Filaria Journal, 2006; 5: 4-4 (más artículos en esta revista)

Onchocerca parásitos y Wolbachia endosimbiontes: evaluación de un espectro de tipos de antibiótico contra Onchocerca gutturosa actividad in vitro

BioMed Central
Simon Townson (s.townson @ imperial.ac.uk) [1], Senyo Tagboto (senyo.tagboto @ uhns.nhs.uk) [1], Helen F McGarry (Helen.McGarry @ hse.gsi.gov.uk) [2], Gillian L Egerton (gillegerton@msn.com) [2], Mark Taylor J (mark.taylor @ liv.ac.uk) [2]
[1] Tropical Unidad de Enfermedades Parasitarias, Northwick Park Institute for Medical Research, Watford Road, Harrow, Middlesex HA1 3UJ, UK
[2] Filariasis Research Laboratory, Molecular y Bioquímica de Parasitología, Liverpool School of Tropical Medicine, Pembroke Place, Liverpool L3 5QA, UK

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Resumen
Antecedentes

El filarial parásitos de gran importancia en los seres humanos contienen la bacteria Wolbachia simbiótica y estudios recientes han demostrado que la orientación de estas bacterias con antibióticos da lugar a una reducción en el gusano de viabilidad, el desarrollo, la embriogénesis, y de la supervivencia. Doxiciclina ha sido eficaz en ensayos con seres humanos, pero hay una necesidad de desarrollar drogas que se pueden dar por períodos más breves y para mujeres embarazadas y niños. La Organización Mundial de la Salud aprobado por ensayo para la detección de anti-filarial actividad in vitro usos masculino Onchocerca gutturosa, con efectos están determinados por el gusano de la motilidad y la viabilidad, medida por la reducción de MTT a MTT formazan. Aquí hemos utilizado este sistema a la pantalla de antibióticos para la actividad anti-filarial. Además hemos determinado la contribución de la Wolbachia agotamiento a la reducción de MTT ensayo.

Métodos

Adulto de sexo masculino O. Gutturosa se cultivaron en un mono de células renales (LLCMK 2) alimentador capa en 24 y con placas de antibióticos y combinaciones de antibióticos (6 a 10 gusanos por grupo). El macrofilaricide CGP 6140 (Amocarzine) se utilizó como control positivo. Worm viabilidad se evaluó por dos métodos, (i) los niveles de la motilidad y (ii) MTT / formazan colorimetría. Worm motilidad se puntuó en una escala de 0 (immotile) a 10 (máximo) cada 5 días hasta 40 días. El día 40 el gusano de viabilidad fue evaluada por MTT / formazan colorimetría, y los resultados se expresaron como media en comparación con el porcentaje de reducción de los valores de control sin tratamiento en el día 40. Para determinar la contribución de Wolbachia a la MTT de ensayo, el MTT formazan formación de una línea de células de insectos (C6/36) con o sin infección de insectos Wolbachia y tratados o sin tratar se comparó con la tetraciclina.

Resultados

Los antibióticos conocidos con actividad anti-Wolbachia son eficaces en este sistema. Rifampicina (5 × 10 -5 M) fue la más eficaz de lucha contra la micobacteria agente; clofazimina (1,25 × 10 -5 M y 3,13 × 10 -6 M) produjo una reducción gradual de la motilidad y por 40 días había reducido gusano viabilidad. Las otras drogas anti-micobacterianas ha probado limitada o nula actividad. Doxiciclina (5 × 10 -5 M) fue filaricidal, minociclina, pero es más eficaz y en una menor concentración (5 × 10 -5 M y 1,25 × 10 -5 M). Inactivo compuestos incluyen eritromicina, la oxitetraciclina, y trimetoprim sulphamethoxazole. El MTT ensayo sobre la línea de células de insectos mostró que Wolbachia hecho una contribución significativa a la actividad metabólica dentro de las células, que podrían reducirse cuando fueron expuestos a la tetraciclina.

