Interacciones entre los antagonistas de miel de abejas de bacterias simbiontes y consecuencias para la enfermedad

Los insectos, al igual que muchos eucariotas, pueden ser en gran parte por los microbios que albergan. Bacterianos asociados de los insectos están implicados en la degradación de los materiales vegetales y otros alimentos, la regulación de pH, la síntesis de vitaminas y, en relativamente pocos casos, la inducción de la enfermedad [1]. Insectos-bacterias van desde asociaciones facultativas de corta duración para las interacciones altamente codependent simbiosis [2]. Social insectos únicos recursos para proporcionar simbiontes microbianos, gracias a la alta densidad de los individuos dentro de las colonias, el reparto de alimentos y otros recursos, y la coexistencia de los miembros de la colonia de múltiples generaciones. No es de extrañar entonces, la simbiosis entre las especies de insectos sociales y de las especies de microbios son comunes y, a menudo, muy coevolved. Muchas especies de termitas y hormigas, por ejemplo, están vinculados a obligately microbios específicos para sus necesidades nutricionales [3 - 6].

Abejas de miel, Apis mellifera, una diversidad microbiana apoyo bioma [7]. Recientes encuestas de los adultos abejas indicar la presencia de bacterias de docenas de taxones, que van desde bacterias gram-positivas a los alfa y beta, y gamma-proteobacteria [7, 8]. Si bien algunas de estas especies bacterianas patógenas son claramente, la mayoría nunca han sido asociados con la enfermedad de la miel de abeja y sus repercusiones en los demás la miel de abeja y sus anfitriones son desconocidos.

Ahora es un momento ideal para explorar la diversidad de insectos endosymbiotic bacteria. En primer lugar, una inmensa biblioteca de datos de secuencia 16S rRNA loci marcadores y otros robusto permite la identificación precisa de muchas especies asociadas, incluso aquellos que se oponen a los cultivos [9]. Más de 200000 entradas bacteriana existen actualmente para 16S rRNA, 16S y secuencias pueden colocar la mayoría de los taxones estudiados bacteriana segura en géneros, si no especies. Además, los estudios de genómica de las diversas especies de bacterias permiten nuevos conocimientos sobre los mecanismos de mantenimiento y el crecimiento de estos microorganismos, así como sus posibles efectos sobre la salud de sus huéspedes de insectos [10 - 12]. Por último, las recientes encuestas a nivel de la comunidad bacteriana de la diversidad a través de los diferentes artrópodos [13 - 18] permite un enfoque comparativo a la comprensión de las funciones que desempeñan las bacterias durante las diferentes etapas de la vida de acogida, y en diferentes órganos del cuerpo.

Recientemente, describimos cuatro de miel de abejas de bacterias simbiontes con claros efectos bacteriostático contra la más extendida y virulenta de miel de abejas patógeno, la bacteria gram-positiva Paenibacillus larvas larvas [19]. Aquí, se presenta un estudio más completo de las especies bacterianas aisladas de las larvas de abeja de la miel: la etapa de la vida en la que son más susceptibles a la invasión por bacterias patógenas. Se utilizó 16S bacteriana primers universal para identificar las bacterias y los ensayos de inhibición in vitro para cuantificar la capacidad de cada una de estas cepas para inhibir p. L. Larvas. Se presenta una amplia gama de taxa capaz de inhibir este agente patógeno y muestran una considerable variación dentro y entre colonias en la distribución de los taxones inhibitoria. Los resultados tienen implicaciones generales para la expresión de la virulencia bacteriana en los insectos y en el mantenimiento de tanto beneficiosos como las enfermedades asociadas a las bacterias en los insectos sociales. También señalan nuevas vías para el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades de las abejas de miel.

