Proteome Science, 2006; 4: 7-7 (más artículos en esta revista)

Optimización y evaluación de la superficie laser-desorption/ionization mayor tiempo de vuelo para la espectrometría de masas de perfiles de las proteínas del líquido cefalorraquídeo

BioMed Central
Nelson Guerreiro (nelson.guerreiro @ novartis.com) [1], Baltazar Gómez-Mancilla (baltazar.gomezmancilla @ novartis.com) [1], Stéphane Charmont (stephanecharmont@novartis.com) [1]
[1-4002 Basel, Suiza

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Resumen

Líquido cefalorraquídeo (LCR) potencialmente lleva un archivo de péptidos y pequeñas proteínas de interés para los procesos patológicos en el sistema nervioso central (SNC) y el tejido cerebral circundante. Proteómica es especialmente adecuado para el descubrimiento de biomarcadores de diagnóstico potencial en MCA para el diagnóstico precoz y la discriminación de varias enfermedades neurodegenerativas. ProteinChip superficie-laser-desorption/ionization mayor tiempo de vuelo espectrometría de masa (SELDI-TOF-MS) es una de esas enfoque que ofrece una plataforma única para alto rendimiento de perfiles de péptidos y pequeñas proteínas en LCR. En este estudio se evaluaron las metodologías para la retención de las proteínas MCA <20 kDa de tamaño, e identificar una estrategia de cribado pequeños péptidos y proteínas en LCR. ProteinChip gama tipos, junto con una muestra de las condiciones de amortiguación y vinculantes, y las matrices se investigaron. Por acoplamiento al tratamiento de los arrays de un líquido manejador de perfiles reproducibles y fiables, con punta media de los coeficientes de variación <20%, se lograron para intra-e inter-ensayos seleccionados bajo condiciones. Sobre la base de pico m / z encontramos un alto grado de coincidencia entre la prueba gama superficies. La combinación de CM10 y IMAC30 arrays era suficiente para representar entre el 80-90% de todos los picos asignados al utilizar ya sea ácido o sinapinic α-Cyano-4-hydroxycinnamic ácido como las matrices de absorción de energía. Además, los vectores procesados con SPA consistentemente mostraron una mejor resolución y pico pico más alto número a través de todas las superficies dentro de la gama mide la masa. Tenemos la intención de utilizar CM10 y IMAC30 arrays preparado en sinapinic ácido como un método rápido y económico para impulsar las decisiones sobre la selección de muestras antes de su más profundo descubrimiento de biomarcadores en el diagnóstico de la PPC mediante alternativas sino complementarias, proteómicos estrategias.

Antecedentes

Humanos líquido cefalorraquídeo (LCR) es producido en gran medida por el plexo coroideo altamente vascular [1]. LCR circula continuamente a través de cavidades en el cerebro y la médula espinal y en el espacio subaracnoideo, y contiene péptidos y proteínas que desempeñan una función esencial en muchos procesos fisiológicos [2]. Su proximidad con el cerebro y el poco riesgo que participan en la adquisición de muestras de LCR de personas hace que sea una fuente adecuada de proteína de biomarcadores de enfermedad neurodegenerativa. MCA está en contacto directo con el espacio extracelular del cerebro, y así contiene algunas proteínas y otros productos de origen de células neuronales. Como tal, cualquier variación en la composición de proteínas o de la abundancia relativa a la normalidad MCA potencialmente reflejan procesos patológicos en el tejido que rodea el cerebro y otras partes del sistema nervioso central (SNC) [1, 3 - 6]. Supervisión de una combinación de marcadores biológicos en LCR exhibiendo una alta sensibilidad y especificidad ofrece el potencial para ayudar a las primeras etapas de diagnóstico, cuando correcto diagnóstico es a menudo difícil, y cuando los compuestos terapéuticos tienen las mayores posibilidades de ser eficaz. Biomarcadores podrían también ser utilizados como índices cuantitativos de la progresión de la enfermedad y la respuesta a la terapéutica, y para discriminar o temprano incipiente enfermedad de Alzheimer (EA) de la edad asociada a la pérdida de la memoria menoscabo, la depresión, y algunas demencias secundarias.

