Proteome Science, 2006; 4: 9-9 (más artículos en esta revista)

Proteómicos identificación de Drosophila melanogaster accesorio masculino glándula proteínas, incluyendo un pro-catepsina y una soluble γ-glutamil transpeptidasa

BioMed Central
Michael J. Walker (bgymjwa@leeds.ac.uk) [1], Caroline M Rylett (bgycm@leeds.ac.uk) [1], Jeff N Keen (jnkeen@leeds.ac.uk) [1], Neil Audsley (N.audsley @ csl.gov.uk) [2], Sajid Mohammed (sajid@cgl.ucsf.edu) [3], Alan D Shirras (adshirras@lancaster.ac.uk) [4], R Elwyn Isaac ( Reisaac@leeds.ac.uk) [1]
[1] Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Leeds, Leeds, LS2 9JT, UK
[2] Grupo de Biología Ambiental, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York YO41 1LZ, UK
[3] Sandler Center for Basic Research in Parasitic Diseases, Department of Pathology, University of California San Francisco, HSW501 San Francisco, CA 94143, USA
[4] Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Lancaster, LA1 4YQ, UK

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Resumen
Antecedentes

En Drosophila melanogaster, el macho fluido seminal contiene proteínas que son importantes para el éxito reproductivo. Muchas de estas proteínas son sintetizadas por el macho glándulas accesorias y se secretan las glándulas accesorias en el lumen, donde se almacenan hasta que se precise. Estudios anteriores sobre la identificación de las glándulas accesorias Drosophila productos han centrado en gran parte en la caracterización de los hombres concretos glándula accesoria de ADNc D. Melanogaster y, más recientemente, Drosophila simulans. En el presente estudio, hemos utilizado un enfoque de la proteómica sexo sin ningún tipo de sesgo a identificar las proteínas en D. Melanogaster secreciones de las glándulas accesorias.

Resultados

Trece proteínas secretadas por las glándulas accesorias, incluyendo siete nuevas proteínas de las glándulas accesorias, fueron identificados por electroforesis en gel de 2D combinada con espectrometría de masas de los fragmentos de tríptico. Entre ellos figuraban el plegado de proteínas-y el estrés-respuesta proteínas, una hormona, una lipasa, una serpin, una proteína rica en cisteína y dos peptidasas, un pro-forma de la enzima catepsina K-peptidase como la cisteína y la γ-glutamil transpeptidasa. Enzimática estudios establecido secreciones de las glándulas accesorias que contienen una cisteína peptidase zymogen que pueden ser activados a bajo pH. Este peptidase puede tener un papel en el tratamiento de mujeres y hombres de otras proteínas de origen, pero es poco probable que participe en la tramitación de la péptido sexual. Γ-Glutamyl transpeptidases tipo II son proteínas integrales de membrana, pero los identificados AG γ-glutamil transpeptidasa (GGT-1) es inusual en el sentido de que se prevé que sea un proteínas solubles secretadas, una predicción que cuenta con el apoyo de pruebas bioquímicas. GGT-1 es posiblemente implicadas en el mantenimiento de un entorno de protección redox de esperma. El fuerte γ-glutamil transpeptidasa encuentra en la actividad de las secreciones se ofrece una explicación para la observación de que el ácido glutámico es el más abundante de aminoácidos libres en las secreciones de las glándulas accesorias D. Melanogaster.

Conclusión

Hemos aplicado criterios bioquímicos, no utilizados anteriormente, para caracterizar prominente D. Melanogaster accesorio glándula productos. De los trece proteínas secretadas por las glándulas accesorias en este estudio, seis estuvieron representados en un D. Simulans accesorio masculino glándula EST biblioteca que fue sesgado de los hombres genes específicos. Por lo tanto, el presente estudio ha identificado siete nuevas proteínas secretadas por las glándulas accesorias, incluyendo GGT-1, que no fue reconocido previamente como un producto secretan las glándulas accesorias.

