Journal of Experimental & Clinical Assisted Reproduction, 2006; 3: 4-4 (más artículos en esta revista)

Un mecanismo propuesto para la progesterona trofoblasto MMP2 regulación de la transcripción independiente de la respuesta de los elementos clásicos de progesterona sobre su promotor

BioMed Central
Shlomit Goldman (ngnc@walla.com) [1], Eliezer Shalev (shaleve@tx.technion.ac.il) [1]
[1] Laboratory for Research in Reproductive Sciences, Department of Obstetrics and Gynecology, Ha'Emek Medical Center, 18101, Afula, Israel
[2] Facultad de Medicina Rappaport, el Technion-Instituto de Tecnología de Israel, Haifa, Israel

Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0], que permite el uso irrestricto, la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que la obra original sea debidamente citada.

Resumen
Antecedentes

La progesterona actúa como ligando del receptor de factor de transcripción inducible en las respectivas células blanco por su unión a elementos de respuesta específicos de la progesterona en el promotor de los genes diana. Sin embargo, a pesar de la falta de la clásica respuesta de la progesterona sobre elementos de la matriz metaloproteinasa-2 promotor, la progesterona ha demostrado que disminuye la actividad de este promotor

Presentación de la hipótesis

Recientemente se ha sugerido que, además de interactuar con sus clásicos co-activadores y co-represores, los receptores de progesterona son capaces de unirse a varios factores de transcripción. Al interactuar con otras clases de factores de transcripción, los receptores de progesterona es capaz de transcripcional a través de la activación de factores de transcripción de ADN afines sitio de unión.

Prueba de la hipótesis

La exploración de factores de transcripción y transcripción sitios de unión, la interacción con los receptores de la progesterona en la modulación de la matriz metaloproteinasa-promotor.

Consecuencias de la hipótesis

Identificación de nuevos genes diana endógena de progesterona permite seguir explorando los mecanismos de señalización de la hormona que regula las acciones biológicas. Por otra parte, los conceptos de ligando impulsada conformacionales diversidad y selectiva de tejidos que pueden llegar a ser explotadas en el futuro para el desarrollo de medicamentos que regulan selectivamente los receptores huérfanos de la familia de receptores nucleares.

Antecedentes

Los efectos fisiológicos de la progesterona son clásicamente mediada por la interacción de la hormona con los dos clásicos intracelular del receptor de progesterona (PR) isoformas PR-Ay PR-B [1]. Ambas isoformas, codificada por un solo gen reglamentado de manera independiente por separado promotor, regular diferentes subconjuntos de genes [1, 2].