Similar a la del plasma, la principal de proteínas en LCR se isoformas de la albúmina sérica, transferin e inmunoglobulinas, que representan más del 70% de la cantidad total de proteínas. Además, un comportamiento no deseado de alto rango dinámico de las proteínas se encuentra en abundancia PPC, con lo que la detección de la menor abundancia de las proteínas sumamente difícil con los actuales métodos analíticos. Un problema adicional con el análisis de la PPC es la concentración de proteínas. En promedio MCA contiene 100 veces menos que las proteínas plasmáticas, por lo tanto, lo que exige la necesidad de muestras de mayor cantidades en relación con el plasma. Una variedad de enfoques proteómicos Recientemente se han utilizado para caracterizar la composición de péptidos y proteínas en LCR. La mayoría de estos proteómicos plataformas tecnológicas se centran en la aplicación de técnicas de espectrometría de masas en conjunto con varias otras técnicas analíticas como la electroforesis en gel, centrándose isoeléctrico, y cromatografía líquida (LC) [3, 7 - 11]. Si bien estos enfoques proporcionan una gran cantidad de datos y puede identificar cientos de proteínas, que son en general mucho tiempo y, por lo tanto restrictivas en el número de muestras comparativas que pueden ser analizadas.

Superficie de enriquecimiento de los enfoques basados en combinación con MS es uno de los enfoques que ofrece una plataforma única para la proteína de alto rendimiento de perfiles de MCA. ProteinChip aumento de la superficie con láser de desorción / ionización tiempo de vuelo espectrometría de masa (SELDI-TOF-MS), la tecnología (Ciphergen Biosystems Inc, Fremont, CA) fue desarrollado para facilitar el análisis de alto rendimiento de las proteínas en las muestras biológicas complejas tales como el cuerpo Fluidos [12 - 17]. Este chip utiliza tecnología basada en la proteína muestra arrays con diferentes superficies cromatográfico diseñado para capturar y retener a subconjuntos de las proteínas sobre la base de las características específicas de las proteínas como de afinidad, carga, hidrofobicidad, y el metal-la capacidad vinculante. Después de una serie de medidas de carácter vinculante y de lavado de las superficies de cromatografía, la matriz se añade a las manchas y las muestras son analizadas por láser de desorción / ionización-TOF-MS generar masa / carga de perfiles de la muestra aplicada [18]. Proteómicos patrones de expresión derivados de la espectrometría de masas se han presentado como posibles marcadores biológicos de relevancia clínica [19 - 21]. Tales perfiles pueden ser espectral en comparación con el diferencial de descubrir los patrones de abundancia y de la ayuda en la identificación de las pautas de diagnóstico de la enfermedad y la toxicidad [13, 15, 22 - 25]. Además, la superficie de base de enriquecimiento de los enfoques tienen el potencial de captura y para enriquecer baja abundante, de bajo peso molecular de especies [12, 17, 22, 26, 27]. El bajo peso molecular de la región MCA compuesto de fragmentos de péptidos y proteínas se mantiene relativamente inexplorada y representa un potencial tesoro de información histopatológico.

Aunque el ProteinChip SELDI-TOF es un método simple, robusta plataforma de alto rendimiento de perfiles de proteínas, mucho se ha discutido acerca de su escasa representación de la proteoma, en particular para las proteínas por encima de 20 kDa en masa. En este trabajo, sin embargo, aprovechar el potencial de las tecnologías de detección de péptidos y pequeñas proteínas entre el 2-20 kDa masa ventana gama, y su único requisito de pequeños volúmenes de muestra para el análisis. Como con cualquier tecnología, procedimientos experimentales deben ser optimizados y reproducible, para asegurar la salida de datos. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo es mejorar las metodologías existentes para identificar condiciones efectivas de retención para el perfil de proteínas de bajo peso molecular de la región de la CSF proteoma.