Antecedentes

El macho glándulas accesorias (AGs) de Drosophila melanogaster son necesarios para la fertilidad masculina [1, 2]. Son responsables de la síntesis y secreción de una gran cantidad de fluido seminal proteínas, muchas de las cuales no han sido caracterizados estructuralmente o funcionalmente. Los más estudiados son hombres AG productos específicos de las proteínas (Acps) que trate de obtener múltiples efectos fisiológicos y de comportamiento después de un acoplado mujeres [3]. Estas influencias incluyen masculino aumento de la tasa de puesta de huevos, la reducción de atractivo a los hombres, el rechazo de cortejo los machos, mejor almacenamiento de esperma y una reducción de la vida útil de mujeres [3]. Las alteraciones en el comportamiento de las hembras acoplado pueden durar hasta una semana y este efecto a largo plazo depende de la transferencia de los espermatozoides, así como líquido seminal. El sexo péptido (Acp70A) es en parte responsable de la obtención a corto plazo respuestas de las mujeres y el único responsable de la ya duradera después de los cambios en el comportamiento femenino acoplado [4, 5]. Este último efecto depende de la presencia de espermatozoides que llevan el sexo péptido vinculados a la superficie de los espermatozoides colas [6]. El péptido está amarrado sexo lentamente-liberado de la esperma por proteolítica de la división N-terminal vinculante desde el dominio C-terminal de la secuencia, en el que figura la señal de la etapa posterior a la respuesta de apareamiento [7]. Un segundo producto AG (ovulin, ACP26Aa) participa también en el estímulo de las primeras respuestas de las mujeres en el acoplado y parece tener un efecto directo sobre la ovulación [8 - 10]. Ovulin también sufre proteolisis en el tracto reproductivo femenino a la liberación de péptidos biológicamente activos, un proceso que depende de otro, aún no identificado, masculino AG producto [11]. De almacenamiento de esperma, en el post-acoplado femenina requiere Acp36DE, una glicoproteína 122 kDa que se procesa a una proteína de 68 kDa, en la femenina dentro de los diez minutos de transferencia de los varones [12 - 14].

Otros fluido seminal proteínas que han sido estudiados incluyen los inhibidores de peptidase, componentes de la clavija de apareamiento, las lipasas y anti-bacterianas péptidos (revisado en [3]]. Una etiqueta de secuencia expresada pantalla de una biblioteca de cDNA a partir de la AGs preparado de D. Simulans y enriquecido a propósito de ADNc específicas de los hombres, indica que puede haber en total más de 70 Acps en esta especie [15]. Varias clases de enzimas, incluyendo las lipasas y peptidasas, están bien representadas en el D. Simulans AG tecnologías ecológicamente racionales, como se peptidase inhibidores de las proteínas y la defensa inmune [16]. Esta información ha llevado a una nueva evaluación del número total de secretada D. Acps melanogaster, que se cree que ahora 52 [17]. Sin embargo, este número excluye AG productos, que son altamente expresado en tejidos femeninos, pero son vitales para el éxito reproductivo masculino. Anticuerpos específicos planteados a trece D. Melanogaster Acps demostró que estas proteínas masculino AG tener múltiples destinos, una vez transferidas a las del tracto reproductivo femenino, con algunas proteínas entrar en el haemolymph mujeres [18].

Ahora el informe directo de la caracterización de proteínas de los productos D. AGs melanogaster, que se resolvieron por electroforesis en gel de 2D y identificadas por espectrometría de masas de péptidos tríptico. Este estudio identifica trece AG proteínas, incluida la proteína-plegable y proteínas de respuesta al estrés, una lipasa, una proteína rica en cisteína y dos peptidasas, un pro-forma de como cisteína catepsina-peptidase soluble y un γ-glutamil transpeptidasa. Siete de estas proteínas no han sido previamente identificados como AG secretada productos. También muestran que la AG secreciones poseen peptidase cisteína y γ-glutamil transpeptidasa y de las actividades que la cisteína peptidase es sintetizado principalmente como una inactiva zymogen. La catepsina K-peptidase como cisteína es un candidato para el procesamiento de la enzima responsable de la demora en la división masculina de proteínas y péptidos en el útero de la hembra después de los acoplada.

Resultados y discusión
Identificación de proteínas secretadas AG

AG contenidos fueron analizados por electroforesis en gel de 2D-, la primera dimensión, ya sea utilizado o pH 3-10 pH 4-7 tiras de IPG (Fig. 1]. Los geles fueron teñidos Coomassie y el más intenso de proteínas resueltas puntos sometidos a la tripsina digestión y análisis de los fragmentos de péptidos por cualquiera de MALDI-MS o LC-MS/MS. Trece AG proteínas con la señal prevista para la secreción de péptidos fueron identificados con este método y sus funciones se infiere de la comparación de la estructura primaria a los miembros de las familias de proteínas con actividad biológica conocida (Tabla 1]. Casi la mitad de estas proteínas podrían ser calificadas como de la respuesta de estrés, como las proteínas o las proteínas necesarias para el eficaz y correcto plegamiento de las proteínas recién sintetizadas en el ER lumen. El otro grupo de proteínas contiene dos peptidasas, una lipasa, una proteína hormona (Acp36DE), una proteína rica en cisteína y un serpin.

