zymosan estimulada quimioluminiscencia se midió. La sustancia lumigenic luminol (1 mM) fue añadido a todos los pocillos de la placa de ensayo seguido de zymosan (2 mg / ml) o HEPES de búfer solución a un volumen final de 220 μ l /. Quimioluminiscencia se midió a 460 nm utilizando una microplaca quimiluminómetro (ML 3000 Microtiter Plate Luminometer, Dynatech Laboratories, Chantilly, VA) durante 30 minutos y el total de cpm por así por 30 minutos fue grabado. Zymosan estimulada quimioluminiscencia se calculó como la estimuló (con zymosan) menos el valor correspondiente no (sin zymosan) valor.

La actividad de lactato deshidrogenasa

LDH actividad se determinó en el sobrenadante la cultura mediante la supervisión de la LDH de catalizador de oxidación de piruvato, junto con la reducción de NAD a 340 nm utilizando un kit comercial y una Cobas Mira Plus Transferencia Analyzer (Roche Diagnostics Systems, Montclair, NJ).

El análisis microscópico

Fotografías de los macrófagos alveolares humanos se tomaron Olympus IX70 utilizando un microscopio de luz invertida equipado con una cámara Dage.

El análisis de los datos

Todos los datos fueron analizados mediante un análisis de varianza (ANOVA) modelo con una diferencia significativa define como p ≤ 0,05. Pares diferencias se evaluaron mediante la adecuada contrastes.

Abreviaturas

BAL lavado broncoalveolar

JM-100 Manville Código 100 Fibras de vidrio

LDH lactato deshidrogenasa

ND no detectado

PBS Solución salina tamponada con fosfato

SEM microscopio electrónico de barrido

SVFs fibras vítreas sintéticas

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

PCZE llevó a cabo la citotoxicidad in vitro, estudios, analizados los datos, y redactó el manuscrito. El Congreso Judío Mundial, BTA, y siempre que el MPC macrófagos humanos y prestó asistencia en el diseño del estudio y la coordinación. GJD PB y siempre que la longitud de fibra clasificada con ayuda de muestras y análisis en fibra. WJ realizó el análisis de fibra y prestó asistencia en el diseño del estudio. TB realizado estudios con ratas macrófagos alveolares. VC concibe el estudio, participaron en su diseño y ayudó en la coordinación y la preparación manuscrito. Todos los autores leído y aprobado el manuscrito final.

Renuncia

Los resultados y conclusiones de este informe son las de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista del Instituto Nacional de Seguridad y Salud.