Resultados
Evaluación de ProteinChip gama tipos, y la matriz de amortiguación de las condiciones para el perfil CSF

Cuatro ProteinChips (CM10, Q10, H50 y IMAC30) fueron utilizados para la detección de las proteínas presentes en el LCR entre m / z gama de 2.5-20 kDa. Con el fin de identificar condiciones efectivas de retención de proteínas, agrupados humanos MCA muestras fueron preparados de conformidad con el nativo, desnaturalizado, y desnaturalizado y reducido condiciones, y se analizaron en ProteinChip arrays procesados utilizando diferentes condiciones de amortiguación y matrices. Para cada una de las condiciones de retención de las muestras se procesaron por triplicado. Los criterios de selección utilizados para determinar la elección de las condiciones para el perfil MCA depende de la cantidad y la calidad de resolverse dentro de los picos de los espectros de masa. Los cuadros 1 y 2 se resumen el número de picos detectados automáticamente entre la m / z gama de 2.5-20 kDa en todas las condiciones de prueba utilizando ya sea SPA o CHCA como la absorción de energía matrices. Picos eran necesarios para tener una relación señal / ruido de 3 o más, a fin de tener en cuenta. El representante perfiles obtenidos de la prueba en condiciones de arrays procesados con SPA y CHCA se muestran en las figuras 1 y 2, para las respectivas matrices. Sobre la base de pico total contar, desnaturalizado muestras demostrado un mayor número de picos resueltos en comparación con muestras de preparados de conformidad con el nativo o desnaturalizado y reducido condiciones. Este fue el caso en los cuatro procesados ProteinChip arrays, ya sea con o SPA CHCA. Al comparar pico CM10 contar entre Q10 y arrays, un poco mejor los perfiles fueron obtenidos con ambos tipos array procesados en ausencia de Triton X-100. En el caso de IMAC30, con superficie de activación de cobre siempre que el pico más alto en comparación con el número de activación de níquel, mientras que con H50, el pico más alto número se obtuvieron con el 10% AcN/0.1% TFA como vinculante de amortiguación frente a PBS. Normalmente para el análisis de proteínas y péptidos por MS, SPA es la matriz de elección de los grandes proteínas, mientras que CHCA es el preferido para la matriz de péptidos (<4 kDa). No es de extrañar, arrays procesados con SPA consistentemente mostraron una mejor resolución y pico pico más alto número a través de todas las superficies dentro de la masa mide entre 2,5 a 20 kDa (cuadros 1 y 2].

Evaluación de mayor volumen de las superposiciones entre ProteinChip gama tipos

Peak perfiles de las muestras preparadas para la PPC en la desnaturalización de amortiguación se compararon a través de los cuatro tipos ProteinChip conjunto para evaluar el grado de pico de la superposición entre los diferentes tipos de matriz. La evaluación de mayor volumen de las superposiciones se utiliza para determinar la combinación óptima de gama tipos, en función del número y la resolución de los picos, que se aprobó por un MCA de perfiles de estrategia. La Figura 3 muestra los espectros representante de las proteínas retenidas en los cuatro tipos array preparado con SPA. Momento de la asignación de volumen máximo de grupos a través de los diferentes tipos de variedad, sobre diferentes superficies de los picos se supone que la misma proteína si sus respectivos m / z fueron en el 0,3%. No obstante, hay que mencionar que sin pico identidades asignado uno nunca puede estar seguro de que un pico de masa similar, observadas entre los diferentes tipos de variedad, representa la misma proteína. Un diagrama de Venn que representan a los cargos de máximo volumen, determinado como única o común en toda la gama tipos, se muestra en la figura 4. Una proporción significativa de todos los picos detectados resultaron ser comunes a dos o más tipos de matriz. Aproximadamente, el 8 y el 12 de los picos eran comunes a todos los tipos de serie transformados con SPA y CHCA, respectivamente, de los cuales 6 picos eran comunes a todos los tipos de serie con las dos matrices de procesado (m / z 8740, 11956, 12055, 13996, 14122 y 14164 ). En general, aproximadamente el 75 y el 56 picos singulares (definida como sólo presente en una superficie) se detectaron en los cuatro tipos de arreglos elaborados con SPA y CHCA, respectivamente. El mayor número de picos única se observó el CM10 y IMAC30 arrays. Además, la combinación de CM10 y IMAC30 cubierto el 89% y el 79% de todos los picos detectados en SPA y CHCA, respectivamente.