Plegamiento de proteínas y proteínas de la respuesta de estrés

CG2852 (cyclophilin-like) y CG9847 (Fkbp-13) son peptidil-prolyl cis-trans isomerases que catalizan la isomerización cis-trans de peptidil-prolyl bonos en las cadenas del polipéptido. Ellos pertenecen a dos clases diferentes estructurales que son filogenéticamente conservada y se sabe que tienen múltiples funciones en el plegable, de reunión y de la trata de las proteínas celulares [19]. A pesar de que se consideran principalmente las proteínas intracelulares, algunas células de mamíferos cyclophilins secretan en el medio extracelular, donde tienen un papel importante en la mediación de respuestas celulares al estrés oxidativo y en la modulación de la inmunidad. CG6988 es una proteína disulfuro isomerasa (PDI), que contiene dos thioredoxin-como pliegues y es altamente expresado en todas las etapas de desarrollo [20]. El PDI familia de proteínas catalizan la formación, la reducción y la isomerización del sulfuro de bonos y puede proteger a las células de la muerte de la célula hipóxica [21]. Su capacidad de obligar a las cadenas de polipéptido PDI permite actuar como un chaperón molecular asistencia en el plegamiento de polipéptidos y aumentar el rendimiento de las proteínas correctamente doblada.

Otros cuatro chaperones moleculares (CG9429/calreticulin; CG4147/HSP70-3; CG2918; CG5520/Gp93) fueron identificados en este estudio de proteómicos masculino AGs. D. Melanogaster calreticulin pertenece a la familia de muy conservadas lectina-como Ca 2 + vinculante ER proteínas que tienen diversas funciones celulares en mamíferos, incluyendo la regulación intracelular de Ca 2 +, el correcto plegamiento de glicoproteínas, la integrina mediada por Ca 2 + de señalización, de la fagocitosis Y la adhesión celular [22, 23]. HSP70-3 es un BiP homólogo involucrados en el montaje en el interior de la proteína del retículo endoplasmático [24]. Gp93 es un muy conservadas de proteínas de choque térmico (HSP) de los vertebrados gp96 familia de proteínas del retículo endoplasmático. Galewsky et al. Gp93 han informado de que se acumula en las células de fronteras lo que sugiere que el D. Melanogaster proteínas pueden ser exportados de la célula a la superficie extracelular [25]. CG2918 estructuralmente es también miembro de la familia de proteínas HSP con fuerte homología a los mamíferos hasta hipoxia-ROP150 regulada de proteínas [26].

Cinco de la mencionada proteína AG-plegables y el estrés-respuesta proteínas poseen una K / HDEL C-terminal de la secuencia (el C-terminal de CG2918 es HSEL) lo que sugiere que estas proteínas son residentes en el lumen del retículo endoplasmático. Sin embargo, es bien conocido que las proteínas entrar en la vía secretora puede escapar KDEL mediada retículo endoplasmático de la retención a tener un papel funcional en la superficie de la célula o en el medio extracelular [23, 27]. De hecho, estudios recientes han demostrado que las células de la superficie del acompañante proteínas puede tener un importante papel en la reproducción de funcionamiento como moléculas de señalización intercelular que facilitan la interacción esperma-ovocito [28 - 30].

Acp36DE (CG7157), cisteína ricos en proteínas (CG17575) y serpin-3 (spn-3, CG9334)

Acp36DE (CG7157) ha sido ampliamente estudiado y demostrado que son necesarios para el almacenamiento de esperma [12, 14, 31], aunque el mecanismo por el cual esto se logra no es conocido. CG17575 se ha demostrado por la creación de modelos estructurales comparativas de ser miembro de la familia CRISP (cisteína-ricos en proteínas secretoras) [16]. Curiosamente, mamíferos CRISP-1 es secretada por la porción proximal del epidídimo, el esperma se une a la superficie, y parece ser que participan en la fusión de gametos [32]. CRISP-2 se secreta de espermatocitos y facilita una mayor unión de espermatocitos de células de Sertoli. Allurin, otro CRISP, actúa como un esperma producido por chemoattractant Xenopus mujeres como parte de la gelatina de huevos [33]. Además de estos papeles en la reproducción sugirió, CRISP proteínas de la clase CRISP-3 también podría formar parte del sistema inmune innato de defensa [34]. Planteadas a los anticuerpos recombinantes CG17575 se utilizaron en un estudio reciente para determinar el destino de la proteína en el acoplado de sexo femenino. Western blot análisis sugiere una amplia distribución para CG17575 reproductiva de la mujer en los tejidos, incluyendo el útero, oviducto y de los huevos de superficie [18], en consonancia con un posible papel en la fusión de gametos.