PR actúa como ligando-inducible factor de transcripción en los respectivos destinatarios de células por medio de la unión de elementos de respuesta específicos de la progesterona (PRE) en el promotor de los genes diana [1, 2]. Estas interfaces transcripcional responder no sólo a los endocrinos, sino también a paracrina y autocrina quizás señales [1 - 3]. La participación de múltiples mecanismos de regulación selectiva de la expresión de receptores afines y su unión a elementos de respuesta específicos de la hormona, la progesterona asegurar que la transducción de señales resultará en una precisa reglamentación de las respectivas redes de genes [1 - 4]. El tipo de PR-isoforma dicta las proteínas complejas composición para incluir diversos factores de transcripción, co-activadores o co-represores responsables de la remodelación de la cromatina específicas [5]. Cuando se expresa en equimolar ratios en las células, la PR-Ay PR-B se une a las proteínas del PRE y dimerize como tres especies: A: A ó B: homo-dímeros o A: B heterodimers. Cada combinación puede modular diferentes conjuntos de genes. Isoformas del receptor de progesterona son miembros de una gran familia de receptores nucleares estructuralmente relacionadas (NR) super-familia de factores de transcripción [6]. El PR isoformas se caracterizan por la organización en los ámbitos funcionales específicas y se conservan, en distintos grados, entre las especies y los miembros de la familia [6, 7]. PR contiene tres dominios funcionales entre ellas la N-terminal, situado en una zona céntrica de dominio vinculante ADN (DBD), y C-terminal de dominio vinculante ligando (LBD) [7]. Tridimensionales de las estructuras atómicas aisladas DBD y LBD han puesto de manifiesto los motivos comunes de estas regiones. El dominio N-terminal es la región menos conservada entre los miembros de la familia con respecto a la duración y secuencia de aminoácidos. La N-dominio funcional es importante, ya que es necesaria para la plena actividad transcripcional de los receptores de hormonas esteroides y de muchas células, y la meta de genes específicos de las respuestas. Esteroides han transcripción de activación de los receptores de dominios (AF) que se encuentran en el dominio N-terminal (AF-1) y en la C-terminal LBD (AF-2). Estas son autónomas transferibles dominios necesarios para el ADN vinculados a los receptores de transmitir una respuesta de activación transcripcional y funcionan como sitios de unión específicos para co-activadores. La actividad altamente conservadas de la AF-2 es hormono-dependientes y exige la liberación de proteínas de choque térmico que conduzca a cambio conformacional y la dimerización de receptores [6 - 8]. Amino terminal de la región entre los miembros de la super-familia es la más variable de hiper-región en términos de tamaño y la secuencia de aminoácidos. Estudios en humanos indican que PR PR-A isoforma se carece de los primeros 164 aminoácidos en el amino-terminal. En la PR-B isoforma esta región contiene, además de AF-1, un tercer transactivation dominio (AF-3) que los reclutas no sólo co-activador de proteínas, sino también servir como un inhibidor de dominio encarga de la contratación de inhibidor transcripcional co-represor Proteínas. La presencia de la AF-3 dominio en la PR-B, y su falta de otras isoformas es probable que sea responsable de la diferencial transactivation propiedades que contribuyen a completar el repertorio de respuesta fisiológica a la progesterona [6 - 8]. Detallada estructura o función estudios en el ser humano indican que isoformas PR PR-B funciona como un ligando-dependiente transactivator en contraste con el PR-A, que en algunos contextos, actúa como un ligando-dependiente represor transcripcional de la PR-B, así como de Otros receptores de hormonas esteroides [6 - 8]. Los receptores de progesterona regula la transcripción mediante la contratación de co-activadores o co-represores complejos a los promotores de genes objetivo. Co-activadores de contratación por ligando sujetos receptores nucleares (NR) son miembros de la familia SRC de la co-activadores, como SRC-1, SRC-2 y SRC-3, [9 - 11]. Estas proteínas sirven como adaptadores de la actividad transcripcional de rupias a través de diferentes motivos conservados denominado NR cajas [9 - 11]. El SRC familia ha sido estudiado ampliamente [9 - 11]. Motivos dentro de la interacción de los receptores de dominio de SRCs se han demostrado para determinar co activador de las preferencias específicas de rupias, mientras que la activación transcripcional de dominios SRCs mediar en la interacción con las histonas (HAT) acetyltransferases responsable de la remodelación de la cromatina [9 - 11].

Contrariamente a la gran cantidad de co-activadores de los receptores de progesterona, sólo dos se caracteriza así co-represores se han descrito, el SMRT (mediador para silenciar a los receptores de ácido retinoide), y un huérfano de receptores nucleares DAX-1 (dosis de la inversión de sexos, hipoplasia adrenal Congénita en la región crítica del cromosoma X, el gen 1) [12, 13].

Ambos co-represores se describe como eficaz represores de agonistas dependientes de la actividad de PR. SMRT PR reprime en presencia de una de las progestinas o antagonista de los receptores de progesterona RU486 [12, 13]. DAX-1, sin embargo, la represión de PR en presencia de progestinas, pero exhibió frente a la corregulación, cuando la obligación de los patrones de la antagonista de los receptores de progesterona [12, 13]. Recientemente se documentó que, además de interactuar con sus clásicos co-activadores y co-represores del receptor de progesterona puede unirse a varios factores de transcripción [14 - 16]. La interacción directa entre activado PR proinflamatorias y el factor nuclear factor-B, se ha demostrado que el resultado de la represión transcripcional de reciprocidad [14 - 16]. La interacción funcional entre PR y liganded C / EBP β se encontró para mediar en la mejora de dPRL (decidua prolactina) promotor de la actividad en respuesta a la progestina tratamiento. En estudios de asociación-vitro han demostrado que las dos isoformas PR físicamente interactuar con la C / EBP β isoformas, el hígado enriquecido activador de proteínas (LAP) y el hígado enriquecido proteína inhibidora (LIP). Se documentó que aumenta la PR-A PAL transeuropeas de la activación de un modelo C / EBP-responda reportero construir, así como el promotor dPRL proximal, y la PR-B-dependientes de la transcripción de los promotores impulsado por palindrómicas PRE se ve reforzada por LIP. Estos datos revelan la singular complejidad de C / EBP β y PR acoplamiento transversal [14, 15].