Evaluación de la reproducibilidad espectral

Para estudios comparativos, confiable y reproducible perfiles de proteínas debe ser obtenido para garantizar que la variación de los espectros de las diferencias biológicas en la concentración de proteínas en lugar de la variabilidad sistemática. Como tal, precisa pico de masa alturas son necesarias, y la variante técnica de los perfiles deben ser conocidas. Con el fin de aumentar la fiabilidad de que el enfoque adaptado a toda la tramitación de las matrices a un sistema robótico para la coherencia. Intra-chip reproducibilidad se evaluó a través de 6 repeticiones de una técnica combinada LCR muestra un hotel de cinco volúmenes iguales (5 μ l) en cuatro chips individuales CM10. Un total de 30 seleccionados al azar, con picos de una señal-ruido> 3, y común a todos los espectros, fueron seleccionados al azar y en comparación con lo que se refiere a su pico de intensidad normalizada mediante el cálculo de la CV dentro de cada chip. El promedio de CV para la variabilidad intra-chip es de 17%, que van desde 7-34% a través de los picos individuales. Para evaluar la variabilidad inter-chip, agrupados LCR muestra fue aleatoria en un solo punto a través de cada uno de los doce CM10 fichas en una placa bioprocessor. Esto se repitió usando una segunda placa bioprocessor procesados el día siguiente. Un total de 37 picos con una relación señal-ruido> 3, y común a todos los espectros, fueron seleccionados al azar y en comparación con lo que se refiere a su pico de intensidad normalizada mediante el cálculo de la CV dentro de cada bioprocessor. La media de pico de CV de 19% (rango de 6-29%) y 23% (rango de 7-47%) normalizado para la intensidad se calcularon para cada bioprocessor. Los espectros de los perfiles para la inter-chip ensayo se muestran en el gráfico 5. En general, los CV obtenidos por las inter e intra-chip indican que la tramitación de las fichas a través de una proteína bioprocessor utilizando un sistema robótico es confiable y reproducible.

Además se evalúa la variabilidad a través de tres placas bioprocessor procesados 4 y 24 horas. MCA muestra se agruparon al azar en un solo punto a través de cada uno de los doce CM10 fichas en una placa bioprocessor. Lo mismo se repitió para las otras placas de 4 y 24 h más tarde. La Figura 6 muestra el principio componente de los resultados de los análisis de puntos de datos que representan los espectros de cada muestra con el color que indica la placa bioprocessor. La agrupación de los puntos de sus respectivas placas, indica la presencia de una discernible sistemática de la variabilidad a través de los platos, con la mayor separación entre grupos para ver la placa de procesado a las 24 h. Esta variación es muy importante en el contexto de los grandes estudios en los que un gran número de placas bioprocessor sería necesario. Inteligente aleatorización utilizando procedimientos técnicos repeticiones tendría que ser aprobada, a fin de minimizar cualquier sesgo sistemático introducido por placas y el tiempo de proceso.

Discusión

Superficie de enriquecimiento de los enfoques basados en combinación con EM, como ProteinChip SELDI-TOF enfoque, se han desarrollado para facilitar el análisis de alto rendimiento de péptidos y proteínas en muestras biológicas complejas tales como los líquidos corporales. ProteinChip SELDI-TOF tecnología permite fácil para el análisis de la muestra desde muy pequeños volúmenes de muestra puede aplicarse directamente a la matriz ProteinChip superficies, y el proceso puede ser fácilmente automatizadas de análisis de alto rendimiento. En el presente estudio, hemos aplicado la ProteinChip SELDI-TOF enfoque junto con un robot automatizado de preparación de muestras de trabajo, como estrategia de cribado potencialmente un gran número de muestras de LCR de los estudios clínicos. En particular, aprovechar las tecnologías de alto rendimiento potencial de las proteínas de cribado entre la masa 2.5-20 kDa ventana gama.