Conclusión

La O. Gutturosa adulto de sexo masculino de pantalla anti-drogas filarial actividad también es válida para la selección de antibióticos para la actividad anti-Wolbachia. De acuerdo con los resultados anteriores, la rifampicina y doxiciclina son eficaces, sin embargo, el más activo fue antibiótico minociclina. Wolbachia contribuido a la formación de MTT formazan MTT en el ensayo de viabilidad y, por tanto, no es exclusivamente una medida de la viabilidad y el gusano indica que contribuye Wolbachia Directamente a la actividad metabólica de los nematodos.

Antecedentes

El control de la filariasis humana causada por Brugia malayi, Wuchereria bancrofti y Onchocerca volvulus, que en la actualidad se basa en la comunidad de toda la distribución masiva de la ivermectina y el albendazol, ya sea individualmente o en combinación con dietilcarbamazina. Por desgracia, estos fármacos son principalmente microfilaricidal más que macrofilaricidal, lo que significa que se requiere un tratamiento repetido durante muchos años, y la posibilidad de que la resistencia a ellas se puede desarrollar es un motivo de preocupación [1 - 3]. Sin embargo, con la conciencia de que muchos filarial nematodos, incluidos los responsables de la mayor parte de la carga mundial de enfermedad humana filarial, están infectados con Wolbachia [4], ha dado un enfoque alternativo para el tratamiento y control de estos parásitos con antibióticos.

Wolbachia son bacterias intracelulares que tienen una relación con sus mutualistas nematodo hosts [4], y los estudios han demostrado que los antibióticos pueden eliminar las bacterias y en el resultado del gusano de retardo de crecimiento, infertilidad y reducción de la viabilidad [5 - 8], por el contrario, no nematodos infectados con Wolbachia No se vieron afectados por la exposición a antibióticos [5]. Los recientes ensayos de campo de los antibióticos contra la oncocercosis oxitetraciclina en el ganado [9] y de la doxiciclina en la oncocercosis humana [10 - 12] y W. Bancrofti infección [13, 14] han demostrado la validez de este enfoque. En todos los casos, el tratamiento dio lugar a una pronunciada reducción en la microfilaremia / microfilaridermia y una prolongada inhibición de la embriogénesis, pero, de manera significativa, de ocho semanas de curso de doxiciclina 200 mg diarios también demostró ser macrofilaricidal contra W. Bancrofti [13]. La administración de antibióticos también puede tener beneficios, además de esterilizar sus efectos y el asesinato de gusanos; Wolbachia se asocian con la patología de las infecciones filarial [15 - 17] y con reacciones adversas a la ivermectina dietilcarbamazina y [18, 19]. Un estudio reciente ha demostrado que un período de tres semanas de curso de la doxiciclina puede conducir a una sostenida amicrofilaraemia pero no da lugar a macrofilaricidal actividad [20].

Aunque los antibióticos tienen una actividad valiosa filarial contra nematodos, el largo regímenes de tratamiento que se requieren para presentar problemas logísticos de administración masiva de medicamentos (MDA). Otro obstáculo para la MDA es la contra-indicación de tetraciclinas en mujeres embarazadas y niños menores de ocho años. Por lo tanto, opciones alternativas de tratamiento, sino que se dirigen a Wolbachia sortear estos problemas sería ventajosa. Por más de 18 años, un in vitro por drogas a fin de encontrar posibles macrofilaricidal actividad ha utilizado varón adulto O. Gutturosa [21 - 23], la evaluación de la eficacia con que se están realizando por el gusano de la observación de la motilidad y la inhibición de la formación de MTT formazan [24, 25]. En el presente trabajo se han ampliado y desarrollado este sistema a largo plazo de ensayo, que nos ha permitido pantalla muchos de los antibióticos de uso común para macrofilaricidal actividad, tanto individualmente como en combinaciones. También hemos determinado la contribución de Wolbachia para el ensayo MTT.