El elemento básico de transcripción de la proteína de unión (BTEB1), un miembro de la Sp / Krüppel-como la familia (KLF), de factores de transcripción [15, 16] se describe también como PR-B interacción de proteínas. En presencia del ligando activado-PR-B, la funcional complejo formado entre la PR-B dimmer y BTEB1 favor de la inducción del PRE-que contienen promotores. BTEB1 no tiene efectos sobre la PR-A transactivation pero aumenta la PR-A-mediada la represión de la PR-B actividad transcripcional. BTEB1 se encontró a cooperar con el transcripcional integrador de la proteína de unión de CREB (CBP) [14 - 16] el aumento de la actividad transcripcional de ligando determinada y PR-B-liganded PR-A. Además, el factor de transcripción Sp1 también se encuentran para interactuar con PR-B, en concreto la regulación transcripcional [14 - 16].

Este manuscrito describe, utilizando trofoblasto como modelo, una hipótesis que sugiere que la progesterona puede regular los genes que carecen de PRE en la región a través de su promotor mecanismo alternativo.

Presentación de la hipótesis

Se acepta en general que afecta a la progesterona metaloproteinasas de matriz (MMP) en la secreción de muchos tejidos reproductivos [17 - 19]. Varios estudios han demostrado que la progesterona restringe ruptura del tejido endometrial mediante la inhibición de la estimulación de las metaloproteinasas de la matriz [17 - 21]. En presencia de la progesterona, la secreción de MMP9 del trofoblasto se redujo [20]. A principios humanos de células trofoblásticas (hasta 8 semanas de gestación) MMP2 progesterona inhibe la expresión directa de la regulación transcripcional [21]. Diferencial perfil de los receptores de progesterona se documentó con el dominio de los PR-B, a principios de trofoblasto y dominio de PR-A fines de trofoblasto (entre 9 a 12 semanas de gestación). Este perfil diferencial es compatible con el efecto inverso de la progesterona sobre las dos poblaciones de células y la disminución de la invasión gelatinasa expresión en los primeros humanos trofoblasto (hasta 8 semanas de gestación) y el aumento de la invasión y gelatinasa expresión a fines del trofoblasto humano (entre el 9 y el 12 semanas de gestación). MMP2 disminución de la actividad promotora a principios de células trofoblásticas expuestos a la progesterona sugiere que MMP2 expresión está regulada por la progesterona también en el nivel transcripcional [21]. Varios estudios de cartografía de los posibles elementos de respuesta sobre MMP2 promotor sugiere la existencia de los ocho principales elementos de respuesta. Sin embargo, parece que el promotor carece de MMP2 PRE [22, 23], por lo tanto, el nuevo mecanismo por el cual la progesterona puede inhibir la expresión MMP se sugiere. Además de la activación transcripcional directo a través de la unión de los receptores activados con sus afines de ADN elemento de respuesta (Figuras 1A], PR es capaz también de la activación transcripcional interactuar con otras clases de factores de transcripción de ADN afines en su sitio de unión (Figura 1B]. Por lo tanto, vinculantes para PRE consenso no es necesariamente requerida para P-capacidad de respuesta de los genes diana. Estos mecanismos permiten la doble función de la diferencia de cada uno de los receptores en la regulación transcripcional de genes específicos, ya sea de forma directa o vinculante por la interacción con los factores de transcripción específicos a determinadas regiones vinculante en el promotor. Después de examinar la respuesta potencial elemento promotor MMP2 en dos posibles factores de transcripción los miembros de la familia se proponen sobre la base de datos publicados anterior: C / EBP y SP-1. Factores de transcripción de ambos se encontraron elementos de respuesta para interactuar con PR-B, así como la PR-A. Sugerimos que en estos casos la progesterona actúa como co-activador o co-represor. Esta propuesta novedosa función de los receptores de progesterona en la regulación transcripcional poolof amplía el gen candidato, que se rige por la progesterona.