Secuenciado los aislamientos (n = 61) fueron colocados por la similitud de secuencia 16S rRNA en cuatro géneros bacterianos: Acinetobacter, Bacillus, Brevibacillus, y Stenotrophomonas. Un total de 43 haplotipos 16S en representación de un mínimo de 15 taxones bacterianos se identificaron en el estudio (Tabla 1, Fig. 2]. La mayoría de los aislamientos cayó dentro del género Bacillus (n = 41). De ellos, 29 pertenecían a la B. Cereus grupo y sólo difiere ligeramente en el 16S. Aunque 16S rRNA no confianza resolver este grupo de especies, 26 mostraron mejor se adapte a la B. Cereus ss aislados, mientras que tres eran más cercano a B. Thuringiensis. Adicional de la resolución de este grupo fue facilitada por GLyP y PyC secuencia para un subconjunto de los aislamientos. Estas secuencias se refleja una amplia gama de haplotipos con fósforos a los miembros en cada extremo de la cereus grupo (Fig. 3]. Fuera de la cereus grupo, el resto de Bacillus spp. Acompañado B. Fusiformis, B. Flexus, B. Mycoides, y B. Niabensis (Tabla 1]. Otros tres Bacillus aislados mostró <97% secuencias similitud con las secuencias depositadas en GenBank y, como tal, no se fiable asignable a las especies. Sin embargo dos de los tres aislados se redujo en un clado con B. Fusiformis y aislar el último ampliado frente a la B. Cereus clade (Fig 2]. 10 aislamientos fueron indistinguibles de Stenotrophomonas maltophilia (Tabla 1]. Aunque los tres aislados de Acinetobacter cayó en un clado en el árbol 16S, BLASTN sólo coincide con una de las tres cepas de una especie mientras que el resto se corresponde solamente a un género. Siete aislamientos se colocaron en el género Brevibacillus, con cerca coincidencias con Fr. Formosus (n = 4), Fr. Centrosporus (n = 1), y Fr. Brevis (n = 1). Brevibacillus aislar el final no coincide con particular atención a un taxón en la base de datos 16S. Ninguno de los géneros representados en esta encuesta coincide con los géneros que se encuentran en una encuesta anterior 16S de las bacterias de las abejas adultas [8], lo que sugiere que la secuencia bacteriana en abejas seguirá identificar nuevos taxones.

Zonas de inhibición, cuando se presente, abarcan desde un <10 mM radio alrededor de las bacterias aisladas para completar la inhibición de la p. Larvas a través de la antena. Un total de 23 aislamientos bacterianos constantemente inhibido p. Larvas. Los aislados que inhibe p. Larvas fueron distribuidas de manera uniforme en toda la muestra taxones (Fig. 2]. De los 43 Bacillus sp. Aislamientos, diez coherente mostró inhibición mientras que otros siete aislamientos mostraron inhibición condicionada. Estos siete todos cayeron en el grupo de Bacillus cereus. De los diez Bacillus aislados en consonancia con la inhibición, 8 B. Cereus y dos fueron B. Fusiformis. Por lo tanto, por el actual ensayo in vitro, B. Niabensis, B. circulans, B. flexus, y B. Mycoides aislamientos no fueron inhibitoria de p. Larvas. Todos los aislamientos que se corresponde con Brevibacillus formosus constantemente inhibido el patógeno, mientras que aislar un solo puesto con B. Centrosporus no inhibió. Todos los aislados vinculados a Stenotrophomonas maltophilia constantemente inhibido p. Larvas, mientras que dos de los tres Acinetobacter aislados mostró inhibición.

Más bacterias y especies bacterianas fueron aisladas, por persona, de 7 días de edad que de las larvas de un día de las larvas (28 larvas de 55 a 7 días, 28 de 306 larvas en 24 Horas, la prueba G, p <0,0001; Cuadro 2). Dado que las larvas de las dos longitudes de incubación fueron recogidos al mismo tiempo de la colonia, esta diferencia no refleja una mayor oportunidad para que las larvas que se inocularon en el nido a medida que envejecen. En lugar de ello, las diferencias presumiblemente reflejan cuantitativamente mayor carga bacteriana en las personas de más edad, de modo que estas bacterias son más fácilmente cultivadas. No hubo una aparente diferencia en el tipo de especies o la diversidad en general entre los jóvenes y los mayores de esa edad las larvas, y no existía una diferencia significativa en la probabilidad de que una especie bacteriana fue recogido inhibitoria hacia p. Larvas (coeficiente de probabilidad, p = 0,2).