Hasta la fecha, existen pocos ejemplos en la literatura que describe la aplicación de ProteinChip SELDI-TOF enfoque para el análisis de la PPC [28 - 33]. Y ninguno describir una evaluación comparativa de la PPC a través de los diferentes perfiles de las condiciones y arrays. A nuestro entender este trabajo es el primero en describir una investigación comparativa de los procedimientos experimentales para la determinación de la eficacia y la coherencia de las condiciones de retención de proteínas en LCR ProteinChip diferentes tipos entre la variedad 2.5-20 kDa masa gama. ProteinChip gama tipos, junto con una muestra de las condiciones de amortiguación y vinculante, y se evaluaron las matrices basadas en el número de resolver picos muestran una señal-ruido de 3 o mayor. Se encontró que el MCA preparado bajo condiciones desnaturalización sin reducción de un mejor desempeño en todos los arrays ProteinChip procesado, ya sea con o SPA CHCA como la matriz. Con respecto a la selección de amortiguación vinculante para la retención de proteínas, en ausencia de amortiguación de Triton X-100, mejores resultados para el CM10 y Q10 arrays. Por IMAC30 y H50 ligeramente mayor pico números fueron obtenidos por activación de la superficie con el cobre, el 10% y el uso de AcN/0.1% TFA como vinculante de amortiguación, respectivamente. Sin embargo, el tipo de matriz en lugar de la condición vinculante de chips utilizados en cada superficie parece dictar el perfil global de la proteína de cada tipo de chips. ProteinChip arrays preparado con SPA consistentemente mostraron una mejor nitidez y pico pico más alto número a través de todas las superficies. La fiabilidad de este enfoque se puso de relieve con la baja currículos que se comparan favorablemente a la CV reportado en otras proteínas de perfiles de los enfoques [34]. Es muy probable que uno de los principales contribuyentes a esta fue la adaptación de todo el proceso de preparación ProteinChip a un sistema de robótica. No obstante, se observó la variabilidad sistemática a través de placas procesadas en diferentes momentos. Por lo tanto, para asegurar que se reduzca al mínimo el sesgo sistemático, muestra la aleatorización utilizando procedimientos técnicos repeticiones deben ser abordadas adecuadamente cuando se realizan grandes estudios

La superficie de base de enriquecimiento de enfoque utilizando ProteinChips es una rápida y sencilla herramienta para la detección de péptidos y pequeñas proteínas por debajo de 20 kDa de los pequeños volúmenes de muestra. Sin embargo, las principales deficiencias de este enfoque son de máximo volumen de las identidades y la cobertura limitada proteoma. En este estudio, sólo un pequeño subconjunto de las especies, de un total de 100 posibles' si no 1000s' de las moléculas que circulan en la PPC, es en realidad un seguimiento picos como si la materia prima es unfractionated. Además, debido al alto nivel de la superposición de los perfiles de entre los probados gama tipos, se observó que la combinación de CM10 y IMAC30 fue suficiente para representar entre el 80-90% de todos los picos asignados en la prueba arrays. Preferiblemente, hubiéramos querido un mucho menor superposición de los perfiles de la serie entre los tipos a fin de aumentar la cobertura del proteoma.