Dos miembros (Acp76A y Acp62F), de la familia serpin anteriormente que se sabe se hallan en el D. Melanogaster AG secreciones. La identificación de los proteómicos SPN-3, el número de D. Melanogaster AG serpinas a tres y este número podría ser una subestimación, ya que Swanson y colegas identificaron seis AG serpin genes en D. Simulans, incluida la orthologue de Spn-3 [15]. La expresión de un número de genes serpin familia en la AG probablemente refleja la importancia que el varón de controlar proteólisis por serina peptidasas en el fluido seminal [16]. Prueba de ese papel de serpinas en reproducción animal proviene de los estudios sobre los ratones machos que carecen de serpinas, PCI y nexin-1 [35, 36]. Estos animales muestran espermatogénesis anormal y malformación de la copulatory plug presumiblemente como resultado de un fracaso para controlar la actividad peptidase. Estudios inmunológicos sobre el destino de D. Melanogaster Acps en la femenina, después de la cópula, identificado CG9334 tanto en el apareamiento y el enchufe órganos de almacenamiento de esperma [18].

Ácido lipasa (CG31872)

Los AGs de D. Melanogaster se sabe son una fuente rica en un ácido capaz de lipasa cleaving triacilglicerol y, en cierta medida, ésteres de colesterol. Smith et al. Mostró que la actividad de la lipasa de los varones se redujo a la mitad después del apareamiento, mientras que la actividad en las mujeres fue acoplado de tres veces el de las moscas hembra virgen, lo que indica la transferencia en el fluido seminal a la hembra durante la cópula [37]. Nuestro análisis ha identificado la proteómica CG31872 como candidato para esta actividad. Estas enzimas pueden tener un papel importante en el suministro de energía para la movilidad del esperma por la hidrólisis de los triglicéridos en ácidos grasos libres liberación de β-oxidación. El trabajo de Mueller et al. [17] identificó cinco ácido lipasa de tecnologías ecológicamente racionales relacionadas AG D. Simulans y, por lo tanto, cabe prever que las lipasas adicional que se presente en los AGs de D. Melanogaster.

Procathepsin proteína (CG4847) y la demostración de pro-forma de cisteína en peptidase AG secreciones

CG4847 codifica una proteína que estructuralmente pertenece a la papaína (C1A) cisteína familia de las peptidasas y está relacionado con mamíferos catepsina K, L y S (Fig. 2] [38]. CG4847 tiene un peso molecular predicho de 44 kDa en su forma natural y, singularmente para este peptidase familia, dispone de una secuencia de repetición Gly-Gly-Gly-Phe/Leu cerca de la N-terminal de la proteína. BLAST búsqueda de la predicción proteínas de la Drosophila pseudoobscura genoma GA18475 identificado como una estrecha homólogo de CG4847 que comparte el 68% de identidad en el nivel de aminoácidos. El predijo D. Pseudoobscura también tiene un Gly / Leu-rica región a raíz de un péptido de señal, sin embargo esta región es más corto que en CG4847 (Fig. 2].

Cathepsins suelen ser sintetizado como inactivas en favor de los enzimas que, en condiciones favorables, de la auto-división intracelular que elimina un N-terminal pro-dominio para generar un activo peptidase de alrededor de 24 kDa en tamaño [39]. La observación de que CG4847 emigra en SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida con una masa de alrededor de 50 kDa y el hecho de que el péptido masa contenía cinco huellas dactilares de los péptidos predijo favor de los de dominio, indica que la enzima es secretada con un típico zymogen estructura (Fig. 2]. Se buscaron pruebas enzimáticos de la síntesis y secreción de un pro-cisteína catepsina peptidase por AGs masculino. AG contenidos fueron incubadas en la activación de amortiguación, antes de realizar un ensayo para C1A cathepsins utilizando el sustrato Cbz-Leu-Arg-MCA en un ensayo para la actividad peptidase. La hidrólisis del sustrato es lineal con el tiempo y se inhibió de irreversible, por dos inhibidores de la cisteína peptidasas (E64 y K11777), todos a una concentración de 10 μ M (Tabla 2]. Mamíferos en favor de la catepsina K, al igual que muchos otros cisteína peptidasas, autoactivation sufre como consecuencia de un cambio conformacional en la reducción del pH [40]. El cambio estructural inducido expone a la catepsina K pro-activa para aumentar la susceptibilidad de la pro-péptido a la división. Cuando el procedimiento para la activación de AG cisteína peptidase se realizó a 4 ° C en lugar de a 35 ° C, la actividad peptidase se redujo (cuadro 2]. Este resultado es coherente con la peptidase ser secretada como zymogen que puede ser activado en una forma dependiente de la temperatura a bajo pH. Es posible que la activación de la AG cisteína peptidase se produce después de la inseminación por autocatalysis después de experimentar un cambio en el pH en el tracto reproductivo femenino o por la exposición a otra, ya sea peptidase presentes en el fluido seminal secretada o de los tejidos reproductivos femeninos.