Hubo una diferencia significativa entre los sitios en la frecuencia de los residentes, cultivables, especies bacterianas. Dos sitios tenían niveles muy bajos de bacterias. Uno de estos sitios se había establecido poco antes de las colecciones se llevó a cabo. En este sitio (LID), sólo 4 de un total de 136 larvas (a partir de 4 de un total de 34 colonias) mostraron crecimiento bacteriano. Un segundo sitio, (aves de corral) mostró igualmente bajos tipos de bacterias cultivables (2,2%, n = 45 larvas). Por el contrario, las cargas se mensurables bacteriana presente en el 13% (n = 63) y 24% (n = 46) de larvas de la Parasitología y Pradera sitios, respectivamente. Dentro de los sitios, hubo una variación significativa a través de las colonias en la tendencia de sus larvas para albergar bacterias (anidados ANOVA, p <0,001), y, en concreto las bacterias que se encuentran en algunas colonias. Una mayor difusión de las encuestas será de utilidad para definir a nivel de colonias bacterianas' firmas', un paso importante en la determinación de los impactos de la colonia simbiótica de bacterias en la salud.

Se describe una amplia gama de bacterias endógenas taxones que son capaces de inhibir un importante patógeno de miel de abejas y muestran una considerable variación dentro y entre colonias en la distribución de estos taxones. Los resultados tienen implicaciones generales para la expresión de la virulencia bacteriana en los insectos y en el mantenimiento de tanto beneficiosos como las enfermedades asociadas a las bacterias en los insectos sociales. También señalan nuevas vías para el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades de las abejas de miel. Ninguno de los géneros representados en esta encuesta coincide con los géneros que se encuentran en una encuesta anterior 16S de las bacterias de las abejas adultas [8], aunque sí se imitan, en líneas generales, el bioma microbiana medido en colonias de abejas hasta la fecha (según el examen realizado por Gilliam, [7 ]).

La mayoría de las bacterias cultivadas en este estudio pertenecen al género Bacillus, un resultado que es coherente con la alta frecuencia de aislamientos en este género por Gilliam y colegas [7]. Entre las especies de Bacillus, la mayoría cayó en el grupo de Bacillus cereus. Tanto la secuencia 16S rRNA y multi-locus secuenciación (GlyP, PyC) indican que estas cepas representan distintos taxones de este grupo, a pesar de la interferencia con p. Larvas no caerse con la identificación de las especies. La alta frecuencia de las abejas albergar bacterias de la B. Cereus grupo estable sugiere una simbiosis entre las abejas y este taxón, tal vez ayudar a explicar el hecho de que las abejas son más tolerantes que muchos otros insectos hacia B. Thuringiensis [20]. Curiosamente, los aislados de este grupo que comparte ambos haplotipos 16S y la identidad de secuencia en los dos genes de codificación de la proteína-difieren sustancialmente en cuanto a su capacidad para inhibir la p. Larvas. Esta variación podría resultar de la variación genética detectados en subespecies, condicionar la activación de sustancias inhibitorias, o un papel de los plásmidos u otros elementos móviles en la inhibición. Futuros experimentos ayudarán a resolver las causas de la inhibición condicionada por Bacillus cereus subespecies.

Existe un creciente reconocimiento de las funciones potencialmente beneficiosos de las bacterias en las colonias de abejas de miel. Evans y López [21] recientemente demostraron que las bacterias no patógenas pueden estimular la respuesta inmune innata de las larvas de abejas de miel, tal vez ayudar a las abejas sobrevivir exposición a agentes patógenos. Además, Reynaldi et al. [22] Recientemente, demostró que las bacterias aisladas de las abejas en la Argentina son inhibitorias de la abeja importante de hongos patógenos, Ascosphaera apis. Será interesante determinar si estas especies, además, son también inhibitoria hacia p. Larvas, y al contrario que los microorganismos asociados a las abejas a través de los diferentes continentes.