Métodos
In vitro de las drogas de pantalla

Adulto de sexo masculino O. Gutturosa fueron disecados de la nuchal ligamento tejidos conectivos obtenidos de animales infectados naturalmente, en Kumasi, Ghana, que se describió anteriormente [6]. Ellos se mantuvieron individualmente en los pocillos de una placa de 24 pocillos que contiene 1,8 ml de Medio Esencial Mínimo con 10% de suero de ternera inactivado por calor y un mono de células renales (LLCMK2) alimentador capa [26] a 36,5 ° C con 5% CO 2 para De 24 a 48 horas hasta que la adición de las drogas. La mediana de todos los pozos incluidos los antibióticos penicilina (200 U / ml) y estreptomicina (200 μ g / ml), que no tienen actividad anti-Wolbachia [27], y la anti-micótica agente de la anfotericina B (50 μ g / ml). Las drogas fueron preparados como ha sido descrito previamente [6] en el medio y la concentración de cada fármaco fue probado contra seis a diez gusanos, mantiene que el anterior. Mediano (con o sin drogas) fue reemplazado cada 5 días. La prueba incluyó compuestos de una serie de prueba de antibióticos (Tablas 1, 2 y 3], tanto individualmente como en combinación. El amoscanate derivado CGP 6140 (Amocarzine) se utilizó como control positivo, ya que es macrofilaricidal contra Onchocerca parásitos [28], revisado por [29].

Worm viabilidad se midió los niveles de la motilidad y MTT colorimetría. Motilidad resultados fueron evaluados en un microscopio invertido en una escala de 0 (immotile) a 10 (máximo) [22] a intervalos regulares de hasta 40 días. La evaluación bioquímica del gusano de viabilidad se llevó a cabo por MTT / formazan colorimetría en el día 40. En este ensayo, el compuesto amarillo MTT [3 - (4,5-dimethylthiazol-2-il) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro] se reduce por la enzima mitocondrial succinate deshidrogenasa de los tejidos vivos para producir el azul precipitado MTT formazan [24 , 25]. Única intacta gusanos se colocaron en cada pocillo de una placa de 48 pocillos (Falcon, Reino Unido) que contiene 0,5 ml de 0,5 mg / ml de MTT (Sigma, Reino Unido) en buffer fosfato salino, y se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C. Los gusanos se transmitieron después a los pozos separados de una placa y 96, cada uno con 200 μ l de dimetil sulfóxido para solubilizar el formazan. Después de una hora, la placa se agita suavemente para dispersar a los de color uniforme y valor de absorbancia (densidad óptica) de la solución resultante formazan se determinó a 490 nm en un lector de ELISA. La inhibición de la formación de formazan gusano se correlaciona con el daño o la muerte. La motilidad y ensayo MTT resultados se expresaron como media en comparación con el porcentaje de reducción de los valores de control sin tratamiento en el día 40. Las comparaciones de los grupos de prueba a los controles no tratados en ambos niveles de la motilidad y MTT colorimetría en el día 40 se llevaron a cabo utilizando una muestra de 2 t-test.

Contribución de Wolbachia a la reducción de ensayo MTT

Desde la B. Malayi y Drosophila melanogaster Wolbachia contienen genes de los genomas succinate deshidrogenasa [30], la línea de células de mosquito C6/36 se utilizó para investigar la contribución de Wolbachia a la reducción de MTT ensayo. C6/36 se deriva de las larvas de Aedes albopictus y no es naturalmente infectados con Wolbachia. Sin embargo, puede ser fácilmente infectados con Wolbachia a partir de la línea de células Aa23, que se deriva de la A. Albopictus huevos y es naturalmente infectados con Wolbachia pipientis [31]. La viabilidad de las células se ve afectado ni por tanto la presencia o ausencia de la bacteria, ya que, a diferencia de los nematodos, los insectos no tienen una asociación con sus mutualistas Wolbachia. Para infectar las células C6/36, confluente medio de una cultura de la Aa23 células se recogieron, filtrada a través de una jeringa de 0,8 μ m filtro para eliminar cualquier conjunto de células de mosquito, y se coloca en un frasco confluente de células C6/36 de que el medio se había eliminado . El frasco se agita suavemente, a temperatura ambiente por 30 minutos antes de ser incubadas a 37 ° C en una atmósfera de 5% CO 2 en el aire. La infección de las células con la bacteria fue confirmada por IFAT [17]. En lo sucesivo, las células infectadas se denomina C6/36 Wp. C6/36 y C6/36 Wp crecían en el L-15 Leibovitz medio (Gibco) suplementado con 2 mM L-glutamina, un 1% no aminoácidos esenciales, el 2% caldo triptosa fosfato y 5% de suero de ternera fetal.