Un papel potencial para el CG4847 está en el procesamiento proteolítico de la hormona de precursores. La proteína predice está estructuralmente relacionada con la catepsina L mamíferos, que en vesículas secretora de células cromafines funciona como un prohormone procesamiento peptidase responsable de la producción de péptidos enkephalin [41]. La catepsina L reconoce monobásico dibásico y sitios de procesamiento con la carga positiva de las cadenas laterales de ocupación, ya sea el S1 o S1 'sub-sitios. Dos D. AG prohormones melanogaster, y el sexo ovulin péptido, se someten a procesamiento proteolítico, en el post-acoplado mujeres y en ambos casos, los residuos son básicos reconocimiento sitios de la división [7, 11]. CG4847 podría realizar una función similar a prohormone procesamiento y catepsina L participarán en la división de ambos y el sexo ovulin péptido después de la transferencia a la hembra acoplado. Hemos investigado la posibilidad de que la cisteína peptidase AG es responsable de la división de las pruebas por sexo péptido activado si la enzima puede cleave sexo péptido 1-13 (WEWPWNRKPTKFP), que contiene dos posibles sitios prohormone división, en la Arg 7-Lys 8 y Lys 11-Phe 12 péptido bonos. Análisis HPLC con detección UV (280 nm) identificó un único producto importante división que se identificó como WEWPWNRKPTK por MALDI-MS ([M + H] + m / z 1528). Esta hidrólisis fue completamente bloqueado, en presencia de 10 μ M E64, que confirma que la actividad peptidase cisteína AG era responsable. Peng et al. Han demostrado que la región N-terminal del péptido sexual es necesaria para la adhesión de espermatozoides y para el largo plazo después de la respuesta de apareamiento de las mujeres [7]. Asimismo, han demostrado que la mutación Arg 7 y el 8 a Lys Gln 7 y Gln 8 impide la liberación de sexo péptido de la superficie de la cola de los espermatozoides durante un período de 5 días, lo que sugiere que se produce proteólisis en, o cerca de, la dibásico Motivo. Desde la cisteína AG peptidase actividad es transportada Lys 11-Phe 12, que es de cuatro péptido bonos fuera de la Arg 7-Lys 8, es poco probable que la enzima tiene un papel importante en la tramitación de la péptido sexo en el post-acoplado femenino.

Γ-Glutamyl transpeptidasa (CG6461, GGT-1) y la detección de γ-glutamil transpeptidasa actividad en secreciones AG

CG6461 (GGT-1) se prevé que sea un 62 kDa γ-glutamil transpeptidasa (también conocido como γ-glutamil transferasa) y miembro de la familia de T3 peptidasas threonine [42]. Estas enzimas son abundantes en la superficie luminal y secretora de las células epiteliales de absorción y se encargan de la transferencia de γ-glutamato de glutatión reducido (GSH), glutatión conjugados y glutatión disulfuro (GSSG) a un aceptor molécula, que puede ser otro péptido, una Aminoácidos, o agua. El proenzyme sufre autocatalytic división para generar la actividad γ-glutamil transpeptidasa, compuesto de dos subunidades de alrededor de 40 kDa y 20 kDa [43]. El catalizador nucleophile es el grupo hidroxilo de la threonine encontrar en el N-terminal de la subunidad más pequeña procesados [44]. Los fragmentos AG péptido identificado en el presente estudio procede de una proteína in situ con un tamaño estimado de alrededor de 20 kDa y corresponde a secuencias dentro de la subunidad predijo más pequeños de la GGT-1 (Fig. 3]. El servidor SignalP 3,0 predice con una alta probabilidad de que la GGT-1 es un preproprotein que comprende una señal N-terminal de péptidos y de la secreción de que se trata de cleaved en el 30-Gly Leu 31 de bonos para generar un solubles, secretadas γ-glutamil transpeptidasa [45] . El predijo soluble naturaleza de la GGT-1 es raro que los miembros de esta familia de enzimas, ya que eucarióticas γ-glutamil transpeptidases suelen ser de tipo II integrante proteínas de membrana externa se encuentra en la superficies de células [42]. Hay otras tres γ-glutamil transpeptidasa genes (CG17636, CG1492 y CG4829) en el D. Melanogaster genoma, que son predicha por SignalP 3,0 para codificar las proteínas que se ajusten a una determinada estructura de la membrana. En D. Pseudoobscura, γ-glutamil transpeptidasa genes son menos en número y en la familia es representada por un secretada (GA9613) y sólo una membrana γ-glutamil transpeptidasa (GA13353): estos están estrechamente relacionados con D. Melanogaster GGT-1 y CG4829, Respectivamente.