Bacteriana simbiontes probable desempeñar funciones en la colonia aptitud individual y social a través de los insectos. Compartir simbiótica de bacterias es muy importante para la nutrición de termitas, y cada vez es más evidente que obliga a ambos facultativos y simbiosis se han generalizado en los insectos sociales. Las recientes pruebas de las socialmente defensa contra los agentes patógenos en las termitas [23] de hecho, podría reflejar el intercambio de bacterias entre los miembros de la colonia de termitas, en lugar de la propuesta de la inducción de receptores específicos de los cambios fisiológicos.

Tal vez, como es evidente en las termitas y las hormigas [24, 25], las abejas han desarrollado mecanismos fisiológicos o del comportamiento para mejorar la transmisión de microbios beneficiosos, mientras que la batalla a las especies que son patógenas. Esto indicaría una equilibrada para las abejas y otros insectos sociales, que permitan el fomento de las especies beneficiosas mientras que el mantenimiento de las barreras contra la explotación por los agentes patógenos. Si es así, la discriminación en los niveles de comportamiento individual y de la respuesta inmune podría ser utilizado para la parcialidad microbiana bioma dentro de las colonias de insectos para mutualistas y contra parásitos y agentes patógenos. Simbiontes potencialmente beneficiosos pueden ser alimentados a la elaboración de las abejas como profilácticos contra las enfermedades [21], y puede ser utilizado independientemente para comprender mejor la complejidad de las interacciones entre la biota microbiana de las abejas. Es, en este sentido, también será importante para mirar más de cerca los mecanismos de transmisión de los microbios dentro y entre las colonias de abejas.

Las bacterias se cultivaron de un total de 341 larvas de abeja de la miel recolectada de cuatro apiarios cerca de la USDA-ARS Bee Research Laboratory, Beltsville, MD, EE.UU. entre junio-agosto, 2003 (Fig. 1]. Estas larvas se obtuvieron de las dos colonias de abejas de miel madura (n = 217 larvas en 51 colonias establecido por lo menos un año antes de la recogida) y la de colonias que se han establecido recientemente (134 larvas de 34 colonias). Primer estadio las larvas se recolectaron y se han criado durante 24 ho 7d utilizando una dieta artificial aséptico, control de la temperatura (34 ° C) y alta humedad, tal como se describe [19]. Las larvas fueron congeladas a -80 ° C antes de que el cultivo y aislamiento de bacterias.

Larvas de las abejas individuales de tierra en 40 ul estériles H ₂ O a temperatura ambiente, utilizando una desechables pestle. Un disco de papel de filtro se impregnados con 20 ul de la suspensión resultante. Cada disco está centrado en una placa de Petri estándar (100 × 15 mm), que consta de Cerebro-Corazón de infusión agar (Difco) los medios de comunicación que contiene 0,1 mg / ml de clorhidrato de tiamina, tal como se describe [26]. Antes de la colocación de estos discos, placas habían sido inoculadas con un césped de aproximadamente 1 × 10 ⁸ esporas viables de p. Larvas. Estas esporas fueron aisladas de la miel de abejas enfermas larvas recogidas en el año 2002 a partir de una única colonia de abejas en Berkeley, CA, EE.UU. (BRL muestra 230010, [25]]. Después de 24 h de incubación a 34 ° C, las placas fueron anotadas por tanto el crecimiento bacteriano y la inhibición hacia p. Larvas. El crecimiento de bacterias que se describió como cualquier bacteria o contiguos a los discos de papel que fue atípica para P. Larvas. La inhibición se define como la distancia radial entre estos discos de papel y la primera línea de p. Crecimiento de las larvas. P. Larvas de inhibición se observó solamente en relación con el crecimiento de las larvas provenientes de las bacterias (por ejemplo, no había señales de inhibición resultante de las larvas de este ensayo por sí mismos). La inhibición se confirmó en todos los casos recogidos por replating cultivos bacterianos en contra de un nuevo césped de P. Larvas.