MTT reducción se comparó con C6/36 y C6/36 células Wp cada uno, con y sin tratamiento con tetraciclina (20 μ g / ml para un máximo de cuatro semanas, con medio cambiado cada 3 días), con al menos cuatro repeticiones de 250000 células en cada Grupo. Los medios de comunicación fueron retirados y se lavan las células y pildoradas, luego se añadió MTT para dar una concentración final de 0,5 mg / ml en buffer fosfato salino. Después de una incubación de 1 hora a 37 ° C con 5% de CO 2, las células fueron lavadas y pellets, y 200 μ l dimetil sulfóxido fue agregado a la liberación de reducción de azul formazan producto. La densidad óptica de las muestras fue medido a 490 nm y los resultados se expresaron como densidad óptica media (± SD). La prueba t de Student se utilizó para comparar las diferencias entre los dos grupos, con valores de P <0,05 se consideró significativo.

Resultados
In vitro de las drogas de pantalla

Las puntuaciones de la motilidad y el porcentaje de reducción de MTT inhibiciones de la prueba por parte de todos los compuestos se muestran en los cuadros 1, 2 y 3. El control positivo, CGP 6140, tuvo un muy rápido inicio de acción, con reducciones en el gusano de la motilidad incluso en el primer día del inicio del tratamiento. No gusano movimiento se observó al día 15, y por el día 40 hubo un 67,4 a 83,3 inhibición en la formación de formazan en comparación con los controles no tratados. En cambio, la puntuación media de la motilidad de los gusanos de control no tratados en cada experimento varió de 4,9 a 7,2 en el día 40 (Tablas 1, 2 y 3].

Varios medicamentos anti-micobacterianos se probaron. De éstos, la rifampicina (5 × 10 -5 M) fue la más efectiva, completamente la inhibición de la motilidad por día 40 (Tabla 1 y Fig. 1] o día 25 (Tabla 3]. Clofazimina (1,25 × 10 -5 M y 3,13 × 10 -6 M) poco a poco el gusano de la motilidad afectados a fin de que, a día 40, hubo un 100% y un 88,9% la reducción de la motilidad, y 77,4 y 53,3 inhibición de la reducción de MTT, con la mayor Y las concentraciones más bajas, respectivamente (Tabla 3 y Fig. 4]. Etambutol (5 × 10 -5 M) fue menos eficaz, dando el 44,9% y el 73% la reducción de la motilidad y MTT formazan formación, respectivamente (Cuadro 1 y Fig. 5]. Sin embargo, los otros agentes con actividad frente a Mycobacterium especies mostró limitado (pirazinamida, isoniazida) o no (dapsona), en contra de la actividad de los gusanos (Tablas 1 y 3]. También, la adición de la isoniazida (5 × 10 -5 M) a la rifampicina (5 × 10 -5 M) no mejoró la eficacia de este último (Tabla 3].

Doxiciclina es eficaz (100% de reducción de la motilidad de día 25, el 93% de inhibición de la formación de formazan en día 40) a una concentración de 5 × 10 -5 M, pero no mostraron ninguna actividad en 1,25 × 10 -5 M (Fig. 3] . Sin embargo, la minociclina es filaricidal en estas dos concentraciones (Fig. 2]. Intermedio actividad fue mostrada por norfloxacina, ciprofloxacina, vancomicina y gentamicina (todos en una concentración de 5 × 10 -5 M). Las drogas que no tienen un efecto filaricidal a 5 × 10 -5 M incluyen eritromicina, la oxitetraciclina, y trimetoprim sulphamethoxazole (estos dos ya sea solo o en combinación).

Dos compuestos, triclosan y cerulenin, son tóxicas para el riñón mono capa de células de alimentación, por lo que no fue posible concluir si tuvo un efecto anti-Onchocerca, ya que una capa de células viables es fundamental para la supervivencia a largo plazo de los gusanos.