Hemos encontrado fuerte γ-glutamil transpeptidasa actividad (28,1 ± 1,7 μ moles de p-nitroanilide liberado / h / AG; media ± error estándar de la media, n = 3) en el uso de Drosophila AG γ-glutamil-p-nitroanilide como el sustrato Donante y el dipeptide, Gly-Gly, como aceptor. Hubo un aumento lineal en la actividad enzimática, que es absolutamente dependiente de la presencia de Gly-Gly y fue inhibida por acivicin (0,4 mM, 98% de inhibición), un inhibidor selectivo de γ-glutamil transpeptidasa. La AG γ-glutamil transpeptidasa actividad no está asociado con las membranas celulares dado que la casi totalidad de la actividad de la AG homogenado se encontró en el sobrenadante después de la centrifugación a 60000 g durante 2 h (25,1 ± 2,3 μ moles de p-nitroanilide liberado / h / AG ; Media ± error estándar de la media, n = 3).

La identificación de una secreta γ-glutamil transpeptidasa en la AG es de especial interés en materia de control redox durante la reproducción. Γ-Glutamyl transpeptidasa tiene una posición central en la 'γ-glutamil ciclo ", la generación de glutamato Gly-Cys y por la división de GSH. El dipeptide posteriormente se cleaved a sus aminoácidos constituyentes [46], lo que se hace a través de la membrana plasmática y utilizados en la re-síntesis de GSH intracelular. GSH prevé la reducción de los equivalentes para la reducción de peróxido de hidrógeno y de los lípidos hydroperoxides por glutatión peroxidasas y peroxiredoxins, y es necesario para las reacciones de desintoxicación realizados por glutation S-transferasas [47, 48]. El mantenimiento de una alta concentración intracelular de GSH tanto, es importante para la prevención de lesiones a las células germinales de especies reactivas del oxígeno y xenobióticos, y depende en gran medida de la descomposición y el reciclado de compuestos GSH extracelular [48].

La soluble AG γ-glutamil transpeptidasa actividad proporciona una explicación de los niveles relativamente elevados de ácido glutámico libre que se sabe están presentes en las secreciones AG virgen de los hombres de D. Melanogaster y el aumento de glutamato en el útero después de los acoplada mujeres [49].

Conclusión

El interés en los productos de AG masculino D. Melanogaster se ha centrado principalmente en las proteínas y péptidos que son responsables de alterar el comportamiento y fisiología de las mujeres post-acoplado. Ha habido pocos estudios bioquímicos de las enzimas AG que se secretan en el fluido seminal para su transferencia a la hembra, a pesar de su importancia para la reproducción, se reconoce. La secuenciación de los hombres concretos de ADNc D. Simulans AG dio una indicación de la variedad de nuevas proteínas que pueden estar presentes en el fluido seminal de esta especie y, probablemente, otros drosophilids. Sin embargo, este estudio fue sesgada en contra de las proteínas que se expresan en los dos adultos, hombres y mujeres moscas, y no arrojar luz sobre todo después de la traducción modificaciones que podrían ser fundamentales para la actividad biológica. Hemos utilizado el enfoque complementario de la proteómica para ampliar nuestro conocimiento de las proteínas secretadas AG, principalmente enzimas y proteínas de respuesta al estrés, de D. Melanogaster. Hemos aportado pruebas de un enyzmatic inactivos cisteína proteasa y un procesado y plenamente activa γ-glutamil transpeptidasa en apoyo de los datos de la proteómica. La cisteína peptidase podría someterse a la activación en el medio extracelular y, de ser transferido a la hembra durante la cópula, puede tener un papel en el tratamiento de los varones proteínas de origen (por ejemplo, ovulin) en el acoplado de sexo femenino. D. Melanogaster está dispuesto a invertir enfoques genéticos, que ahora pueden ser utilizados para determinar la importancia y el papel preciso de la AG proteínas identificadas en la reproducción.