MCA contiene una enorme variedad de moléculas, que abarcan una gama de concentración de 10 órdenes de magnitud entre la más alta y la más baja la abundancia de proteínas, de los que sólo unos pocos (por ejemplo, albúmina) constituyen hasta el 90% de la concentración de proteínas. En consecuencia, es probable que la baja abundancia de moléculas de diagnóstico potencial se compitió por alto la abundancia informativa no vinculante sobre las moléculas de la fase sólida. De hecho, la mayoría de las diferencias señaladas por este enfoque en los fluidos corporales han mostrado parcialidad hacia la alta abundancia de moléculas (en el presente μ g / ml a mg / mL, rango) que implica que la ProteinChip SELDI-TOF tecnología probablemente no es suficiente para 'profunda' proteoma Análisis [19]. Prefractionation inicial de la PPC por métodos basados en LC, en combinación con immunodepletion de abundantes proteínas, por lo tanto, son probablemente las medidas obligatorias para la explotación de abundantes moléculas de bajo potencial de diagnóstico [35, 36]. Al mismo tiempo, hay que encontrar un equilibrio entre el análisis de la profundidad, velocidad, rendimiento, y requisitos de la muestra.

Nuevos acontecimientos ocurridos en las estrategias para el análisis selectivo de la absorción de la proteína en un sólido apoyo, junto a la masa de alta precisión y alta resolución MS tecnología es necesaria antes de que este enfoque puede ser utilizado como una forma más completa de perfiles proteómicos en una herramienta automatizada de alto rendimiento y de la moda. Una prometedora área de desarrollo es en la utilización de ligandos combinatoria para la minería del proteoma [38, 39]. Bibliotecas potencial de millones de discretas ligandos sintetizados de aminoácidos en fase sólida cuentas que se han creado, en el que, teóricamente, existe una para cada proteína ligando, de anticuerpos, y péptido presente en el material de partida. Se prevé que estas piedras impregnadas con complejo proteomes podría capturar la igualdad de las cantidades de cada uno y de todos los péptidos y proteínas presentes en el PPC, lo que reduce la diferencia de concentración. Esto podría hacer proteómicos ProteinChips utilizando enfoques más adaptados a la 'profunda' proteoma análisis y descubrimiento de biomarcadores. Otro interesante enfoque ha sido aprobado por ambas Mehta [39] y [40] Zhou perfil a la proporción de las especies de bajo peso molecular vinculado a la captura de las proteínas portadoras. Se constató que mediante una selección de la orientación de alta abundantes proteínas en el suero de agotamiento, muchos otros péptidos y pequeñas proteínas asociadas a estos abundantes proteínas son concomitantemente eliminado. En esta selección, las concentraciones de péptidos asociados y pequeñas proteínas se enriquecen a los niveles de detección. De hecho, algunas de las especies identificadas clínicamente relevantes representados biomarcadores, incluyendo antígeno específico de la próstata que en los hombres sanos está presente en una concentración de 1 ng / ml. El examen de las especies de bajo peso molecular vinculado a proteínas específicas transportista podrá, por lo tanto, para permitir la detección y la minería de la información de diagnóstico.

A pesar de las actuales deficiencias técnicas de la ProteinChip SELDI-TOF tecnología, se podría prever la posible utilización de la superficie de enriquecimiento de los enfoques basados en combinación con MS estrictamente como una herramienta de alto rendimiento para impulsar las decisiones sobre la selección de muestras antes de que más a fondo Descubrimiento de marcadores diagnósticos. Por ejemplo, el ProteinChip SELDI-TOF tecnología podría ser utilizado como un paso inicial para el control de la calidad de cribado a gran número de muestras obtenidas de múltiples centros clínicos. El análisis multivariado de las series de datos que revelen la posibilidad de ayudar a la muestra atípicos como consecuencia de la manipulación o bien muestra la variabilidad intrínseca del paciente. Esto ayuda en la selección de una muestra más pequeña para el subconjunto más profundo análisis comparativo con otros proteómicos plataformas como multidimensional LC-MS estrategias.