Contribución de Wolbachia a la reducción de ensayo MTT

C6/36 células con y sin W. Pipientis infección fueron incubadas en medio o medio más tetraciclina durante dos o cuatro semanas antes de ser analizados por el ensayo de reducción de MTT. Este ensayo demostró que la infección con el Wolbachia hizo extra contribuyen a la actividad metabólica en las células, ya que C6/36 Wp ha significativamente mayor que las lecturas de absorbancia C6/36 (P = 0,017, después de dos semanas de incubación, P = 0,000, después de cuatro semanas de incubación, Fig. 6]. Sin embargo, en C6/36 Wp tratados con tetraciclina durante dos a cuatro semanas la absorbancia no es distinto del C6/36 con tetraciclina (P = 0,269 en dos semanas; P = 0,475 en cuatro semanas). Al tiempo ni puntos hizo C6/36 no infectadas tratadas con tetraciclina muestran una diferencia significativa de los no tratados (P = 0,958 en dos semanas; P = 0,543 en cuatro semanas, Fig. 6], lo que indica que la tetraciclina en sí no tuvo ningún efecto en La reducción de la actividad metabólica.

Discusión

Los resultados aquí presentados confirman que los hombres O.gutturosa proporcionar una adecuada in vitro para la pantalla de acción lenta con antibióticos macrofilaricidal actividad. Hombre O.gutturosa son más pequeños que los hombres O.volvulus pero contienen un casi idéntico Wolbachia / nematodo ratio (HF McGarry y MJ Taylor, la observación no publicados) lo que indica que son un modelo adecuado para la oncocercosis humana.

La paulatina reducción de la motilidad (como con clofazimina) o una demora, hasta que se observaron efectos (rifampcin, doxiciclina, minociclina) es coherente con actividad frente a la endosimbiontes, en contraste con la rápida y directa sobre los efectos del gusano de la viabilidad del control positivo, Amocarzine. Curiosamente, con rifampcin, doxiciclina, la minociclina y etambutol, la más rápida disminución de la motilidad del gusano produjeron entre 15 y 20 días de tratamiento. Este período de tratamiento, puede ser suficiente para inhibir Wolbachia dependientes de los procesos, tales como la inhibición de la síntesis de proteínas (que es el modo de acción de las tetraciclinas), con el consiguiente deterioro de la salud antes de nematodos un descenso en el número de bacterias es observable. Como tal, este O. Gutturosa sistema es probable que sea más sensible que uno que utiliza Wolbachia-mosquito infectado líneas celulares, que se basa en la observación directa de la presencia o ausencia de bacterias [27, 32].

Actualmente, la doxiciclina (200 mg) administrado diariamente durante tres semanas es el más breve régimen eficaz que se ha intentado en contra de una infección humana filarial; cuando estándar seguida de quimioterapia anti-filarial, este tratamiento dio lugar a prolongadas reducciones de microfilaremia y en números de la Wolbachia Microfilarias, pero no fue macrofilaricidal [20] y es similar a la de tiempo tras el cual se observan los efectos in vitro.

Rifampicina ha sido previamente demostrado ser muy eficaz contra la Wolbachia [6, 27, 32, 33], que se confirmó en este ensayo in vitro antifilárico. Rifampicina interfiere con la síntesis de ácidos nucleicos mediante la combinación y con la inhibición de la ARN-polimerasa de bacterias y es bactericida. La lucha contra la lepra agente clofazimina también demostraron buena actividad frente a O. Gutturosa, y también es bactericida. Anti-tuberculosis y la lepra-terapias pueden tener beneficios a nivel de la población mediante la reducción de la prevalencia de la filariasis [34]. Sin embargo, el probado otras drogas que se usan contra Mycobacterium especies (etambutol, dapsona, pirazinamida, isoniazida) mostró poca actividad anti-Onchocerca.