Prueba de la hipótesis

Con el fin de probar la hipótesis propone dos series de experimentos deben llevarse a cabo. Basado en la publicación del efecto inhibitorio de la progesterona sobre MMP expresión y la falta de PRE en MMP promotor es preferible utilizar uno de los miembros de esta familia de genes como objetivo poner a prueba la hipótesis. Proponemos utilizar células trofoblásticas como modelo de regulación de la progesterona MMP promotor reglamento.

Objetivo específico 1: Localización progesterona respuesta región / s en MMP promotor
Objetivo específico 2: Identificación de los sitios de unión de transcripción y factores de transcripción que participan en la modulación de progesterona: funciones relativas de las isoformas del receptor de progesterona

Objetivo Específico 1 proporcionará una determinación física de la obra (s) presente en el MMP promotor transcripcional que regulan la respuesta a la progesterona. Vamos a analizar estos sitios para potenciales factores de transcripción con la TransFac / TESS bases de datos (24). Estos algoritmos de búsqueda predecir los posibles factores de transcripción basada en similitudes con motivos definidos vinculante. La validez de los factores de transcripción candidato se evaluó mediante ensayos de cambio de movilidad electroforética (EMSA), inmuno-precipitación cromatina (ChIP) y co-transfección. Para EMSA, etiquetados oligonucleótidos correspondientes a la progesterona físicamente identificado elementos reguladores en el promotor MMP se incubaron con extractos de los tratados nucleares (progesterona) y sin tratar células trofoblásticas. DNA-proteína se resolverá sin encuadernar de oligonucleótidos no denaturating por electroforesis en gel y autorradiografía. Secuencia especificidad de la proteína nuclear / oligonucleótido interacción será confirmado por la competencia con oligonucleótido frío y por mutagénesis sitio-específica de los principales factor de transcripción vinculante secuencia. La confirmación de la identidad de los factores de transcripción que exhiben secuencia específica de la interacción con los oligonucleótidos se determinará utilizando anticuerpos supershift EMSA, en el que los anticuerpos a los candidatos factores de transcripción están incluidos en la mezcla de incubación. Formación de anticuerpos / factor de transcripción complejos con el oligonucleótido lleva a una nueva disminución de la movilidad electroforética (de ahí "supershift").

ChIP es una poderosa técnica que demuestra la ocupación de los elementos reguladores de genes promotores de la genómica dentro de contexto, lo que demuestra que el gen intrínseco se rige por estos factores. ADN de control y células tratadas P-está aislado, y esquilada por ultrasonication inmuno-precipitado con anticuerpos específicos a los factores de transcripción. Tras la digestión de las proteínas, la inmuno-se precipitó fragmentos de ADN amplificado por PCR y secuenciado para confirmar la recuperación de la secuencia deseada. Controles adecuados se utilizan en cada paso del proceso y de grados relativos de ocupación se puede determinar por densitometría de los productos de amplificación de PCR con biotina.

Para confirmar que la funcionalmente identificado factores de transcripción regulan MMP transcripción de hecho, vamos a realizar co-transfección de la adecuada MMP luciferase reportero construye con el aumento de las concentraciones de expresión de la codificación de los plásmidos identificados factores de transcripción.

Consecuencias de la hipótesis

El proceso de traducción de la investigación básica al desarrollo de productos farmacéuticos de la terapéutica depende de los nuevos enfoques. Proponemos que PR es capaz de funcionar también como factor de transcripción independiente de la presencia del PRE. La identificación de nuevos genes endógenos PR objetivo permite seguir explorando los mecanismos de señalización que regula la progesterona acciones biológicas.

Los conceptos de ligando impulsada conformacionales diversidad y selectiva de tejidos que pueden llegar a ser explotadas en el futuro para el desarrollo de medicamentos que regulan selectivamente los receptores huérfanos de la familia de receptores nucleares.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

Ambos autores conciben la hipótesis, la SG redactado ms, y ES editado el ms.