Conclusión

En conclusión, hemos demostrado que la ProteinChip SELDI-TOF tecnología puede proporcionar una forma rápida, robusta, sencilla y reproducible para la medición de perfiles de plataforma picos en la gama baja masa molecular de la CSF proteoma. Estamos examinando actualmente la solidez de los perfiles a través de series de la muestra del paciente sano, alteración cognitiva leve, AD, y otras demencias con el fin de abordar la viabilidad de la plataforma actual, en combinación con la decisión de algoritmos para la detección de biomarcadores asociados con paneles de las diferentes patologías , Y como una herramienta para la selección de muestras antes de su análisis más a fondo.

Materiales y métodos
Muestras de líquido cefalorraquídeo

Normal MCA muestras obtenidas de pacientes que consienten fueron proporcionados por PrecisionMed Inc (San Diego, CA). MCA muestras fueron obtenidas por punción lumbar, como parte de un procedimiento clínico de rutina. Las muestras se colectaron en tubos de polipropileno y mixta suavemente para evitar efectos gradiente. Las muestras fueron centrifugadas a 2000 × g durante 10 minutos para eliminar las células y demás material insoluble. Sobrenadantes se congelaron en alícuotas y almacenados a -80 ° C hasta el análisis.

Preparación de la muestra

Un estándar agrupados Humanos LCR muestra se utilizó para evaluar las diferentes condiciones de mantenimiento a todos los ProteinChip arrays. MCA muestras se prepararon en cuatro superficies diferentes ProteinChip serie: de intercambio catiónico (CM10), el fuerte intercambio aniónico (Q10); metal vinculante (IMAC30) e invertir etapa (H50). Todos ProteinChip Arrays fueron procesados en el mismo día siguiente a los procedimientos recomendados por el fabricante. Encuadernación buffers usados para los distintos arreglos fueron de 100 mM de acetato de amonio pH 4.0 (con o sin el 0,1% Tritón X-100) para CM10; 100 mM Tris-HCl pH 9.0 (con o sin el 0,1% Tritón X-100) de Q10, 100 Na mM fosfato, 500 mM NaCl pH 7.0 (ya sea activado con 100 mM sulfato de cobre o 100 mM de sulfato de níquel hexahidrato) para IMAC30., El 10% de acetonitrilo (AcN), el 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA) o buffer fosfato salino (PBS) para H50.

Preliminares de los experimentos fueron realizados en ProteinChip arrays manchas con diferentes volúmenes de muestra MCA preparado en diferentes proporciones de la muestra a vinculantes de amortiguación. Con base en el número total de los picos detectados y sus correspondientes intensidades se determinó 5 μ l de MCA diluido 1:4 en el carácter vinculante de amortiguación adecuado a ser la cantidad óptima de la carga en ProteinChip arrays (datos no presentados). Posteriores experimentos reportados en el presente trabajo se realizaron con este volumen de LCR. En resumen, 5 μ l de LCR fue diluido 1:1 en la muestra en representación de los preparativos de amortiguación de las siguientes condiciones: nativos (dH 2 O), desnaturalizado (9,5 M de urea, 2% CHAPS, 50 mM Tris-HCl, pH 9,0) y desnaturalizado / Reducido (9,5 M de urea, 2% CHAPS, 50 mM Tris-HCl, 10 mM dithiothreitol, pH 9,0). Tras 20 minutos de incubación a 4 ° C, el MCA muestras fueron añadidos a puntos separados sobre la superficie usando una variedad Biomek laboratorio de la estación (Beckman-Coulter, CA) modificado para hacer uso de un ProteinChip gama bioprocessor (Ciphergen Biosystems Inc). Las muestras de los vectores se diluyeron 1:4 en la serie vinculante ProteinChip adecuado de amortiguación. El bioprocessor fue centrifugada durante 10 s a 1000 rpm, la utilización de un sistema de Eppendorf Centrifugue 5804, para eliminar las burbujas. Los arrays se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. El ProteinChip arrays se lavaron dos veces con 50 μ l vinculante de amortiguación durante 5 minutos con agitación suave, seguido de dos lavados con 150 μ l de agua destilada durante 1 minuto para eliminar las sales de amortiguación. El bioprocessor fue posteriormente retirado y la ProteinChip arrays secado al aire a 23 ° C durante 15 minutos. Una vez seco, dos de 1 μ L alícuotas de un 50% de ácidos saturados sinapinic (SPA; Ciphergen Biosystems Inc) solución preparada en el 50% de acetonitrilo y 0,5% TFA se añadió a cada mancha de la ProteinChip matriz. Los arrays se permitió que el aire seco antes de SELDI análisis. Lo mismo se repitió para ProteinChip arrays preparado con un 50% saturados α-Cyano-4-hydroxycinnamic ácido (CHCA; Ciphergen Biosystems Inc) solución preparada en el 50% de acetonitrilo y 0,5% TFA. Cada condición se analizó por triplicado. Para el almacenamiento, las manchas arrays se mantuvieron en la oscuridad a temperatura ambiente.