Todas las colonias de bacterias o de papel junto a los discos fueron recogidos con un tubo estéril. Aproximadamente 10 mg de células vegetativas de cada muestra se suspendió en 300 ul de la solución de glicerol 30% luego mantenerse a -20 ° C. Para aislar el ADN, 50 ul de esta suspensión se mezcla con 50 ul 10% Chelex-100 (Bio-Rad, Hercules, CA), y luego se incuba a 72 ° C durante 10-20 minutos antes de ser colocado en hielo.

16S rRNA genes fueron amplificados por PCR usando primers eu27.F universal eubacterial y eu1495.R [27]; secuencias 5'-gagagtttgatcctggctcag-3 'y 5'-ctacggctaccttgttacga-3', respectivamente). Mezclas de reacción incluido 2 ul extracto de bacterias, 2 U Taq ADN polimerasa con buffer recomendado (Boehringer, Indianapolis, IN), 1 mM DNTP mezcla, 2 mM de MgCl _2, y 0,2 μ M de cada primer. PCR se llevó a cabo en una investigación MJ-PTC-100 termociclador usando 30 ciclos de 93 ° C, 1 min, 54 º C 1 min, 72 ° C, 1 min. Bandas de un tamaño adecuado fueron confirmados por electroforesis en gel de agarosa, a continuación, los productos de PCR fueron purificados directamente (Gene Pure). Los productos fueron secuenciados utilizando Big Dye 2.0 (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) al final del ciclo terminal de la secuencia, seguida de la separación y el análisis sobre un Applied Biosystems 3130 Análisis de ADN máquina. Secuenciación se llevó a cabo en una dirección de los 5 '(eu27.F).

Secuencias, se verificaron y recortado usando el programa de software Sequencher (Gene Codes), y luego fueron alineados utilizando el algoritmo CLUSTALW, invocado por Omiga 2.0 (Oxford Molecular). Alineaciones incluye también una gran variedad de especies bacterianas, incluidas todas las de las que se habían identificado de abejas y miembros representativos de las principales bacterias clados. Alineaciones se exportaron a PAUP 4.0b10 (Sinauer) para generar hipótesis filogenéticas mediante una heurística de máxima parsimonia algoritmo. Los árboles se generaron para todo el conjunto de datos, y para un conjunto de datos limitado a las especies encontradas en el género Bacillus. Secuencias también se compararon directamente a todas las secuencias de 16S rRNA depositados en GenBank [28] utilizando BLASTN, en agosto de 2005.

Una gran parte de los aislados secuenciados fueron colocados en el grupo por Bacillus cereus 16S rRNA similitud. Para resolver mejor los miembros de este grupo, los aislados fueron secuenciados en dos loci de codificación de la proteína-que ofrecen secuencia informativa variación dentro de este grupo [29]. Glicerol proteína de factor de absorción (PCR y secuenciación primers Glyp.F GCG TTT GTG GTG CTG TAA GT y GlyP.R CTG CAA TCG GGA GAA AGA AG) y piruvato carboxylase (primers PyC.F GCG TTA GGT GGA AAC GAA AG y PyC.R CGC GTC GTT CAA TAT GGA AT) genes fueron amplificados por un período de tres PCR régimen de paso (94 30 s, 58 30 s, 72 1 m) × 30 y secuenciado a través de Big Dye N-terminal de la secuencia tal y como se describe más arriba. Secuencias fueron alineados entre sí y con los vales de secuencias de la base de datos de secuenciación Multilocus http://pubmlst.org/bcereus/ utilizando CLUSTAL, y luego fueron analizados por la máxima parsimonia usando PAUP 4.0b.

JDE concibe el proyecto y ambos autores se ocupan de la recopilación de datos, análisis y redacción.