La doxiciclina es la tetraciclina filaricidal este fármaco en la pantalla, lo que confirma hallazgos anteriores que tiene efectos anti-Wolbachia [27, 33, 35]. Esta droga también ha sido utilizado en humanos filarial infecciones, en la que ha dado lugar a una prolongada pérdida de microfilarias y la falta de embriogénesis [10, 11, 14], y recientemente se ha mostrado en contra de que se macrofilaricidal W. Bancrofti [13]. En el presente trabajo la minociclina es incluso más efectiva que la doxiciclina y ser objeto de nuevas investigaciones in vivo. Este resultado coincide con nuestro trabajo no publicado (S. Townson) que la minociclina es más activa que la doxiciclina contra O. Lienalis microfilarias en ratones. Minociclina tiene la ventaja de inducir más de doxiciclina menos fototoxicidad. Sin embargo, la oxitetraciclina no mostraron anti-Wolbachia actividad, en contraste con los informes anteriores [6, 9, 32]; no está claro por qué hay conclusiones contradictorias. La falta de actividad de otros compuestos (eritromicina, trimetoprim y sulphamethoxazole) es coherente con resultados anteriores [27, 36].

Filarial nematodos cultivadas in vitro a menudo sucumben a tratamientos farmacológicos más fácilmente de lo que lo hacemos en vivo. El sistema aquí descrito proporciona una relativamente fácil y de bajo costo para llevar a cabo una forma primaria o secundaria para la pantalla de compuestos anti-filarial / Wolbachia actividad, que debería continuarse con experimentos in vivo. Los antibióticos son de acción lenta filarial contra nematodos, como se ha visto en el presente estudio y en las pruebas de campo (por ejemplo, [12, 13]); una ventaja de los varones O. Gutturosa cultura sistema es que puede ser mantenido durante al menos 40 días. En el presente estudio los efectos de los compuestos no ha sido directamente relacionada con su actividad contra la Wolbachia y es posible que también tienen directa contra la actividad nematodal. Los estudios sobre la dinámica de la pérdida de las bacterias de los gusanos se están realizando utilizando la reacción en cadena de polimerasa cuantitativa y / o immunohistology en el sistema de selección.

La presencia de Wolbachia hecho una contribución significativa a la MTT de ensayo en células C6/36 como se predijo a partir de la presencia de deshidrogenasa succinate determinada por anotación genómica. Así reducción parcial en la formación en MTT formazan ensayos podría refleja ni la pérdida de las bacterias y la retención de gusano de viabilidad o viceversa. En caso de que in vitro de pantalla de actividad específica contra la bacteria o bien el gusano se necesitaría entonces alternativa marcadores de viabilidad puede ser necesario elaborar [37].

Conclusión

Este estudio ha demostrado in vitro que la pantalla de macrofilaricidal actividad, que utiliza la cultura de los hombres O. Gutturosa, puede ser ampliado con éxito y también es válida para la detección de compuestos con potencial antibiótico contra la Wolbachia / filarial actividad. Este sistema puede ser utilizado para el cribado a largo plazo, en este caso, durante 40 días. Rifampicina y doxiciclina son dos de los antibióticos más activos a prueba en esta pantalla, de acuerdo con resultados anteriores. Sin embargo, un nuevo hallazgo fue que la minociclina es más rápida y eficaz que cualquiera de los dos por completo de estos compuestos. También se constató que Wolbachia contribuir a la formación de MTT formazan, que se utiliza como un marcador de viabilidad filarial gusano, lo que sugiere que las bacterias contribuyen directamente a la actividad metabólica del nematodo, y que puede ser necesario volver a evaluar alternativas y de los indicadores de gusano o bacteriana Viabilidad.

Abreviaturas

MTT, 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-il) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro; MDA, de administración masiva de medicamentos.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto.

Contribuciones de los autores

STo diseñado el antibiótico pantalla experimentos, analizar los resultados y asesoramiento sobre la preparación del manuscrito. STo y STa realizó el antibiótico pantalla experimentos. HFM analizados los resultados, el análisis estadístico realizado y preparado el manuscrito. GLE C6/36 MTT realizado el análisis. MJT diseñó el ensayo MTT C6/36 experimentos, analizar los resultados y asesoramiento sobre la preparación del manuscrito.

Agradecimientos

Esta investigación recibió el apoyo financiero del UNICEF / PNUD / Banco Mundial / OMS Programa Especial para Investigación y Capacitación en Enfermedades Tropicales (TDR). MJT está financiado por un cuadro de Becas en Ciencias Biomédicas Básicas concedido por la Wellcome Trust.