Adquisición de datos y procesamiento espectral

ProteinChip arreglos fueron colocados en la ProteinChip lector de la serie 4000 espectrómetro de masas (Ciphergen Biosystems Inc) y los espectros de masa fue adquirido con una configuración optimizada para el m / z gama de 2.5-20 kDa. Para cada mancha de unos 175 disparos fueron recogidas en el modo de ionización positiva usando un láser de intensidad fijado en 1500 nJ. SPA preparativos para el establecimiento de un deflector de 1000 Da, y un foco de masas de iones Da de 9000 se utilizó, mientras que CHCA preparativos para el establecimiento de un deflector de 500 Da, y un foco de masas de iones de 3500 se utilizó Da. Los espectros fueron calibrados externamente utilizando el "todo-en-uno" péptido masa estándar (Ciphergen Biosystems Inc). Las normas, que van de 1-7 kDa, se prepararon sobre NP20 ProteinChip arrays de acuerdo a la recomendación de los fabricantes. El lector ProteinChip fue calibrado a diario y normalmente conseguido precisiones de la masa dentro de las 150 ppm.

Spectra se analizaron mediante Ciphergen Express, versión 3.0.5 del software (Ciphergen Biosystems Inc). La base de referencia fue restada (buen ancho de la línea de base 25) y la intensidad espectral se normalizaron por el total actual de iones (TIC) a una normalización externa coeficiente de 0,2 entre la masa rango de 2,5 a 20 kDa. Detección automática de pico se realizó con los siguientes valores: cálculo de ruido entre la masa rango de 2,5 a 20 kDa, 3 veces la señal-ruido y 2 veces el valle a fondo para el primer pase, y 2 veces la señal - Ruido y 2 veces el valle a fondo para la segunda pasada. Además de la asignación automática de picos, el manual de inspección de los espectros se realizó como una medida de control de calidad para asegurar que todos los picos estaban correctamente etiquetados. Momento de la asignación de grupos a través de los espectros de pico, dos picos en diferentes superficies se supone que la misma proteína si ambos sus respectivos m / z fueron en el 0,3%. Principio componente de análisis se ha realizado mediante el SIMCA-P paquete estadístico (Umetrics AB, Suecia), y fue utilizado para revelar la estructura principal diferencia y la agrupación.

Abreviaturas

SELDI-TOF-MS, de superficie mejorada Laser Desorption / Ionization-Tiempo de vuelo-espectrometría de masas; LCR, líquido cefalorraquídeo; CNS, el sistema nervioso central; CM10, la debilidad de intercambio catiónico; Q10, fuerte intercambio aniónico; IMAC30, inmovilizado metal afinidad Captura; H50, inversión de fase; SPA, sinapinic ácido; CHCA, α-Cyano-4-hydroxycinnamic ácido; m / z, en masa-a-cargo ratio; TDT, dithiothreitol.

Contribuciones de los autores

NG participado en el diseño del estudio y redactó el manuscrito. SC lleva a cabo todos los experimentos SELDI-TOF. BGM participado en el diseño del estudio y ayudó a redactar el manuscrito.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer a PrecisionMed Inc amablemente para proporcionar muestras de la CSF.