Métodos
Materiales

Peptidase sustratos e inhibidores, a menos que se indique lo contrario, se adquirieron de Sigma-Aldrich Co Ltd, Poole, Reino Unido K11777 (N-methylpiperazine-urea-fenilalanina-homophenylalanine-vinylsulfone-benceno) fue un regalo de los Sandler Centro de Investigación Básica en Enfermedades Parasitarias, Departamento de Patología, Universidad de California San Francisco.

Insectos

Oregon R D. Melanogaster se mantuvieron en la harina de avena / melaza / medio agar a 25 ° C con un 12:12 h luz / oscuridad régimen [50]. Para la recopilación de contenido de AG proteómicos y enzimáticos de análisis, los varones (3-5 días después de la eclosión) fueron separados de las hembras por lo menos 24 horas antes de la disección.

Proteómica

AGs (80 pares) se extirparon en helado Drosophila Ringer solución [51], o 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), que contienen inhibidores de peptidase (completa, Mini, libre de EDTA, Roche Diagnostics Ltd, Bell Lane, Lewes, East Sussex BN7 1LG). Los AGs Luego se centrifuga a 10000 g a 4 ° C para separar AG contenido de los tejidos. El sobrenadante fue eliminado y se almacena a -20 ° C hasta que se precise. Proteína muestras se procesaron en un "2D kit de limpieza" (Amersham Biosciences UK Limited, Pollards Wood, Nightingales Lane, Chalfont St Giles, Buckinghamshire). AG contenido se solubilizado en la rehidratación de amortiguación (8 M urea, el 4% (w / v) CHAPS, 50 mM dithiothreitol, 0,2% (v / v) "Bio-Lyte" Ampholytes, Bio-Rad Laboratories, 2000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547 EE.UU.) antes de remojo de cualquiera o de pH 3-10 pH 4-7 11 cm tira IPG (Bio-Rad). Isoeléctrico centrándose se realizó con un PROTEAN IEF celular (Bio-Rad) de 40000 Vh. La tira fue equilibrado en dos buffers de base (50 mM Tris / Cl, el 2% (v / v) SDS, 6 M urea, y el 20% de glicerol), que contiene 1,4 M diothiothreitol primero y luego 1,3 M iodoacetamide. La segunda dimensión utilizado prefabricados de 8-16% Tris / HCl geles (Bio-Rad) y se ha ejecutado durante 70 min a 200 V. El gel se lavó tres veces durante 15 min antes de la tinción con Coomassie ( "biosafe" Bio-Rad ) Por 3 h antes de la remoción de manchas de agua.

Manchadas manchas de proteínas se cortaron utilizando un Proteome Obras terreno-cortador (Bio-Rad) antes de que entren en 50 mM de bicarbonato de amonio y 50% (v / v) acetonitrilo. La pieza fue sonicated gel durante 10 minutos con el sobrenadante se extrae y se desecha. Esto se repitió antes de acetonitrilo y luego se agregó el gel se seca. La tripsina digerir continuación se llevó a cabo mediante la adición de 5 μ l solución de tripsina (2 ng de tripsina en 25 mM de bicarbonato de amonio) a la pieza de gel y lo que le permite ser absorbido antes de la adición de otro 5 μ l de 25 mM de bicarbonato de amonio 30 minutos más tarde. La digestión fue autorizado a proseguir durante 16 horas a 37 ° C.

MALDI-MS se realizó a través de una matriz de 5 mg de α-cyano-4-hidroxi-ácidos cinnamic en 1 ml de etanol / acetonitrilo (1:1, v / v) con el péptido ACTH utilizado como patrón interno. La matriz se mezcla con la muestra en una proporción de 1:1 con 1 μ l ser visto en una placa de MALDI objetivo para el análisis mediante MALDI-TOF (Micromass M @ LDI L / R del sistema) para generar un péptido masiva de huellas dactilares. El NCBI y MSDB péptido Se hicieron búsquedas en bases de datos utilizando Mascotas http://www.matrixscience.com/search_form_select.html con, 100 ppm de precisión y carbamidomethyl transformación seleccionado. Algunas manchas de proteínas se analizaron por LC-MS/MS y de la fragmentación de datos se utilizó para la búsqueda NCBI y MSDB péptido Mascotas utilizando bases de datos como se describe anteriormente [52]

Enzimas de ensayos

AG contenidos fueron separados de los tejidos AG por centrifugación en pequeños volúmenes de solución de Ringer, normalmente 20 pares de AGs en 40 μ l, en 10000 g a 4 ° C. Para la determinación de la actividad de la cisteína peptidase, AG muestras fueron incubadas en la activación buffer (100 mM tampón de acetato de sodio, pH 5,5, 5 mM EDTA, 20 mM de cisteína) a 35 ° C, ya sea con o sin inhibidor de uno de los dos inhibidores de la cisteína peptidase ( K11777 y E64). Después de 1 h, el sustrato (Cbz-Leu-Arg-MCA) se añadió a una concentración final de 10 μ M en el 1% (v / v) y dimetil sulfóxido de la fluorescencia emitida durante la reacción fue medida cada 90 segundos en negro 96 -- Así placas de microtitulación (Corning Ciencias de la Vida, High Wycombe, Reino Unido) a temperatura ambiente usando un fluorómetro Victor 2 (PerkinElmer ™, Finlandia) y un λ de excitación de 380 nm y λ de emisión de 460 nm. Reacción lineal de las tasas de hasta 2 h (1 unidad de la actividad es de 1 pmol de 7-AMC liberados / h). Cisteína peptidase actividad hacia el sexo peptide1-13 fue realizada por incubando el contenido de 50 AGs en 50 μ l de la activación de amortiguación por 1 h a 35 ° C, antes de añadir peptide1 sexo-13 (50 μ M, concentración final). Después de 12 h de incubación a 35 ° C, se dio por terminada la actividad hidrolítica mediante la reducción del pH a 2 con 5 μ l de 8% (v / v) TFA. Productos se analizaron por HPLC en fase reversa utilizando una Phenomenex Júpiter C18 columna (5 μ m de las partículas, 250 × 4,6 mm; Phenomenex, Macclesfield, Reino Unido) y un gradiente de elución de acetonitrilo aumento de 12% a 60% de acetonitrilo en el 0,1% TFA más de 25 min , Con un caudal de 1 ml / min. La elución de los péptidos que contienen triptófano se vigila a 280 nm. El principal producto pico fue reunida y analizada por MALDI-TOF MS.

Γ-Glutamyl transpeptidasa actividad fue ensayada mediante γ-glutamil-p-nitroanilide (1 mM) como la γ-glutamil donante y el dipeptide Gly-Gly (20 mM) como aceptor en Tris-HCl buffer (0,1 M, pH 8) [42]. La liberación de p-nitroaniline fue monitorizada cada 10 segundos en 96-y las placas de plástico (TM Nunc, Dinamarca) con un SPECTRA MAX 340 PC espectrómetro (Molecular Devices, Wokingham, Reino Unido), fijado en 410 nm (ε = 8800 M -1. Cm -1) y una temperatura de 25 ° C. La velocidad de reacción es lineal hasta 1 h (1 unidad de la actividad es de 1 nmol de p-nitroaniline liberados / h). La naturaleza soluble de la γ-glutamil transpeptidasa fue establecido por homogeneizar las diez AGs en 200 μ l de solución de Ringer en un vaso homogeniser (GPE Ltd, Leighton Buzzard, Reino Unido), la centrifugación y el homogenado a 60000 g durante 2 h en un rotor Beckman TLA110 Utilizando un Optima Max Ultracentrifuge (Beckman Coulter UK Ltd, High Wycombe, Buckinghamshire, Reino Unido). La actividad de la enzima resultante de la fracción soluble se comparó con la actividad se encuentran en una muestra de la homogenado adoptadas antes de la centrifugación.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

MJW, CMR y JNK llevó a cabo el análisis proteómicos. MJW y MS planificar y llevar a cabo estudios de la actividad de la enzima. NA identificado sitio de la división para la hidrólisis de péptidos sexo. REI redactado el manuscrito. ADS ayudado a revisar el manuscrito y REI y ADS planificadas conjuntamente el estudio.

Agradecimientos

Damos las gracias a Kathryn S Lilley, de la Cambridge Centro de Proteómica para LC-MS/MS, Richard J Bingham de la Estructurales Astbury Centro de Biología Molecular de la Universidad de Leeds, valioso para el debate. MJW CMR y el apoyo de becas de la Biotecnología y Ciencias Biológicas del Consejo de Investigación, Reino Unido.